遗传实验11、12 诱变物质的微核测试(综合)

诱变物质的微核试验实验十一、十二实验原理

微核（Micronucleus，MN）：当染色体受到损伤后，染色单体或染色体的无着丝粒断片，或因纺锤体受损而丢失的整个染色体，在细胞分裂后期，仍然游离在细胞质中。末期之后，单独形成一个或几个规则的次核，被包含在子细胞的胞质内，因比主核小，故称为微核。微核试验（Micronucleustest，MNT）

：凡能使染色体发生断裂或使染色体和纺锤体联结有损伤的化学物，都可用微核试验来检测。各种类型的骨髓细胞都可形成微核，但有核细胞的胞质少，微核与正常核叶及核的突起物难以鉴别。所以多用无主核的细胞来进行微核试验。嗜多染红细胞（polychromaticerythrocyte，PCE）：是分裂后期，处于幼年红细胞向成熟红细胞发展中间阶段的一群红细胞。此时的红细胞主核已排出，但因胞质内含有核糖体，用姬姆萨染色呈灰蓝色；成熟红细胞的核糖体已消失，则被染成橘红色；而幼红细胞则有较大的核，且被染成紫红色。骨髓中嗜多染红细胞数量充足，微核被染成紫红色或蓝紫色，很容易辨认，而且微核自发率低。因此，骨髓中嗜多染红细胞成为微核试验的首选细胞群。成熟红细胞嗜多染红细胞幼红细胞嗜多染红细胞微核实验目的1、了解微核发生的机制；2、掌握微核实验的一般程序和实践意义；3、掌握对实验动物进行药物处理的一般程序、方法和注意事项；4、掌握进行实验设计的一般程序和规则，学会用生物统计学方法对实验结果进行统计分析，并锻炼实践能力。仪器和器械

离心机、生物显微镜、解剖剪刀、镊子、注射器、尖底刻度离心管、载玻片、盖玻片、塑料吸瓶、吸水纸等。试剂及配制

（1）小牛血清（灭活）

将滤菌的小牛血清置于56℃恒温水浴保温30min灭活。灭活的小牛血清通常保存于冰箱冷冻室里。

（2）姬姆萨（Giemsa）染液（原液）

成分：Giemsa染料3.8g、甲醇 375mL、甘油125mL。

配制：将染料和少量甲醇于乳钵里仔细研磨，再加入甲醇至375mL和125mL甘油，混合均匀，放置37℃恒温箱中保温48h。保温期间，振摇数次，促使染料充分溶解，取出后过滤，两周后使用。（3）0.1mol/L磷酸盐缓冲液（pH6.8）成分：磷酸氢二钠（Na2HPO4·12H2O）71.64g/L（A液）

磷酸二氢钠（NaH2PO4

·2H2O）31.21g/L（B液）分别加蒸馏水1000mL配成A、B液；取A液51ml,B液49ml混合，再加入100ml蒸馏水混匀，即为pH6.8的0.1mol/L磷酸缓冲液。（4）Giemsa应用液取2mlGiemsa染液原液与40ml0.1mol/L磷酸盐缓冲液混合而成。临用现配。实验动物：

小鼠是微核试验的常规动物。体重一般为25g~35g（也可选用成年大鼠，体重为150g~200g）。正常小鼠嗜多染红细胞自发微核频率为2.6‰，阳性物（一般用环磷酰胺150mg/kg体重剂量）对照组微核频率为30.4‰。（斑马鱼微核频率范围为0.25‰

~1.2‰

）剂量分组：

每种受试药物一般至少设3个剂量。每个剂量组5-10只动物。另外，还应设溶剂对照（阴性对照）和阳性物对照组。常用环磷酰胺作为阳性物对照，剂量可为40mg//kg体重（或150mg/kg体重）。如用斑马鱼（体重约0.5g，体长2.8~3.0cm

）测试水体污染物诱导微核的实验，则阳性对照物为氟化钠（NaF），剂量为30mg/kg。一般为腹腔或腹部皮下注射。受试物：秋水仙素，对苯二酚，氯化汞（以往实验设计）受试物剂量mg/Kg组别各受试小鼠1000个受检细胞中含微核细胞数1234567对苯二酚1201802403秋水仙素1015213氯化汞312213阴性对照蒸馏水阳性对照环磷酰胺(40mg/kg)受试物：秋水仙素，对苯二酚，氯化汞（本次实验设计）受试物(浓度)剂量mg/30g/只组别各受试小鼠1000个受检细胞中含微核细胞数1234567对苯二酚(1.2mg/ml)240(0.2ml)1480(0.4ml)2720(0.6ml)3秋水仙素(0.1mg/ml)20(0.2ml)440(0.4ml)560(0.6ml)6氯化汞(0.03mg/ml)6(0.2ml)112(0.4ml)218(0.6ml)3阴性对照蒸馏水0(0.2ml)7阳性对照(200mg/ml)环磷酰胺40(0.2ml)8染毒途径和方式

