液相色谱法的使用测试课程

高效液相色谱法

HighPerformanceLiquidChromatography,HPLC一、概述

气相色谱只适合分析较易挥发、且化学性质稳定的有机化合物，而HPLC则适合于分析那些用气相色谱难以分析的物质，如挥发性差、极性强、具有生物活性、热稳定性差的物质。

通常将液相色谱法按分离机理分成吸附色谱法、分配色谱法、离子色谱法和凝胶色谱法四大类。其实，有些液相色谱方法并不能简单地归于这四类。类型吸附色谱吸附能，氢键异构体分离、族分离，制备分配色谱疏水分配作用各种有机化合物的分离、分析与制备排阻色谱溶质分子大小高分子分离，分子量及其分布的测定离子交换色谱库仑力无机离子、有机离子分析手性色谱立体效应手性异构体分离，药物纯化

主要分离机理

主要分析对象或应用领域亲和色谱生化特异亲和力蛋白、酶、抗体分离，生物和医药分析高压：载液压力150~300kg/cm2高速：载液流速1~10ml/min高灵敏：Uv(10-9g)、Fl(10-11g)高效：柱效106、3万塔板数/m特点：高压、高效、高速高沸点、热不稳定有机及生化试样的高效分离分析方法。二、高效液相色谱仪检测器高压输液泵

高压输液泵

输液系统进样系统分离系统检测系统数据处理系统贮液器高压泵梯度洗提装置馏份收集器记录仪检测器压力表HPLC仪流程图1、输液系统(1)高压输液泵

高压输液泵在线脱气装置高压输液泵是液相色谱仪的关键部件，其作用是将流动相以稳定的流速或压力输送到色谱系统。对于带在线脱气装置的色谱仪，流动相先经过脱气装置再输送到色谱柱。输液泵的稳定性直接关系到分析结果的重复性和准确性。

基本要求：流量准确可调。对于一般的分析，流动相的流速在0.5-2mL/min，输液泵的最大流量一般为5-10mL/min。输液泵的流量控制精度通常要求小于±0.5%。输液泵必须能精确地调节流动相流量，这可以通过电子线路调节电机转速或冲程长短来实现。流量的测定通常采用热脉冲流量计。

主要部件之一，压力：150～350×105

Pa。为了获得高柱效而使用粒度很小的固定相（<10μm），液体的流动相高速通过时，将产生很高的压力，因此高压、高速是高效液相色谱的特点之一。应具有压力平稳、脉冲小、流量稳定可调、耐腐蚀等特性输液泵按输出液恒定的因素分恒压泵和恒流泵。对液相色谱分析而言，输液泵的流量稳定性更为重要，因为流速的变化会引起溶质的保留值的变化，而保留值是色谱定性的主要依据之一。因此，恒流泵的应用更广泛。输液泵按工作方式分为气动泵和机械泵两大类。机械泵中又有螺旋传动注射泵、单活塞往复泵、双活塞往复泵和往复式隔膜泵。几种高压输液泵的性能比较

名称

恒流或恒压

脉冲

更换流动相

梯度洗脱

再循环

价格

气动放大泵恒压无不方便需两台泵不可高螺旋传动注射泵恒流无不方便需两台泵不可中等单活塞往复泵恒流有方便可可较低双活塞往复泵恒流小方便可可高隔膜往复泵恒流有方便可可中等(2)在线脱气装置

在线脱气装置用于脱去流动相中的溶解气体，流动相先经过脱气装置再输送到色谱柱。

流动相溶液溶解有氧气或混入了空气而形成气泡。气泡进入检测器后会在色谱图上出现尖锐的噪音峰。小气泡慢慢聚集后会变成大气泡，大气泡进入流路或色谱柱中会使流动相的流速变慢或出现流速不稳定，致使基线起伏。气泡一旦进入色谱柱，排出很费时间。在荧光检测中,溶解氧还会使荧光淬灭。溶解气体还可能引起某些样品的氧化或使溶液pH值发生变化。

