微生物的生长

第四章微生物的生长一、微生物的生长二、微生物生长的测定方法第一节微生物生长的测定

单细胞微生物也有个体生长和细胞分裂繁殖这两个过程。多细胞微生物的个体生长则反映在个体的细胞数目和每个细胞内物质含量的增加。

在实际工作中，单个微生物细胞太小，研究单个微生物细胞的生长比较困难，并且也无意义。

微生物的生长是指微生物个体或群体细胞各组成成分按比例、有规律地不可逆增加的过程。微生物的生长表现在微生物个体的生长和群体生长2个水平。一、微生物的生长个体生长

个体繁殖

群体生长群体生长=

个体生长

+

个体繁殖

所以，微生物的生长通常是指微生物的群体生长！！也就是说：微生物的生长过程包含了微生物的繁殖过程。

在实际工作中，测定微生物细胞生长的方法可以分为两类。生长的

测定方法

细胞计数法细胞生物量的测定

直接计数法计数器测定法平板菌落计数法

比浊法最大概率数法

间接计数法涂片计数法细胞的自动计数法干重法含氮量测定法（一）、细胞计数法

镜检计数法适用于单细胞微生物数量的测定。测定时需借助计数板和显微镜。

细胞较小的细菌可采用比得罗夫—霍瑟细菌计数板，细胞较大的酵母菌、真菌孢子和血细胞则采用血球计数板。1、直接计数法（1）计数器测定法快速简便，但不能区别死活菌体，测得的是总菌数。利用直接计数法测定微生物细胞数量时，菌悬液浓度不宜太低或太高（常大于106个/ml）。（2）涂片计数法将已知体积的待测样品，均匀的涂布在载玻片的已知面积内，经固定染色后，在显微镜下选择若干个视野计算细胞数量。

每个视野可用镜台测微尺测量直径并计算面积，从而推算出单位体积样品中所含的细胞数量。（3）细胞的自动计数法用电子细胞计数器来计数。电子计数是通过测定一个小孔中液体的电阻来进行。小孔仅能通过一个细胞，当细胞通过这个小孔时，电阻明显增加，并作为一个脉冲记录在一个电子标尺上。使一份已知体积含有待测细胞的液体通过这个小孔，当每个细胞通过时就被计数了。2、间接计数法（1）平板菌落计数法

将待测液按10倍递增做一系列稀释，然后选择其中某连续三个稀释度的菌液作涂布平板或倾注平板，在一定的条件下培养，那么分散的每一个细胞都将发育成一个菌落，再对平皿中菌落计数就可以推算出原始样液中的活菌数。测得的是活菌数，手续繁杂，容易受影响

该方法主要是依据在适当的稀释度下，每一个微生物细胞可以繁殖成一个菌落，通过测定菌落的数量即可来推算菌悬液中的活菌数。优点：测定的是活菌数。缺点：操作烦琐，时间长N=每套平板的平均菌落数×稀释倍数÷取样体积数（2）最大概率数法

将一定量的稀释液接种到新鲜合适的培养基上以后不出现繁殖为止。再选择三个连续稀释度作试管培养，根据出现生长的管数，查找已编好的MPN（最大概率表），就可以计算出单位体积样品中细胞的近似数。（1）比浊法

是一种快速测定菌悬液中微生物细胞数量的方法。当光线通过菌悬液时，由于菌体细胞不能透光，会造成透光率下降。在一定的浓度范围内，微生物细胞浓度与菌悬液的光密度（OD值）成正比，与透光度成反比。因此，可预先测定菌液浓度与OD值之间的关系曲线，然后可据此查得未知样品中菌的相对数量。（二）测定细胞或原生质总量的方法此法简单快速，但颜色不能太深，不能含有颗粒性杂质。2、干重法

取一定量的菌液，用离心或过滤的方法将菌体分离出来，清洗后置于80~100℃烘箱中烘干至恒重或在60℃真空干燥至恒重后称其重量。一般细菌干重约为湿重的20%~25%。

适用于含菌量高但不含其他溶性杂质的样品。蛋白质是细胞的主要组分，氮又是蛋白质的重要组分，且氮的含量是相对稳定的，因此，可以借菌体含氮量来间接表示菌体的含量。

3、总氮量测定法

适用于菌体浓度较高的样品，一般只适合研究工作。第二节细菌的生长曲线一、单细胞微生物的生长曲线二、掌握微生物生长规律对工业生产的指导意义一、单细胞微生物的生长曲线

细菌细胞虽小，但与其他生物细胞或个体一样，也有从小到大的生长过程。

将少量的细菌纯培养物接种到恒定体积的液体培养基后，定时取样测定培养基中的细胞数量，可以发现细菌的群体生长具有一定的规律。

若以时间作横坐标，以活菌数的对数值作纵坐标，可以绘制出一条类似于S型的曲线，称为细菌的生长曲线。

缓慢期对数期稳定期衰亡期t0lgN1、缓慢期（延迟期）

当细菌接种到新鲜的培养基后，细菌往往不会立即繁殖，需要经过一定时间来调节自身的生理机能，以适应新环境。因此，在曲线开始的一段时间，细胞数量几乎不增加，生长速率趋近于零，曲线平缓。特点：这个时期的长短与菌种的遗传性、菌龄、接种菌量、培养条件等因素有关。缓慢期对数期稳定期衰亡期t0lgN2、对数期（指数期）

