k第十一章抗生素类药物分析

第十一章抗生素类药物分析

Chapter11TheAnalysisof

Antibiotics

药物分析课件系列INDEXContentsFundamentalRequirementSection1introductionSection2β-lactamantibioticsSection3AminoglycosidesantibioticsSection4TetracyclineantibioticsSection5QualityresearchofAntibioticsSummaryThestructures,properties,identificationandassayofβ-lactamAntibiotics;

β-内酰胺抗生素化学结构、性质、鉴别试验与含量测定；ContentThestructures,chemicalproperties,andassayofaminoglycosidesandimpuritytestsofstreptomycinBandgentamycincomponentC;

氨基糖苷类抗生素结构化学性质、鉴别试验、含量测定及链霉素B杂质检查庆大霉素Ｃ组分测定；Thestructures,identification,specialimpuritytestsandassayoftetracyclines;

四环素类抗生素化学结构性质、鉴别试验、含量测定及盐酸四环素中特殊杂质检查;

Thequalityresearchreviewofantibiotics抗生素类药物质量考察研究。.FundamentalRequirements掌握本类药物的化学结构特点理化性质，主要鉴别试验及主要含量测定方法；

Masteringthestructures,physicalandchemicalproperties,primaryidentificationtestsandassaymethodsofantibiotics.了解典型抗生素有关杂质的分离研究进展。

Understandingthedevelopmentofrelevantsubstanceresearchfortypicaldrugs.

Section1Introduction

Definition

抗生素(antibiotics)是指某些微生物代谢产生的，在很低的浓度即可对某些生物的生命活动有特异抑制或杀灭作用的化学物质。

Classification

抗生素β-内酰胺类抗生素四环素类抗生素氨基糖苷类抗生素大环内酯类抗生素氯霉素类抗生素青霉素及半合成青霉素类头孢菌素及半合成头孢菌素类其他抗生素青霉素、氨苄西林、阿莫西林、青霉素V头孢噻吩钠、头孢氨苄、头孢哌酮钠金霉素、土霉素、四环素、盐酸多西环素、盐酸美他环素链霉素、卡那霉素、庆大酶素、新酶素链霉素、卡那霉素、庆大霉素、新霉素红霉素、麦迪霉素、螺旋霉素氯霉素、甲砜霉素盐酸林可霉素、磷霉素

抗生素在质量控制上的特殊性.

生产的特殊性性质的特殊性(稳定性差)

质量问题

化学纯度低,三多:同系物多(G),异构体多(P),降解物多(T)

抗生素理化测定法与微生物测定法的关系.

微生物测定法:用抗生素对微生物的杀伤和抑制程度为指标来衡量抗生素的效价(potency).

原理:对数剂量和反应成直线,用管碟琼脂扩散法.

特点

理化测定法:根据抗生素的结构特点,利用其特有的化学或物理化学性质及反应而建立的方法.

特点

Section2β-LactamAntibiotics

StructureandCharacteristics

β-内酰胺类抗生素是指分子中含有四个原子组成的β-内酰胺环的抗生素。β-内酰胺环是该类抗生素发挥生物活性的必须基团,由四个原子组成的，其分子张力比较大，化学性质不稳定，易发生开环导致失活。Identificationtest

钾钠盐的火焰反应Flamereactionβ-内酰胺类药品中许多为钾盐和钠盐，可用此反应进行鉴别呈色反应Colorreaction

羟肟酸铁反应碱性环境中与羟胺作用β-内酰胺环破裂生成羟肟酸在稀酸中与高铁离子呈色.2.硫酸硝酸呈色反应头孢菌素类可与之反应呈色，机理多不明.茚三酮反应

α-氨基酸的反应,如氨苄西林与斐林试剂反应分子中具有(-CONH-)结构，可使碱性酒石酸铜还原显紫色,如阿莫西林5.其他呈色反应:如重氮苯磺酸呈色反应Orangeyellow