脱气方法

液相色谱流动相脱气使用较多的是离线超声波振荡脱气、在线惰性气体鼓泡吹扫脱气和在线真空脱气。

超声波振荡脱气：将配制好的流动相连容器放入超声水槽中脱气10-20min。这种方法比较简便。惰性气体鼓泡吹扫脱气：将气源（钢瓶）中的气体（氦气）缓慢而均匀地通入储液罐中的流动相中，氦气分子将其它气体分子置换和顶替出去，而它本身在溶剂中的溶解度又很小，微量氦气所形成的小气泡对检测无影响。真空脱气装置：将流动相通过一段由多孔性合成树脂膜制造的输液管，该输液管外有真空容器，真空泵工作时，膜外侧被减压，分子量小的氧气、氮气、二氧化碳就会从膜内进入膜外而被脱除。一般的真空脱气装置有多条流路，可同时对多个溶液进行脱气。（3）梯度洗脱装置

通过两个输液泵流速的变化，改变流动相的洗脱能力，其作用与气相色谱的程序升温类似。ABABCC在进行多成分的复杂样品的分离时，经常会碰到前面的一些成分分离不完全，而后面的一些成分分离度太大，且出峰很晚和峰型较差。为了使保留值相差很大的多种成分在合理的时间内全部洗脱并达到相互分离，往往要用到梯度洗脱技术。

在液相色谱中流速（压力）梯度和温度梯度效果不大，而且还会带来一些不利影响，因此，液相色谱中通常所说的梯度洗脱是指流动相梯度，即在分离过程中改变流动相的组成或浓度。线性梯度：在某一段时间内连续而均匀增加流动相强度。阶梯梯度：直接从某一低强度的流动相改变为另一较高强度的流动相。梯度洗脱装置是解决溶液的混合问题。主要部件除高压泵外，还有混合器和梯度程序控制器。根据溶液混合的方式可以将梯度洗脱分为高压梯度和低压梯度。高压梯度：

一般只用于二元梯度，即用两个高压泵分别按设定的比例输送两种溶液至混合器，混合器是在泵之后，即两种溶液是在高压状态下进行混合的。高压梯度系统的主要优点是，只要通过梯度程序控制器控制每台泵的输出，就能获得任意形式的梯度曲线，而且精度很高，易于实现自动化控制。缺点是使用了两台高压输液泵，使仪器价格变得更昂贵，故障率也相对较高，而且只能实现二元梯度操作。

低压梯度：只需一个高压泵，与等度洗脱输液系统相比，就是在泵前安装了一个比例阀，混合就在比例阀中完成。因为比例阀是在泵之前，所以是在常压（低压）下混合，在常压下混合往往容易形成气泡，所以低压梯度通常配置在线脱气装置。如四元梯度系统：来自于四种溶液瓶的四根输液管分别与真空脱气装置的四条流路相接，经脱气后的四种溶液进入比例阀，混合后从一根输出管进入泵体。多元梯度泵的流路可以部分空置。

2、进样系统

通常采用六通伐进样：色谱柱色谱柱泵泵12进样进样器是将样品溶液准确送入色谱柱的装置，分手动和自动两种方式。

进样器要求密封性好，死体积小，重复性好，进样时引起色谱系统的压力和流量波动要很小。现在的液相色谱仪所采用的手动进样器几乎都是耐高压、重复性好和操作方便的六通阀进样器，其原理与气相色谱中所介绍的相同。3、色谱柱Normalcolumn 5-um、4.6-umNarrowborecolumn 1-3umMicrocolumn <1um

色谱柱是实现分离的核心部件，要求柱效高、柱容量大和性能稳定。柱性能与柱结构、填料特性、填充质量和使用条件有关。直型，柱长10~100cm。分析柱内径2~5mm,制备柱6~10mm。色谱填料：经过制备处理后，用于填充色谱柱的物质颗粒，通常是5-10μm粒径的球形颗粒。色谱柱管：内部抛光的不锈钢管。典型的液相色谱分析柱尺寸是内径4.6mm，长250mm。色谱填料是由基质和功能层两部分构成。

基质：

又常称作载体或担体，通常制备成数微米至数十微米粒径的球形颗粒，它具有一定的刚性，能承受一定的压力，对分离不起明显的作用，只是作为功能基团的载体。常用来作基质的有硅胶和有机高分子聚合物微球。

功能层：是通过化学或物理的方法固定在基质表面的、对样品分子的保留起实质作用的有机分子或功能团。如硅胶基质的冠醚大分子固定相，功能层冠醚分子吸附或键合在硅胶基质的表面。填料的物理结构：

