韩丽晶-微生物的实验室培养

一、微生物的利用1．进行微生物的分离与培养

技能性独立操作水平（ⅡA）实验：大肠杆菌的实验室培养（可行）锁定：（1）培养基的配比与制作（2）无菌技术（3）接种之平板划线操作（4）菌落观察专题2微生物的培养与应用课题1微生物的实验室培养专题重点：

①无菌技术的操作。②对土样的选取和选择培养基的配制。③从土壤中分离分解纤维素的微生物。

专题难点：

①无菌技术的操作。②对分解尿素的细菌的计数。③从土壤中分离分解纤维素的微生物。微生物的实验室培养条件：（1）合适的营养和环境条件（2）确保其他微生物无法混入1.何为培养基？3.不同的培养基有不同的配方，但是其基本成分都相同，都包括哪些营养元素？有何作用？请举例说明。阅读教材P14~15相关内容，回答以下问题：2.按照不同的培养基划分标准，培养基有哪些种类、配制特点及其应用？一、培养基：为人工培养微生物而制备的、提供适合微生物生长、繁殖或积累代谢产物的营养基质。（1）按物理状态来分：液体培养基、固体培养基、半固体培养基。（2）按成分来分：天然培养基、合成培养基、半合成培养基。（3）按用途来分：选择培养基、鉴别培养基。二、培养基的类型液体培养基表面生长均匀混浊生长沉淀生长（1）按物理状态来分：固体培养基半固体培养基液体培养基：

主要用于工业生产；固体培养基：

主要用于微生物分离、鉴定、计数等；半固体培养基：

主要用于观察、保藏菌种。☆为什么在工业生产中常用液体培养基？液体培养基特点：营养物质分布均匀，与菌体表面接触充分，因此适于大规模工业化生产中。（2）按成分来分：天然培养基化学成分不明确，主要用于工业生产；合成培养基化学成分明确，主要用于分类、鉴定。优点：取材便利、营养丰富、配制简便；缺点：营养成分难以控制、实验结果的重复性较差。优点：化学成分及其含量明确、实验的可重复性好；缺点：配制繁琐、成本较高。合成培养基:天然培养基：天然培养基如培养细菌的牛肉膏蛋白胨培养基；血清、血浆、和组织提取液（如鸡胚和牛胚浸液）。（3）按功能来分：选择培养基加某种化学物质，从众多微生物中分离所需的微生物。鉴别培养基加某种试剂或化学物质，鉴别不同种类的微生物。（如伊红—美蓝培养基可鉴别大肠杆菌，其代谢产物有机酸与伊红—美蓝结合，使菌落呈现深紫色略带金属光泽）☆选择培养基加入青霉素的培养基：

分离酵母菌、霉菌等真菌不加含碳有机物的无碳培养基：

分离自养型微生物固体培养基和培养皿的来历

分离培养微生物，离不开固体培养基。在微生物实验室里，固体培养基的使用是如此地频繁和常规，以至于这一方法看起来也理所当然。然而，回溯至1881年固体培养基出现以前，微生物的培养还只能在液体培养基中进行。为了能直接观察培养物的形态及生长情况，科学家希望能将微生物培养在固体表面上，就像微生物生长在橘子皮或土豆上一样。德国医生罗伯特·科赫（Robert·Koch，1843—1910）曾用煮沸消毒的土豆来培养细菌。此后，他试着用明胶作培养基的凝固剂。他将明胶加入液体培养基中进行融化，然后将混合均匀的液体缓慢地倒在一块玻璃板的表面。当明胶冷却凝固后，就在玻璃板表面形成一层固体培养基。为了防止空气中杂菌的污染，科赫还用玻璃罩将玻璃板与周围环境隔离开来。但是，人们很快发现，明胶在20℃以上就变软了，很难进行分离微生物的划线操作。在温度高于25℃时，明胶就液化了，而大多数细菌的培养温度都不低于25℃。科赫的同事WalterHesse也为同样的问题苦恼着。一次，Hesse的妻子Fannie建议丈夫试一试用琼脂做凝固剂，因为Fannie用琼脂做果冻做得不错。Hesse采纳了妻子的建议，发现琼脂比明胶更适合做培养基的凝固剂。这个改进的方法很快就被大家采纳。

1887年，RichardPetri发表了一篇短文，对Koch平板技术作了又一次的改进。Petri设计了一种圆形并带有围边的双盘，一个大，一个小。制作固体培养基时，将融化的培养基倒入小盘内，然后再用大盘盖在小盘上就可以了。这就是我们今天所使用的培养皿。

回顾历史，我们可以看出，Koch的固体培养基的方法以及他对微生物学中纯培养技术的重视，远远超过了其所在的医学细菌学领域。他的发现为细菌分类学、遗传学和其他相关学科的发展提供了极为重要的工具。三、培养基配制原则：

（1）目的要明确：根据微生物的种类、培养目的等确定配制培养基的种类，因为不同的微生物对培养物质的需求不同。（2）营养要协调：注意各种营养物质的浓度和比例。（3）pH要适宜：各种微生物适宜生长的pH范围不同。细菌pH为：6.5-7.5；放线菌pH为：7.5-8.5；