沉淀反应Precipitationreaction

1.在稀盐酸中生成白色沉淀：青霉素钾(钠)白色游离基沉淀2.有机胺盐的特殊反应：

A. 重氮化偶合反应：如普鲁卡因青霉素

B. 与三硝基苯酚的反应：如苄星青霉素加水溶解加稀盐酸

＋

光谱法Spectroscopy1. 紫外分光光度法(UV)a. 最大吸收波长鉴定法

b. 水解产物的最大吸收波长鉴定法2. 红外吸收光谱法(IR)3. 核磁共振光谱(HMR)

色谱法Chromatography1. 薄层色谱法(TLC)2. 高效液相色谱法(HPLC)IRspectrumofphenoxymethylpenicillinpotassium.ObtainedasaKBrdisc.

Assay

IodometrictitrationPrinciple：青霉素或头孢菌素分子不消耗碘，其降解产物消耗碘，例如青霉素族经水解后产生青霉噻唑酸可与碘作用，根据消耗的碘量计算青霉素的含量。Reactionprocess:Note：

一般认为碘与青霉素噻唑酸的作用以pH4.5温度24~26℃为最好；

青霉素的降解产物等杂质亦可消耗碘而影响测定结果，可以用未经水解的样品液作；

在滴定近终点时放慢滴定速度，并强力振摇；如果滴定至终点时又反现蓝色，说明真正的终点尚未到达；由于每摩尔青霉素能吸收较多摩尔的碘（1摩尔青霉素能消耗8摩尔碘），故本法的灵敏度较高。需作标准品对照试验；严格按规定操作。本试验含量计算公式：

含量%=××100%VTo－VT

CS×DVSo－VS

W式中：VTo、VSo：滴定供试品空白液和对照品空白液消耗的硫代硫酸钠液(0.02mol/L),ml;VT、VS：滴定供试品和对照品消耗的硫代硫酸钠液(0.02mol/L),ml;CS：对照品浓度，g/ml；W：供试品取样量，g；D：供试品稀释倍数。Thefirststep:(penicillin青霉素)

青霉噻唑二钠

第2步反应thesecondstepreaction：

Thesecondstep:+4I2+5H2O+2HCl

＋NaCl＋8HI＋汞量法(Mercurimetry)Principle：青霉素分子不与汞盐反应，而其碱性水解产物青霉噻唑酸及继续水解生成的青霉胺都能与汞盐定量反应，根据消耗的汞盐量可以计算青霉素的含量。

Hg2++2R-SH

(RS)2Hg+2H+

2.Method(potentiometrictitration)Indicatorelectrode:Pt;referenceelectrode：Hg-mercuroussulfateelectrode；Standardsolution：mercuricnitratesolution(0.02mol/L)3.讨论：

a.

本次滴定只有一次突跃。但滴定曲线上出现两个指示点，即两次突跃。青霉素含量的计算系以第二次滴定终点为依据，此时青霉素与巯基汞化物的摩尔比为1︰1。

b.

水解必须完全。溶液的pH值和反应时间直接影响水解的完全程度，水解如不完全，将使测定结果偏低。

c.

本法的空白试验的做法与碘量法类似，空白试验的目的也是为了消除供试品中可能存在的降解产物的干扰。

d.本法与碘量法比较主要优点是不需要青霉素标准品作对照，汞盐滴定液用EDTA标定即可。

酸碱滴定法(Acid/basetitration)

Principle：青霉素或头孢菌素的β-内酰胺环可被碱水解，此水解系定量完成，可用于含量测定。如苯唑西林钠在水溶液中加过量的氢氧化钠滴滴定液水解后，产生的青霉噻唑酸被中和，再以盐酸滴定液滴定剩余的氢氧化钠液，以氢氧化钠滴定液的消耗量求得苯唑西林钠的含量。