分为微孔型（或凝胶型）、大孔型（全多孔型）、薄壳型和表面多孔型四种类型。4、检测器用来连续监测经色谱柱分离后的流出物的组成和含量变化的装置。 目前最常用的检测器主要有：紫外-可见检测器荧光检测器电化学检测器示差折光检测器蒸发光散射检测器质谱检测器检测器检测下限/(g/ml)

线性范围

选择性

梯度淋洗

主要特点

紫外-可见光10-10103-104有可对流速和温度变化敏感；池体积可制作得很小；对溶质的响应变化大。

荧光10-12-10-11103有可选择性和灵敏度高；易受背景荧光、消光、温度、pH和溶剂的影响。化学发光

10-13-10-12103有困难灵敏度高；发光试剂受限制；易受流动相组成和脉动的影响。

电导

10-8103-104有不可是离子性物质的通用检测器；受温度和流速影响；不能用于有机溶剂体系。电化学

10-10104有困难选择性高；易受流动相pH值和杂质的影响；稳定性较差。

HPLC中常见检测器的基本特性

蒸发光散射

10-9

无可可检测所有物质。示差折光10-7104无不可可检测所有物质；不适合微量分析；对温度变化敏感质谱10-10无可主要用于定性和半定量。原子吸收光谱10-10-10-13有可选择性高。等离子体发射光谱

10-8-10-12有可可进行多元素同时检测。火焰离子化10-13-10-12104有可柱外峰展宽。

应用最广，对大部分有机化合物有响应。特点：

灵敏度高；线形范围宽；流通池可以很小（1mm×10mm，容积8μL）；对流动相的流速和温度变化不敏感；波长可选，易于操作；可用于梯度洗脱。

（1）紫外-可见检测器基于Lambert-Beer定律，即被测组分对紫外光或可见光具有吸收，且吸收强度与组分浓度成正比。

很多有机分子都具紫外或可见光吸收基团，有较强的紫外或可见光吸收能力，因此UV-VIS检测器既有较高的灵敏度，也有很广泛的应用范围。由于UV-VIS对环境温度、流速、流动相组成等的变化不是很敏感，所以还能用于梯度淋洗。

用UV-VIS检测时，为了得到高的灵敏度，常选择被测物质能产生最大吸收的波长作检测波长，但为了选择性或其它目的也可适当牺牲灵敏度而选择吸收稍弱的波长，另外，应尽可能选择在检测波长下没有背景吸收的流动相。直接紫外检测：所使用的流动相为在检测波长下无紫外吸收的溶剂，检测器直接测定被测组分的紫外吸收强度。多数情况下采用直接紫外检测。

间接紫外检测：使用具有紫外吸收的溶液作流动相，间接检测无紫外吸收的组分。在离子色谱中使用较多，如以具有紫外吸收的邻苯二甲酸氢钾溶液作阴离子分离的流动相，当无紫外吸收的无机阴离子被洗脱到流动相中时，会使流动相的紫外吸收减小。

柱后衍生化光度检测：

对于那些可以与显色剂反应生成有色配合物的组分（过渡金属离子、氨基酸等），可以在组分从色谱柱中洗脱出来之后与合适的显色剂反应，在可见光区检测生成的有色配合物。

二极管阵列检测器（diode-arraydetector,DAD）：以光电二极管阵列（或CCD阵列，硅靶摄像管等）作为检测元件的UV-VIS检测器。它可构成多通道并行工作，同时检测由光栅分光，再入射到阵列式接受器上的全部波长的信号，然后，对二极管阵列快速扫描采集数据，得到的是时间、光强度和波长的三维谱图。普通UV-VIS检测器是先用单色器分光，只让特定波长的光进入流动池。二极管阵列UV-VIS检测器是先让所有波长的光都通过流动池，然后通过一系列分光技术，使所有波长的光在接受器上被检测。紫外检测器的重要进展；光电二极管阵列检测器：1024个二极管阵列，各检测特定波长，计算机快速处理，三维立体谱图。光电二极管阵列检测器光源检测室光栅二极管阵列检测器（2）荧光检测器原理：

许多有机化合物，特别是芳香族化合物、生化物质，如有机胺、维生素、激素、酶等，被一定强度和波长的紫外光照射后，发射出较激发光波长要长的荧光。荧光强度与激发光强度、量子效率和样品浓度成正比。有的有机化合物虽然本身不产生荧光，但可以与发荧光物质反应衍生化后检测。