真菌pH为：5.0-6.0。成分：思考：各种培养基的具体配方不同，但一般都包括哪些成分？水、无机盐、碳源、氮源、（生长因子）满足微生物对pH、特殊营养物质、氧气的要求☆微生物正常代谢过程中pH会不会改变？

如何维持培养基中pH的相对恒定？

微生物在生长代谢过程中，由于营养物质的利用和代谢产物的形成，往往会改变环境中的pH。可在培养基中加入缓冲剂，最常用的缓冲剂是K2HPO4/KH2PO4菌落：单个或少数细菌在固体培养基上大量繁殖时，就会形成一个肉眼可见的，具有一定形态结构的子细胞群体，叫做菌落。菌落是鉴定菌种的重要依据。菌落C二.无菌技术思考：1.什么是无菌技术？包括哪些方面？2.无菌技术除了用来防止实验室的培养物被其他外来微生物污染外，还有什么目的？（P15旁栏思考）3.消毒和灭菌有何不同？4.常用的消毒和灭菌方法有哪些？无菌技术还能有效避免操作者自身被微生物感染。1、煮沸消毒法:100℃煮沸5-6min2、巴氏消毒法：70-75℃下煮30min或80℃下煮15min3、化学药剂消毒法:用75%酒精、新洁尔灭等进行皮肤消毒;氯气消毒水源4、紫外线消毒……(1)消毒的方法：4.常用的消毒与灭菌的方法1、灼烧灭菌2、干热灭菌：160-170℃下加热1-2h。3、高压蒸气灭菌：100kPa、121℃下维持15-30min.(2)灭菌的方法：

最常用的灭菌方法是高压蒸汽灭菌，它可以杀灭所有的生物，包括最耐热的某些微生物的休眠体，同时可以基本保持培养基的营养成分不被破坏。有些玻璃器皿也可采用高温干热灭菌。为了防止杂菌，特别是空气中的杂菌污染，试管及玻璃烧瓶都需采用适宜的塞子塞口，通常采用棉花塞，也可采用各种金属、塑料及硅胶帽，它们只可让空气通过，而空气中的其他微生物不能通过。而平皿是由正反两平面板互扣而成，这种器具是专为防止空气中微生物的污染而设计的。

判断下列各项是否需要消毒或灭菌。如需要，选择合适方法。（1）豆浆（2）游泳池（3）超净工作台（4）玻棒、试管、吸管、锥形瓶（5）培养细菌用的培养皿（6）无菌水（7）牛肉膏蛋白胨培养基（8）接种环、接种针（9）实验操作者的双手接种环接种针涂布器二实验操作（一）制备牛肉膏蛋白胨固体培养基称量溶化灭菌倒平板①溶化时为什么要将牛肉膏连同称量纸一起加热?可保证粘附在称量纸上的牛肉膏也能溶于水中，减少误差。计算二实验操作（一）制备牛肉膏蛋白胨固体培养基称量溶化灭菌倒平板②加琼脂的目的是什么?作为凝固剂计算二实验操作（一）制备牛肉膏蛋白胨固体培养基称量溶化灭菌倒平板③在灭菌前,用牛皮纸、旧报纸包紧盛有培养基的锥形瓶的目的是什么？在灭菌时能避免水蒸汽凝结时浸湿棉塞，在取出培养基锥形瓶时也起到隔绝空气中杂菌污染的作用。计算二实验操作（一）制备牛肉膏蛋白胨固体培养基称量溶化灭菌倒平板④培养皿能否用高压蒸汽灭菌？不能，因为培养皿要保持干燥，应该用干热灭菌。计算倒平板讨论1、21、用手触摸盛有培养基的锥形瓶，感觉刚刚不烫手时，就可以进行倒平板了。2、通过灼烧灭菌，防止瓶口的微生物污染培养基。讨论3、4、3、平板冷凝后，皿盖上会凝结水珠，凝固后的培养基表面的湿度也比较高，将平板倒置，既可以使培养基表面的水分更好地挥发，又可以防止皿盖上的水珠落入培养基，造成污染。4、空气中的微生物可能在皿盖与皿底之间的培养基上滋生，因此最好不要用这个平板培养微生物。二实验操作（一）制备牛肉膏蛋白胨固体培养基称量溶化灭菌倒平板接种方法有：平板划线法和稀释涂布平板法计算（二）纯化大肠杆菌1.平板划线法操作的第一步灼烧接种环：