UV

铜盐法:青霉素族抗生素在弱酸性下的降解产物青霉烯酸具有紫外吸收特征。青霉烯酸在320~360nm处有最大吸收,但此水解产物不稳定，可加Cu2+，与青霉烯酸形成较稳定的螯合物，在320nm处有最大吸收。2. 汞盐法:青霉素族抗生素在咪唑的催化下与氯化高汞能定量的反应转化呈相应的青霉烯酸硫醇汞盐，在324~325nm波长范围内有最大吸收。羟肟酸比色法青霉素族和头孢菌素族抗生素能与羟胺作用生成羟肟酸衍生物，在烯酸中与高铁离子生成红色络合物，在一定波长下测定吸收度而进行定量。高效液相色谱法HPLC

填充剂：十八烷基硅烷键合硅胶流动相：磷酸氢二钠、枸橼酸溶液检测波长：254nm保留时间：7.5min分离度：>4内标溶液：乙酰苯胺测定法：内标法计算：按内标法计算中国药典测定头孢唑林钠

第三节氨基糖甙类抗生素

Section3Aminoglycosidesantibiotics

本类抗生素的化学结构都是以碱性环己多元醇为甙元，与氨基缩合而成的甙，故称为氨基糖甙类抗生素(aminoglycosidesantibiotics)。

链霉素(Streptomycin)Structureandproperties

streptidinestreptoseN-methyl-L-glucosamine

streptobiosamineCharacteristics

链霉素的构成为一分子链霉胍和一分子链霉双糖胺结合而成的碱性甙。链霉素分子中有三个碱性中心，可与无机酸或有机酸形成可溶于水的盐，临床上多用其硫酸盐。Properties

酸性条件下，链霉素水解为链霉胍与链霉双糖胺，进一步水解则得到N-甲基-L-葡萄糖胺。弱碱性条件下能使之水解为链霉胍及链霉双糖胺，但继之即将链霉糖部分分子重排为麦芽酚(maltol),这一性质为链霉素所特有，可用于鉴别。IdentificationTests

NinhydrinreactionElson-Morganreaction

链霉素经水解，产生N-甲基葡萄糖胺，在碱性溶液中与乙酰丙酮缩和成吡咯衍生物，与对二甲氨基苯甲醛的酸性溶液反应即生成红色缩合物。

Maltolreaction

链霉素在碱性溶液中，链霉糖经分子重排使环扩大形成六元环，然后消除N-甲基葡萄糖胺，再消除链霉胍生成麦芽酚(α-甲基-β-羟基-γ-吡喃酮)。麦芽酚可与铁离子在微酸性环境中形成紫红色配位化合物。Sakaguchi

reactoin

本品水溶液加氢氧化钠试液，水解生成链霉胍。链霉素B杂质检查

BP（1993）规定了链霉素B的检查项目。甘露糖链霉素称作链霉素B，它是链霉素分子中N-甲基葡萄糖胺的C4〞位上的羟基连接一个D-甘露糖组成的。含量测定Assay

目前各国药典仍采用微生物检测法。茚三酮反应Ninhydrinreaction

＋2＋＋3H2OH+

Fe3+

H2ONaOHMaltolreactionMaltol庆大霉素(Gentamycin)

StructureandCharacteristicsStructureCharacteristics

庆大霉素是由绛红糖胺、脱氧链霉胺和加洛糖胺缩和而成的甙。庆大霉素有五个碱性中心，其碱性相似。能与无机酸或有机酸形成可溶于水的盐，多用硫酸盐。Property

硫酸庆大霉素水中易溶，在乙醇、丙酮、氯仿或乙醚中不溶。对光、热、空气均较稳定，水溶液稳定，pH2~12时，100℃加热30min活性无明显变化。庆大霉素在紫外无吸收。purpurosamine

deoxystreptosaminegarosamineStructure鉴别反应Identification

茚三酮反应Ninhydrinreaction

本品与链霉素一样具有氨基糖甙类结构，羟基胺类和α-氨基酸的性质，可与茚三酮生成蓝紫色缩和物。Elson-Morganreaction

与链霉素一样，经水解后也产生N-甲基葡萄糖胺(加洛糖胺)在碱性溶液中与乙酰丙酮缩和成吡咯衍生物，与对二甲基苯甲醛的酸性醇溶液反应，生成红色缩和物。紫外分光光度法Ultravioletspectroscopy