特点：有非常高的灵敏度和良好的选择性，灵敏度要比紫外检测法高23个数量级，特别适合于药物和生物化学样品的分析。对多环芳烃，维生素B、黄曲霉素、卟啉类化合物、农药、药物、氨基酸、甾类化合物等有响应；（3）电化学检测器（电导检测器conductivitydetector,CD）电导仪电极电极

原理：基于离子性物质的溶液具有导电性，其电导率与离子的性质和浓度相关。电导检测器是离子色谱中必备的检测器。

电导检测器的构成：由电导池、测量电导率所需的电子线路、变换灵敏度的装置和数字显示仪等几部分组成，电导池是其核心。

电导池的结构：

检测体积可达到微升甚至纳升级。其基本结构是在柱流出液中放置两根电极，然后通过适当的电子线路测量溶液的电导。图8-17是一种简单结构的电导池。

电导检测器工作原理：

电导池工作时，向电导池的两个电极施加电压，溶液中的阴离子向阳极移动，阳离子向阴极移动。在电解质溶液中的离子数目和离子的移动速率决定溶液的电阻大小，离子的迁移率或单位电场中离子的速率取决于离子的电荷及其大小、介质类型、溶液温度和离子浓度。离子的迁移速率取决于施加电压的大小。所施加的电压既可以是直流电压，也可以是正弦波或方波电压。当施加的有效电位确定后，即可测量出电路中的电流值，即能测出电导值。

除紫外检测器之外应用最多的检测器；可连续检测参比池和样品池中流动相之间的折光指数差值。差值与浓度呈正比；

通用型检测器（每种物质具有不同的折光指数）；灵敏度低、对温度敏感、不能用于梯度洗脱；

偏转式、反射式和干涉型三种；（4）示差折光检测器（differentialrefractometers,RI）

原理：基于样品组分的折射率与流动相溶剂折射率有差异，当组分洗脱出来时，会引起流动相折射率的变化，这种变化与样品组分的浓度成正比。示差折光检测法也称折射指数检测法。绝大多数物质的折射率与流动相都有差异，所以RI是一种通用的检测方法。虽然其灵敏度比其他检测方法相比要低1-3个数量级。对于无紫外吸收的有机物（如高分子化合物、糖类、脂肪烷烃）是比较适合的。在凝胶色谱中是必备检测器，在制备色谱中也经常使用。（5）蒸发光散射检测器（evaporativelight-scatteringdetector,ELSD）

ELSD是基于溶质的光散射性质的检测器。由雾化器、加热漂移管（溶剂蒸发室）、激光光源和光检测器（光电转换器）等部件构成。色谱柱流出液导入雾化器，被载气（压缩空气或氮气）雾化成微细液滴，液滴通过加热漂移管时，流动相中的溶剂被蒸发掉，只留下溶质，激光束照在溶质颗粒上产生光散射，光收集器收集散射光并通过光电倍增管转变成电信号因为散射光强只与溶质颗粒大小和数量有关，而与溶质本身的物理和化学性质无关，所以ELSD属通用型和质量型检测器。适合于无紫外吸收、无电活性和不发荧光的样品的检测。其灵敏度与载气流速、汽化室温度和激光光源强度等参数有关。与示差折光检测器相比，它的基线漂移不受温度影响，信噪比高，也可用于梯度洗脱。

固定相：固体吸附剂为，如硅胶、氧化铝等，较常使用的是5～10μm的硅胶吸附剂；

流动相：各种不同极性的一元或多元溶剂。

基本原理：组分在固定相吸附剂上的吸附与解吸。

适用于分离相对分子质量中等的油溶性试样，对具有官能团的化合物和异构体有较高选择性；

缺点：非线形等温吸附常引起峰的拖尾三、高效液相色谱分离模式（一）液-固吸附色谱

liquid-solidadsorptionchromatography

固定相与流动相均为液体（互不相溶）；

基本原理：组分在固定相和流动相上的分配；

流动相：对于亲水性固定液，采用疏水性流动相，即流动相的极性小于固定液的极性（正相

normalphase），反之，流动相的极性大于固定液的极性（反相

reversephase）。正相与反相的出峰顺序相反；

固定相：早期涂渍固定液，固定液流失，较少采用；

化学键合固定相：（将各种不同基团通过化学反应键合到硅胶（担体）表面的游离羟基上。C-18柱（反相柱）。（二）液-液分配色谱

liquid-liquidpartitionchromatography

液-液分配色谱固定相的液体往往容易溶解到流动相中去，所以重现性很差。

后来发展起来的键合固定相以化学键合的方法将功能分子结合到惰性载体上，固定相不会溶解到流动相中。键合固定相OHOHOHOOO+C18H37SiCl3SiC18H37非极性键合固定相：