染毒途径视实验目的而定，常用腹腔注射，24小时取材。

试验方法（1）骨髓的制取

①用断颈法处死小鼠。用剪刀剪开腿部的皮肤，用镊子夹住小鼠的股骨，剪去股骨周围的肌肉，将小鼠的两股骨取出(注意股骨的完整性)，擦净股骨上的肌肉。去股骨的髋面，将吸有0.85%Nacl生理等渗液小注射器的针头插入，反复数次吹出骨髓细(注意吹干净)。反复吹打使其混合均匀，制成细胞悬液。

②将细胞悬液在1000转/分离心5分钟，弃除上清液。（2）涂片在离心管中加入少量灭活的小牛血清（约0.3ml)混匀后，按血常规涂片法涂片，长度约2cm~3cm(涂片时一次涂成）。在空气中晾干。（3）固定

将干燥的涂片放入无水甲醇液（或甲醇：冰乙酸=3:1的固定液）中固定5~10

min。即使当日不染色，也应固定后于冰箱中保存。（4）染色

将固定过的涂片放入Giemsa应用液中，染色20min~30min，然后立即用0.1mol/L磷酸盐缓冲液冲洗。（5）封片

用滤纸及时擦干染片背面的水滴，再用双层滤纸轻轻按压染片，以吸附染片上残留的水分，再在空气中晃动数次，以促其尽快晾干，然后放入二甲苯中透明5min，取出滴上适量光学树脂胶，盖上盖玻片，写好标签。（6）观察与计数

先用低倍镜，后用高倍镜粗略检查，选择细胞分布均匀，细胞无损，着色适当的区域，再在油浸镜下计数。虽然不计数含微核的有核细胞（主要为幼红细胞），但需用形态和染色完好的有核细胞来做判断制片优劣的标准。

选择细胞完整、分散均匀，着色适当的区域，在油镜下观察；以有核细胞形态完好作为判断制片优劣的标准，计数1000个嗜多染红细胞中有微核的细胞数。

本法系观察嗜多染红细胞的微核。用Giemsa染色法，嗜多染红细胞呈蓝灰色，成熟红细胞呈粉红或橘红色。典型的微核多为单个的、圆形、边缘光滑整齐，嗜色性与核质一致，呈紫红色或蓝紫色，直径通常为红细胞的1/20～1/5。也有两个及多个微核的细胞。微核率每只动物计数1000个嗜多染红细胞（也可以4个同学为一个小组，每位同学计数250个细胞），最后合并计算嗜多染红细胞数中含有微核的细胞数。微核率一般以“千分率”（‰）表示。

数据处理

利用统计学软件SPSS的单因素方差分析或t检验等方法，进行数据处理，分析实验结果（如下表）。

组别剂量动物数受检细胞数含微核细胞数微核率P值(g/kg体重)(只)(个)(个)(‰)受试物

溶剂对照

阳性物对照(mg/kg体重)

例表：对苯二酚对动物骨髓嗜多染红细胞的微核发生率组别剂量动物数受检细胞数含微核细胞数微核率P值

(g/kg体重)(只)(个)(个)(‰)受试物120

对苯二酚8040溶剂对照（蒸馏水）阳性对照环磷酰胺

(mg/kg体重)50实验报告为设计性综合性报告（交打印稿），内容包括：（1）受试物名称、配制方法、所用溶剂；（2）

动物种属和品系、体重、数量、性别、来源；（3）剂量分组，染毒途径和方式；（4）试验方法：简述操作步骤，所用统计学方法，结果判定标准；（5）结果：以列表方式报告受试物对动物骨髓细胞微核发生率；（6）结论。要求参阅的文献：

[1]孟紫强，阮爱东，桑楠等.SO2污染对小鼠骨髓嗜多染红细胞微核的诱发作用.环境科学，2002，23（4）123-125.[2]孟紫强，桑楠，张波等.二氧化硫体内衍生物诱发小鼠骨髓嗜多染红细胞微核的效应.环境科学学报，2000，20（2