DB15T 2833-2022 狼源性成分检测 实时荧光PCR法

发布发布内蒙古自治区市场监督管理局2023-01-082022-12-08ICS67.120.01CCSICS67.120.01CCSB45内 蒙 古 自 治 区 地 方 标 准DB15/T2833—2022PCRReal-timePCRmethodfordetectionofcanislupus-derivedmaterialsDB15/T2833—2022DB15/T2833—2022II前 言本文按GB/T1.1—2020《准工导则 第部分标化件结和起规》起草。本文件由中华人民共和国呼和浩特海关提出并归口。本文件起草单位：中华人民共和国二连海关。本文件主要起草人：王伊琴、陈少博、包勇敢、杨帆、荆文魁、苏日娜、张志峰、常鸿、寇福军、赵治国。DB15/T2833—2022DB15/T2833—2022DB15/T2833—2022DB15/T2833—2022115 下列缩略语适用于本文件。CTAB：十六烷基三甲基溴化铵(cetyltrithylammoniumbromide)DNA:脱氧核糖核酸（deoxyribonuleicacid）EDTA：乙二胺四乙酸(ethylenediaminetetraaceticacid)FAM:6-羧基荧光素(6-carboxyfluorescein)PCR（polymerasechainreaction）TAMRA:(carboxy-tetramethyl-rhodamine)Tris：三（羟甲基）氨基甲烷[tris(hydroxymethyl)aminomethane]4 缩略语Ct值 cyclethreshold每个反应管内的荧光信号达到设定的阈值时所经历的循环数。实时光 PCRreal-timePCR在PCR反应体系中加入荧光基团,利用荧光信号的积累实时监控整个PCR扩增过程。下列术语和定义适用于本文件。狼源性成分检测实时荧光PCR法范围本文件规定了动物源性产品中狼源性成分实时荧光PCR检测方法。（0.15ng/L。（GB/T6682 GB/T27403 22DNA提取DNADNADNAA260/A280在1.7～1.9PCR实时荧光PCR检测7.2.1 反应体系体积为25.0L，见表1。实时荧光PCR仪（加热速率10℃/s以上）。高速台式离心机（最高转速12000rpm）。（3000rpm）天平（感量0.01g）。单孔道微量移液器：0.5L～10L、10L～100L、20L～200L、100L～1000L。7 GB/T6682上游：5′-CCGTACTCTAGCTTACATA-3′；下游：5′-GAGACCTTCCAGATGAAA-3′；5′-(FAM)-TACCTCACATTAGCCAAGAAGCCA-(TAMRA)-3′。DNA。Tris-HCl(pH8.0NaCl。。K20mg/mL)75PCRDNA，B。DNA。ddH2O。6 表1 狼源成实光PCR检测法反体系试剂名称贮备液浓度mol/L反应体系体积LPCR反应预混合液—12.5上游引物（F）10.01.0下游引物（R）10.01.0探针（P）10.01.0模板—2.0ddH2O—补足至总体积为25.0检测过程分别设阴性对照、阳性对照和空白提取对照。7.2.2 94℃，3min94℃，1060℃，1060℃时收质量控制质控对照应满足以下条件，否则应重新实验：Ct35.0；Ct35.0；Ct28.0。结果判定，2Ct28.0，2Ct28.01Ct28.0～35.0DNAPCRCtCt28.0结果表述检测过程中防止交叉污染的措施按照GB/T27403中的规定执行。3444000rpm/min～5000r/min离心10min。1m）EP2m管0301200rm10min。600L～650LEP2CTAB1min。12000rpm离心10min350的1.2mol/LNaCl（2350L溶液。加入350L30min12000rpm10min。EP0.20min，12000rpm离心10min500L7512000rpm10min。，6015s～20s（。100LTEbuffer或DEPC附录A（资料性）溶液配制及提取方法CTAB将5gCTAB，20.45gNaCl，3.03gTris，1.86gNa2-EDTA溶于200mL水中，用盐酸调pH8.0后，定容至250mL，115℃高压15min。CTAB称0.2gCTAB,0.234gNaCl，定容至100mL，115℃高压15min。1.2mol/LNaCl称取28gNaCl，定容至400mL，115℃高压15min。DNA0.5g～11.5mL～3.5mLCTAB12L～20L根据CTAB265℃至少1h(CTAB,1mL10。55附录B（规范性）狼源性成分的目标扩增序列142bpCCGTACTCTAGCTTACATAACTCAG