键合在载体表面的功能分子是烷基、苯基等非极性有机分子。如最常用的ODS（OctaDecyltrichloroSilane）柱或C18柱就是最典型的代表，其极性很小。极性键合固定相：

键合在载体表面的功能分子是具有二醇基、醚基、氰基、氨基等极性基团的有机分子。正相HPLC（normalphaseHPLC）：

是由极性固定相和非极性（或弱极性）流动相所组成的HPLC体系。其代表性的固定相是改性硅胶、氰基柱等，代表性的流动相是正己烷。吸附色谱也属正相HPLC。反相HPLC（reversedphaseHPLC）：

由非极性固定相和极性流动相所组成的液相色谱体系，与正相HPLC体系正好相反。其代表性的固定相是十八烷基键合硅胶(ODS柱），代表性的流动相是甲醇和乙腈。是当今液相色谱的最主要分离模式。

固定相：阴离子离子交换树脂或阳离子离子交换树脂；

流动相：阴离子离子交换树脂作固定相，采用酸性水溶液；阳离子离子交换树脂作固定相，采用碱性水溶液；

基本原理：组分在固定相上发生的反复离子交换反应；组分与离子交换剂之间亲和力的大小与离子半径、电荷、存在形式等有关。亲和力大，保留时间长；

阳离子交换：R—SO3H+M+=R—SO3M+H+

阴离子交换：R—NR4OH+X-=R—NR4X+OH-

应用：离子及可离解的化合物，氨基酸、核酸等。（三）离子交换色谱

ion-exchangechromatographyIEC使用表面有离子交换基团的离子交换剂作为固定相。带负电荷的交换基团（如磺酸基和羧酸基）可以用于阳离子的分离，带正电荷的交换基团（如季胺盐）可以用于阴离子的分离。不同离子与交换基的作用力大小不同，在树脂中的保留时间长短不同，从而被相互分离。SO3H+M+

SO3M+H+

原理：将一种（或多种）与溶质离子电荷相反的离子（对离子或反离子）加到流动相中使其与溶质离子结合形成疏水性离子对化合物，使其能够在两相之间进行分配；

阴离子分离：常采用烷基铵类，如氢氧化四丁基铵或氢氧化十六烷基三甲铵作为对离子；

阳离子分离：常采用烷基磺酸类，如己烷磺酸钠作为对离子；

反相离子对色谱：非极性的疏水固定相(C-18柱)，含有对离子Y+的甲醇-水或乙腈-水作为流动相，试样离子X-进入流动相后，生成疏水性离子对Y+X-后；在两相间分配。（四）离子对色谱

ionpairchromatography抑制柱离子色谱的原理：以阴离子分析为例：分析柱反应：R—Cl+NaOH R—OH+NaCl抑制柱反应：R—H+NaCl R—Na+HClR—H+NaOH R—Na+H2O（五）排阻色谱size-exclusionchromatography（又称凝胶色谱和分子筛色谱）原理：

以多孔性物质作固定相，样品分子受固定相孔径大小的影响而达到分离的一种液相色谱分离模式。大分子全排出 VR=V0小分子全进入 VR=V0+VS中分子部分进入 VR=V0+KVS

固定相：凝胶(具有一定大小孔隙分布)；

原理：按分子大小分离。小分子可以扩散到凝胶空隙，由其中通过，出峰最慢；中等分子只能通过部分凝胶空隙，中速通过；而大分子被排斥在外，出峰最快；溶剂分子小，故在最后出峰。全部在死体积前出峰；可对相对分子质量在100-105范围内的化合物按质量分离