庆大霉素分子中无共轭双键系统，故在紫外区无吸收。薄层色谱法TLC高效液相色谱法HPLC红外光谱法IR硫酸盐反应Sulfatereaction检查－庆大霉素C组分测定

庆大霉素C1、C2、C1a对微生物的活性无明显差异，但其毒副作用和耐药性有差异，导致各组分的多少影响产品的效价和临床研究。中国药典(2000)、USP(24)和BP(1993)均采用高效液相色谱法，JP(13)采用薄层色谱法和薄层微生物显像法测定各组分的含量。含量测定Assay

目前各国药典仍用微生物检定法。

第四节四环素类抗生素

Section4

Tetracyclines

本类抗生素在化学结构上，都具有氢化四骈苯环，故统称为四环素族或四环素类(tetrac-yclines)抗生素。化学结构与性质

结构Structure

性质Character

NameRR′R〞R’’’

tetracyclineHOHCH3

HchlortetracycineClOHCH3

HoxytetracyclineHOHCH3

OHdoxycyclineHHCH3

OHmetacyclineH=CH2

OHStructure两性化合物Amphotericcompound；其盐酸盐易溶于水，并溶于碱或酸性溶液中；结晶性物质，在水中结晶者，均含有结晶水；旋光性Opticalrotation；差向异构化性质Epimerization——差向四环素；酸性降解Aciddegradation——脱水四环素；碱性降解Basedegradation——异四环素；中性降解Neutraldegradation——紫红色缩和物；与金属离子形成配位化合物。

鉴别试验Identification

i. 浓硫酸反应Con.Sulfuricacidii. 三氯化铁反应Ferricchloridereaction名称盐酸四环素盐酸金霉素盐酸土霉素盐酸多西环素盐酸美他环素浓硫酸反应深紫色蓝色变为橄榄绿色朱红色

黄色橙红色三绿化铁反应红棕色深褐色橙褐色褐色-氯化物反应Chloridereaction本类抗生素多用盐酸盐，可与硝酸银在酸性条件下生成氯化银白色沉淀。iv. 紫外分光光度法UV本类抗生素分子内含有共轭双键系统，在紫外光区有吸收。荧光法Fluorescence本类抗生素分子内含有共轭双键系统，在紫外光照射下能产生荧光，它们的降解产物也具有荧光。vi. 薄层色谱法TLC四环素类抗生素的薄层色谱多采用硅藻土作载体，为获得较好得分离，在粘合剂中加有聚二乙醇400、甘油以及中性的EDTA缓冲液。EDTA可以克服因痕量的金属离子存在而引起的脱尾现象。本类抗生素及其降解产物在紫外光(365nm)下产生荧光的性质，可用与检出斑点并以标准品对照进行鉴别。其他方法Othermethod红外光谱法及高效液相色谱法

盐酸四环素中特殊杂质检查(Impuritytestintetracycline)含量测定Assay

比色法Colorimetricmethod

高效液相色谱法HPLC

第五节

抗生素类药物的质量考察研究

Section5QualityResearchReviewofAntibiotics青霉素中致敏杂质的分离制备凝胶过滤法Gelfiltrationmethod

GDX104柱色谱GDX104columnchromatography杂质的研究Researchofimpurity

光谱法Spectroscopy

Penamaldate法测定青霉噻唑基团――青霉素过敏反应主要抗原决定簇紫外光谱分析UV

红外光谱分析IR

色谱法Chromatography

薄层色谱法TLC

高效液相色谱法HPLC

气相色谱法GC

凝胶过滤色谱法Gelfiltrationmethodchromatography

生物法Biologicalmethod

电泳法Electrophoreticmethod－圆盘电泳分析免疫法Immunizingmethod－豚鼠被动皮肤过敏试验(PCA试验)T