每次划线前灼烧接种环：划线结束后灼烧接种环：

避免接种环上可能存在的微生物污染培养物；

杀死上次划线结束后，接种环上残留的菌种，使下一次划线时，接种环上的菌种直接来源于上次划线的末端，从而通过划线次数的增加，使每次划线时菌种的数目逐渐减少，以便得到菌落。及时杀死接种环上残留的菌种，避免细菌污染环境和感染操作者。讨论1讨论2、32.以免接种环温度太高，杀死菌种。3.划线后，线条末端细菌的数目比线条起始处要少，每次从上一次划线的末端开始，能使细菌的数目随着划线次数的增加而逐步减少，最终能得到由单个细菌繁殖而来的菌落。2.稀释涂布法（1）系列稀释操作：（2）涂布平板操作讨论提示：应从操作的各个细节保证“无菌”。例如，酒精灯与培养皿的距离要合适、吸管头不要接触任何其他物体、吸管要在酒精灯火焰周围；等等。（一）制备牛肉膏蛋白胨固体培养基称量溶化灭菌倒平板接种方法有：平板划线法和稀释涂布平板法计算（二）纯化大肠杆菌（三）将接种后的培养基和一个未接种的培养基放入37℃恒温箱中培养12h和24h后，观察并记录

1、临时保藏法：对象：温度：缺点：

2、甘油管藏法：对象：温度：频繁使用的菌种4℃（冰箱）容易被污染或产生变异长期保存的菌种-20℃（冷冻箱）菌种的保藏三课题延伸四、课题成果评价

（一）培养基的制作是否合格如果未接种的培养基在恒温箱中保温1～2d后无菌落生长，说明培养基的制备是成功的，否则需要重新制备。（二）接种操作是否符合无菌要求如果培养基上生长的菌落的颜色、形状、大小基本一致，并符合大肠杆菌菌落的特点，则说明接种操作是符合要求的；如果培养基上出现了其他菌落，则说明接种过程中，无菌操作还未达到要求，需要分析原因，再次练习。（三）是否进行了及时细致的观察与记录培养12h与24h后的大肠杆菌菌落的大小会有明显不同，及时观察记录的同学会发现这一点，并能观察到其他一些细微的变化。这一步的要求主要是培养学生良好的科学态度与习惯。本课题知识小结:练习1.获得纯净培养物的关键是（）A将用于微生物培养的器皿，接种用具和培养基等器具进行灭菌B接种纯种细菌C适宜环境条件下培养D防止外来杂菌的入侵D练习2.下列操作与无菌技术无关的是()A接种前用肥皂洗双手,再用酒精擦拭双手B接种前用火焰烧灼接种针C培养在50℃左右时搁置斜面D在酒精灯的火焰旁完成C练习3.外科手术器械和罐头食品的处理，要以能够杀死什么为标准（）A球菌

B杆菌

C螺旋菌

D芽孢D4、下面对发酵工程中灭菌的理解不正确的是A.防止杂菌污染B.消灭杂菌C.培养基和发酵设备都必须灭菌D.灭菌必须在接种前答案：B

解析：灭菌是微生物发酵过程的一个重要环节。A说的是灭菌的目的，因为发酵所用的菌种大多是单一的纯种，整个发酵过程不能混入其他微生物（杂菌），所以是正确的；B是错误的，因为灭菌的目的是防止杂菌污染，但实际操作中不可能只消灭杂菌，而是消灭全部微生物。C是正确的，因为与发酵有关的所有设备和物质都要灭菌；发酵所用的微生物是灭菌后专门接种的，灭菌必须在接种前，如果接种后再灭菌就会把所接菌种也杀死。编号成分含量①粉状硫10g②（NH4）2SO40.4g③K2HPO44.0g④MgSO49.25g⑤FeSO40.5g⑥CaCl20.5g⑦H2O100ml5．右表是某微生物培养基成分，请据此回答：（1）右表培养基可培养的微生物类型是

。（2）若不慎将过量NaCl加入培养基中。如不想浪费此培养基，可再加入

.自养型微生物

含碳有机物

（3）若除去成分②，加入（CH2O），该培养基可用于培养

。（4）表中营养成分共有

类。（5）不论何种培养基，在各种成分都溶化后分装前，要进行的是

。（6）右表中各成分重量确定的原则是

。（7）若右表培养基用于菌种鉴定，应该增加的成分是

。固氮微生物

3调整pH

依微生物的生长需要确定

琼脂（或凝固剂）

练习6.某学校打算开辟一块食用菌栽培基地,以丰富学生的劳动技术课内容,首先对食用菌实验室进行清扫和消毒处理,准备食用菌栽培所需的各种原料和用具,然后从菌种站购来各种食用菌菌种.请回答以下问题:练习①对买回来的菌进行扩大培养,首先制备试管培养基,写出制备固体牛肉膏蛋白胨培养基所需的原料：_________________________________其中提供氮源的主要是_______；提供能源的主要物质是_______；琼脂的作用是_______，它不提供营养。牛肉膏、蛋白胨、水、无机盐、琼脂蛋白胨牛肉膏凝固剂练习②微生物在生长过程中对各种成分所需量不同,故制备培养基时各成分要有合适的_____,在烧杯加入琼脂后要不停地_____,防止_____________________.比例搅拌琼脂糊底引起烧杯破裂练习③将配制好的培养基转移到锥形瓶中，加棉塞后包上牛皮纸并用皮筋勒紧放入___________中灭菌，压力为________，温度为______，时间__________，灭菌完毕拔掉电源，待锅内压力____________，将试管取出。高压灭菌锅100KPa121℃15~30min自然降至零后练习⑤从一支试管向另一支试管接种时注意，