1.液-液分配及离子对分离固定相（1）全多孔型担体由氧化硅、氧化铝、硅藻土等制成的多孔球体；早期采用100μm的大颗粒，表面涂渍固定液，性能不佳已不多见；现采用10μm以下的小颗粒，化学键合制备柱填料；（2）表面多孔型担体（薄壳型微珠担体）30～40μm的玻璃微球，表面附着一层厚度为1～2μm的多孔硅胶。表面积小，柱容量底；四、液相色谱固定相

stationaryphasesofLC

化学键合固定相:目前应用最广、性能最佳的固定相；a.硅氧碳键型：≡Si—O—Cb.硅氧硅碳键型：≡Si—O—Si—C

稳定，耐水、耐光、耐有机溶剂，应用最广c.硅碳键型：≡Si—Cd.硅氮键型：≡Si—N（3）化学键合固定相传质快，表面无深凹陷，比一般液体固定相传质快；寿命长，化学键合，无固定液流失，耐流动相冲击；耐水、耐光、耐有机溶剂，稳定；选择性好，可键合不同官能团，提高选择性；有利于梯度洗脱；存在着双重分离机制：(键合基团的覆盖率决定分离机理)高覆盖率：分配为主；低覆盖率：吸附为主；

化学键合固定相的特点

种类：硅胶、氧化铝、分子筛、聚酰胺等；结构类型：全多孔型和薄壳型；粒度：5～10μm；

2.液-固吸附分离固定相

结构类别：（1）薄壳型离子交换树脂薄壳玻璃珠为担体，表面涂约1%的离子交换树脂；（2）离子交换键合固定相薄壳键合型；微粒硅胶键合型（键合离子交换基团）

树脂类别：（1）阳离子交换树脂（强酸性、弱酸性）（2）阴离子交换树脂（强碱性、弱碱性）3.离子交换色谱分离固定相（1）软质凝胶

葡聚糖凝胶、琼脂凝胶等。多孔网状结构；水为流动相。适用于常压排阻分离。（2）半硬质凝胶

苯乙烯-二乙烯基苯交联共聚物，有机凝胶；非极性有机溶剂为流动相，不能用丙酮、乙醇等极性溶剂（3）硬质凝胶

多孔硅胶、多孔玻珠等；化学稳定性、热稳定性好、机械强度大，流动相性质影响小，可在较高流速下使用。可控孔径玻璃微球，具有恒定孔径和窄粒度分布。4.空间排阻分离固定相1.流动相特性

液相色谱的流动相又称为：淋洗液，洗脱剂。流动相组成改变，极性改变，可显著改变组分分离状况；

亲水性固定液常采用疏水性流动相，即流动相的极性小于固定相的极性，称为正相液液色谱法，极性柱也称正相柱。

若流动相的极性大于固定液的极性，则称为反相液液色谱，非极性柱也称为反相柱。组分在两种类型分离柱上的出峰顺序相反。五、液相色谱的流动相

mobilephasesofLC

按流动相组成分：单组分和多组分；按极性分：极性、弱极性、非极性；按使用方式分：固定组成淋洗和梯度淋洗。

常用溶剂：己烷、四氯化碳、甲苯、乙酸乙酯、乙醇、乙腈、水。采用二元或多元组合溶剂作为流动相可以灵活调节流动相的极性或增加选择性，以改进分离或调整出峰时间。2.流动相类别

在选择溶剂时，溶剂的极性是选择的重要依据。

采用正相液-液分配分离时：首先选择中等极性溶剂，若组分的保留时间太短，降低溶剂极性，反之增加。也可在低极性溶剂中，逐渐增加其中的极性溶剂，使保留时间缩短。常用溶剂的极性顺序：

水(最大)>甲酰胺>乙腈>甲醇>乙醇>丙醇>丙酮>二氧六环>四氢呋喃>甲乙酮>正丁醇>乙酸乙酯>乙醚>异丙醚>二氯甲烷>氯仿>溴乙烷>苯>四氯化碳>二硫化碳>环己烷>己烷>煤油(最小)3.流动相选择尽量使用高纯度试剂作流动相，防止微量杂质长期累积损坏色谱柱和使检测器噪声增加。避免流动相与固定相发生作用而使柱效下降或损坏柱子。如使固定液溶解流失；酸性溶剂破坏氧化铝固定相等。试样在流动相中应有适宜的溶解度，防止产生沉淀并在柱中沉积。流动相同时还应满足检测器的要求。当使用紫外检测器时，流动相不应有紫外吸收。4.选择流动相时应注意的几个问题1.影响分离的因素与提高柱效的途径

