绿色荧光蛋白的表达及粗提取

主讲人：绿色荧光蛋白（GFP）的基因克隆、表达及粗提取目录

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仪器与试剂研究思路研究方法预期结果参考文献研究背景

绿色荧光蛋白简介

1.一类存在于包括水母、水螅和珊瑚等腔肠动物体内的生物发光蛋白2.

GFP是由238个氨基酸所组成的单体蛋白,相对分子质量为27.0kMr3.1962年，下村修等分离纯化了水母中发光蛋白水母素，并发现这种绿色的荧光蛋白。1974年，他们分离得到了这个蛋白目录

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绿色荧光蛋白优点

①荧光强度高，稳定性高；②分子量小，易于融合，适用于多种转化方式，对受体无毒害，安全可靠；③不需要反应底物与其他辅助因子，受蓝光激发产生绿色荧光，尤其适用于体内的即时检测；④不具有种属依赖性，在多种原核和真核生物细胞中都表达；⑤通过替换一些特殊氨基酸，可以使之产生不同颜色的光，从而适应不同的研究需要。近年来广泛用于基因的表达与调控、蛋白质的定位、转移以及相互作用、信号传递、转染与转化，以及细胞的分离与纯化等研究领域

1.仪器：恒温培养箱，超净台，恒温摇床，制冰机，台式离心机，核酸电泳仪，小型混合器，冰箱，蓝盾可见光透射仪，移液器、电泳槽、振荡器、制冰机、凝胶成像仪，水浴锅，高压灭菌锅、振荡培养箱，手持式紫外灯2.试剂：BamHI；NotI(10U/μL)；T4ligase；LB培养基；溶液Ⅰ；溶液Ⅱ；溶液Ⅲ；TE缓冲液；20×TBE；GeneFinder-溴酚蓝上样缓冲液；1×TBE缓冲液目录

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研究思路目录

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1.质粒DNA的分离与纯化01质粒DNA的分离与纯化02酶切及连接03大肠杆菌感受态细胞的制备及转化04GFP蛋白的诱导表达.05绿色荧光蛋白的粗提取步骤一步骤二步骤三步骤四步骤五

主要步骤1.1细菌的生长和质粒的扩增1.2碱提取法1.3质粒DNA的提纯目录

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1.质粒DNA的分离与纯化

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2.酶切及连接双酶切1质粒酶切产物的鉴定2回收酶切产物3连接4目录

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2.1双酶切目录

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仪器与试剂研究思路研究方法预期结果参考文献研究背景反应物（μL）pEGFP-N3pET-28a质粒1818BamHI22NotI2210×bufferK330.1%BSA缓冲液33

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2.4连接目录

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研究现状研究思路研究方法预期结果参考文献研究背景反应物体积/μL回收纯化的pET-28a质粒5gfp基因片段12T4连接酶1缓冲液（10×）2DNA连接酶能够催化在两条DNA链之间形成磷酸二酯键，这种酶需要在一条DNA链的3’-末端具有一个游离的羟基（-OH），和在另一条DNA链的5’-末端具有一个磷酸基团（-P）3.1感受态细胞的制备(CaCl2法)3.2转化涂板目录

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3.大肠杆菌感受态细胞的制备及转化

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4.GFP蛋白的诱导表达1.IPTG（异丙基硫代β-L半乳糖苷）是一种常见的诱导基因表达的诱导剂，结构类似乳糖。2.GFP基因连接到pET-28a的多克隆位点（MCS），GFP基因的表达受其上游T7启动子和操纵基因O位点以及结合到这些顺式作用元件的蛋白因子的控制。紫外灯下的绿色荧光蛋白

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4.GFP蛋白的诱导表达3.LacI基因编码调节蛋白，可以四聚体的形式结合到操纵基因O位点上，关闭GFP基因的表达4.IPTG可与四聚体调节蛋白结合，从而改变调节蛋白的构象，使调节蛋白不再与O位点结合。接着BL21编码的T7RNA聚合酶结合到T7启动子位点，从而启动GFP基因的表达紫外灯下各组绿色荧光蛋白

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5.粗提取1.挑取鉴定正确的单菌落接入LB培养基2.扩大培养3.IPTG诱导表达4.将菌液进行离心，收集菌体5.洗涤菌体，超声破碎，离心，取上清。访谈结果与析

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预期结果

提取质粒加入溶液Ⅰ浑浊；加入溶液Ⅱ变澄清加入溶液Ⅲ出现白色絮状沉淀加入氯仿抽提溶液分层访谈结果与析

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预期结果酶切产物鉴定——GFP基因访谈结果与析

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预期结果

重组质粒的鉴定访谈结果与析

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预期结果

重组质粒转化涂板阴性对照阳性对照访谈结果与析

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预期结果绿色荧光蛋白菌落参考文献：[1]ShimomuraO,JohnsonFH,SaigaY.Extraction,purificationandpropertiesofaequorin,abioluminescentproteinfromtheluminoushydromedusan,Aequorea[J].JCellComoPhysiok,1962,59:223-239.[2]KainSR,AdamsM,KondepudiA,etal.Greenfluorescentproteinasareporterofgeneexpressionandproteinlocalization.biotechniques,1995,19(4):650[3]PhillipsGJ.Greenfluorescentprotein-abrightideaforthestudyofbacterialproteinlocalization.FEMSmicrobialLett,2001,204(1):9[4]ChalfieM,Tu,EKivchenG,etal.Greenfluorescentproteinasamarkerforgeneexpression.Science,1994,263(5148):802[5]ChalfieM.Greenfluorescentprotein.PhotochemPhotobiol,1995,62(4):651[6]LarrickJW,BalintRF,YouvanDC.Greenfluorescentprotein:untappedpotentialinimmunotechnology.Immunotechnology,1995,1(2):83参考文献：[7]萨姆布鲁克J，弗里奇EF，曼尼阿蒂斯T.分子克隆实验指南[M].金冬雁，黎孟枫，译.2版.北京：科学出版，1995.[8]杜祯,马海利,陈瑞芳.工程菌DH-5α感受态细胞的制备及质粒pGEM的转化研究中国畜牧兽医,2007年第34卷第5期[9]NucP.NucK.RecombinantproteinproductioninEscherichiacoli[J].PostepyBiochem,2006,52(4):448-456.[10]DongX,TangB,LiJ,etal.ExpressionandPurificationofIntactandFunctionalSoybean(Glycinemax)SeedFerr