在高效液相色谱中,液体的扩散系数仅为气体的万分之一，则速率方程中的分子扩散项B/U较小，可以忽略不计，即：H=A+Cu

故液相色谱H-u曲线与气相色谱的形状不同，如图所示。六、影响分离的因素

factorsinfluencedseparation液体的黏度比气体大一百倍，密度为气体的一千倍，故降低传质阻力是提高柱效主要途径。由速率方程，降低固定相粒度可提高柱效。液相色谱中，不可能通过增加柱温来改善传质。恒温

改变淋洗液组成、极性是改善分离的最直接的因素。

流速大于0.5cm/s时,H～u曲线是一段斜率不大的直线。降低流速，柱效提高不是很大。但在实际操作中，流量仍是一个调整分离度和出峰时间的重要可选择参数。

3.固定相及分离柱

气相色谱中的固定液原则上都可以用于液相色谱，其选用原则与气相色谱一样。但在高效液相色谱中，分离柱的制备是一项技术要求非常高的工作，一般很少自行制备。2.流速

稠环芳烃多为致癌物质

固定相：十八烷基硅烷化键合相流动相：20%甲醇-水～100%甲醇线性梯度淋洗，2%/min流速：1mL/min柱温：50ºC柱压：70104Pa

检测器：紫外检测器2.稠环芳烃的分析七、分离类型选择

choiceofseparationtypes环境中有机氯农药残留量分析

固定相：薄壳型硅胶(37～50m)流动相：正己烷流速：1.5mL/min色谱柱：50cm2.5mm(内径)检测器：差示折光检测器

可对水果、蔬菜中的农药残留量进行分析。阴离子分析:

双柱；薄壳型阴离子交换树脂分离柱(3×250mm),流动相：0.003mol·L-1NaHCO3/0.0024mol·L-1Na2CO3，流量138mL/hr。七种阴离子在20分钟内基本上得到完全分离，各组分含量在3～50ppm。离子色谱的应用八、制备型液相色谱

preparativeliquidchromatography制备型高效液相色谱系统主要应用在植化、合成、制药、生物及生化等领域的产品的提取及纯化工作中。在不同的工作领域中，组份的提取和纯化量的差异是很大的。在生物技术领域中，酶的分离是微克级；在植化和合成化学领域中，为了鉴别未知成份并进行结构测定，需要得到一至若干毫克的纯品；在药品和医药学测试中，需要克级的标准品和对照品；在当今的工业级提纯中，制药成份往往需要千克级的提取。在分析液相中色谱柱的典型进样量是微克级，甚至更低。样品量和固定相之比有的甚至小于1:100000。进样体积一般来说都大大小于色谱柱体积（小于1:100）。在这种条件下，会达到很好的分离效果，峰形尖锐并且很对称。而在制备液相中，最大的区别就是超量进样。

获得高纯物质（色谱纯）的有效方法。半制备柱（内径8mm，长度15～30cm），一次制备量０.1～１mg；1.色谱柱的柱容量（柱负荷）对分析柱：不影响柱效时的最大进样量；对制备柱：不影响收集物纯度时的最大进样量；超载：进样量超过柱容量。柱效迅速下降，峰变宽。超载可提高制备效率，以柱效下降一半或容量因子k降低10%为宜。2.液相制备色谱的方法色谱柱载样和超量载样色谱柱超量载样，暨在相同的分析条件下超量进样

使用色谱柱超量载样的方法，在分析柱上甚至可以进行毫克级的分离。但更大量的样品分离就需要整个系统的放大。色谱柱超量载样可以通过两种方法进行：浓缩法和体积超载法在浓缩法中，样品的浓度会提高，但进样体积保持不变。容量因子k’降低，同时峰形从高斯曲线变为矩形。浓缩法超量载样只有在样品组份在流动相中具有良好的溶解性的条件下才有可能采用。如果样品组份的溶解性很差，浓缩法超量载样不能使用。使更多的样品体积注射到色谱柱中，这种技术称作体积法超量载样。超过一定的进样体积，峰高不变，但峰变宽并且呈矩形。两种超量载样技术通常被结合起来使用。两种技术的概览浓缩法超量载样

体积法超量载样取决于组份在流动相中的溶解性取决于进样体积

吸附变化线的制备部分吸附变化线的分析部分生产效率决定于选择性

生产效率决定于制备柱直径受固定相粒度大小的影响不大需要小颗粒填料收集组分时，通常有以下情况：

可获得良好分离，主峰使用制备柱，超载提高效率；两主成分之间的小组分；超载，分离切分使待分离组分成为主成分（富集）后，再次分离制备。

制备型液相色谱：结构与分析型一样，但泵流量大、进样量大、采用制备柱；柱后馏分收集器。制备柱：内径20～50mm，柱长50cm。3.制备型液相色谱1.概述

超临界流体：在高于临界压力与临界温度时，物质的一种状态。性质介于液体和气体之间。超临界流体色谱(SFC)，80年代快速发展，具有液相、气相色谱不具有的优点:（1）可处理高沸点、不挥发试样；（2）比LC有更高的柱效和分离效率。九、超临界流体色谱

supercriticalfluidchromatography,SFC

性质介于液体和气体之间;具有气体的低黏度、液体的高密度，扩散系数位于两者之间。可通过改变超临界流体的密度（程序改变）调节组分分离（类似于气相色谱的程序升温，液相色谱中的梯度淋洗）。

超临界流体的密度与压力有关。2.超临界流体性质超临界流体：指高于临界压力和临界温度时的一种物质状态，它既不是气体，也不是液体，但它兼具气体的低粘度和液体的高密度以及介于气体和液体之间的较高扩散系数等特征。SFC：以超临界流体作流动相，以固体吸附剂（如硅胶）或键合在载体（或毛细管壁）上的有机高分子聚合物作固定相的色谱方法。常用流动相：超临界状态下的CO2、氧化亚氮、乙烷、三氟甲烷等。CO2最常用，因为它的临界温度低（31℃）、临界压力适中（7.29MPa）、无毒、便宜，但其缺点是极性太低，对一些极性化合物的溶解能力较差，所以，通常要用另一台输液泵往流动相中添加1-5％的甲醇等极性有机改性剂。

色谱柱：液相色谱的填充柱和气相色谱的毛细管柱都可以使用，但由于超临界流体的强溶解能力，所使用的毛细管填充柱的固定相必须交联。

应用：从理论上讲，SFC既可以象液相色谱一样分析高沸点和难挥发样品，也可象气相色谱一样分析挥发性成分。不过，超临界流体色谱更重要的应用是用来作分离和制备，即超临界流体萃取。

SFC的流动相：超临界流体；CO2、N2O、NH3

SFC的固定相：固体吸附剂（硅胶）或键合到载体（或毛细管壁）上的高聚物；可使用液相色谱的柱填料。填充柱SFC和毛细管柱SFC；

分离机理：吸附与脱附。组分在两相间的分配系数不同而被分离；通过调节流动相的压力（调节流动相的密度），调整组分保留值；3.原理

SFC的柱压降大（比毛细管色谱大30倍），对分离有影响（柱前端与柱尾端分配系数相差很大，产生压力效应）；超临界流体的密度受压力在临界压力处最大，超过该点，影响小，超过临界压力20%，柱压降对分离的影响小；

压力效应：在SFC中，压力变化对容量因子产生显著影响，超流体的密度随压力增加而增加，密度增加提高溶剂效率，淋洗时间缩短。

CO2流动相，当压力改变：7.0→9.0×106Pa，则：C16H34的保留时间25min→5min。压力效应：程

序

升

压HPLC与SFC

比较4.结构流程

（1）SFC的高压泵

无脉冲的注射泵；通过电子压力传感器和流量检测器，计算机控制流动相的密度和流量；（2）SFC的色谱柱和固定相

可以采用液相色谱柱和交联毛细管柱；SFC的固定相：固体吸附剂（硅胶）或键合到载体（或毛细管壁）上的高聚物；专用的毛细管柱SFC；5.主要部件（3）流动相

SFC的流动相：超临界流体；CO2、N2O、NH3

CO2应用最广泛；无色、无味、无毒、易得、对各类有机物溶解性好，在紫外光区无吸收；缺点：极性太弱；加少量甲醇等改性；（4）检测器

可采用液相色谱检测器，也可采用气相色谱的FID检测器1.聚苯醚低聚物的分析色谱柱：10m×63μmi.d.

毛细管柱，固定相：键合二甲基聚硅氧烷；流动相：CO2；柱温：120C；程序升压；超临