细菌在完全适应新环境后，细胞开始转入旺盛生长，生长速率达到最大值，细胞呈几何级数（2n）增加，进入对数期。特点：对数期，培养条件相同时，不同菌种的代时（即繁殖一代所需要的时间）是不相同的，相同菌种的代时则是稳定的；培养条件不同时，同一菌种的代时也是不同的。此外，对数期的菌体整齐、代谢活跃、生长快、染色均匀，群体中的细胞化学组成、形态、生理特征比较一致。缓慢期对数期稳定期衰亡期t0lgN3、稳定期（平衡期）

在对数期以后，由于营养物质逐渐消耗，有害代谢产物积累，pH值变化等，使细胞生活力下降，细胞的繁殖速率开始下降，而死亡率上升，当二者趋于平衡时，群体的活菌数达到最高并保持一段时间的相对稳定。特点：处于稳定器的菌体形态大小典型，生理生化反应相对稳定，细胞开始积累贮存物质，如肝糖、异染颗粒、脂肪粒等，大多数芽孢菌在这个生长阶段形成芽孢。抗生素和某些酶类也在对数期和稳定期转换阶段产生。

缓慢期对数期稳定期衰亡期t0lgN4、衰亡期稳定期后如果继续培养，菌体就会出现变形、自溶等现象，死亡率逐渐增加，活菌数迅速减少，这一阶段称为衰亡期。二、掌握微生物生长规律对工业生产的指导意义（一）缩短缓慢期（二）延长对数期（三）控制稳定期（四）推迟衰亡期

微生物生长是微生物自身的遗传特性和外界环境因素共同作用的结果。在一定限度内，环境因子的变化，可导致微生物的形态、生理或遗传特性的变化，但如果环境因子的改变超过了一定限度，则会造成微生物细胞的死亡。当然，微生物也可在一定程度上通过自身的代谢活动来改变环境条件，使之更适应其生存和发展。

影响微生物生长的环境因素较多，概括起来有三大类，包括物理、化学和生物因素。第三节微生物生存环境条件环境因素温度

水分和渗透压

pH值

氧气和Eh

辐射线

超声波

化学药剂

物理因素化学因素生物因素一、温度

温度是微生物生长的重要环境条件之一，不同微生物的生长繁殖都需要一定的温度范围，表现为最低、最适和最高生长温度（即温度三基点）。

1、微生物的生长温度范围

根据微生物对温度的要求和适应能力，可将其分为嗜冷、嗜温和嗜热微生物三种类型：微生物类型最低(℃)最适(℃)最高(℃)生活环境嗜冷

微生物

专性

-12

5—15

15—20生活于两极地区

兼性

-5—0

10—20

25—30

海水及冷藏食品

嗜温

微生物

室温

10—20

25—3040—45

土壤中、植物体内等环境体温

10—20

37—40

40—45

人及温血动物体内等环境嗜热

微生物

专性25—45

50—5570—90生活于堆肥、温泉、土壤表层等高温环境中

2、温度对微生物的作用

（1）最低生长温度对微生物的影响

最低生长温度是微生物生长的温度下限，低于此温度，微生物的生长就会受到抑制，但一般不会死亡。因此，可以利用低温来保藏微生物或者保藏食物，常用的保藏温度为4-8℃。

从最低生长温度到最适生长温度，随着温度的上升，细胞的代谢活性增强，生长速率加快。

（2）最适生长温度对微生物的影响

最适生长温度是微生物生长速度最快的温度，但并非微生物代谢的最适温度。

如：乳链球菌最适生长温度是34℃，细胞总量最高的温度是25-30℃，而发酵速度最快温度则为40℃，乳酸产量的最高温度是30℃。

（3）最高生长温度对微生物的影响

微生物在最高温度下仅有微弱生长，而当环境温度超过微生物生长的最高温度后，将导致微生物细胞结构的不可逆破坏，蛋白质、酶、核酸变性，最终将杀死微生物。

通常将能在10分钟内杀死微生物的温度称为致死温度。

高温可以导致微生物细胞死亡，因此，可以利用高温来灭菌。

多数细菌、酵母菌、真菌和病毒的致死温度为55-60℃；放线菌和真菌的孢子抗热性比其营养细胞强，在75-80℃时，10分钟才会被杀死；细菌的芽孢具有高度的耐热性，可以耐受100℃的高温；极少数细菌，如嗜热脂肪芽孢杆菌在70℃下可以生长，芽孢在121℃加热12分钟才会死亡。致死温度：3、高温灭菌的方法

干热灭菌

湿热灭菌

焚烧

恒温干燥法

（耐热的金属和玻璃器皿、可燃烧的物品）

（常用，140-160℃，2h；耐热的物品）

煮沸

巴斯德消毒法间歇灭菌

高压蒸汽灭菌

超高温灭菌（100℃，15min以上；不耐热的物品）

（常用，0.2Mpa，121℃，20min；一般培养基、水、纤维制品）

（0.05MPa，110℃，20min；含糖培养基）

（60-70℃，15-20min；食品、饮料等）（100℃，每次2-3h，2-3次；不耐高温的药品，特殊培养基）

（130—140℃，0.5—1s，液体的饮料等）

二、水分和渗透压

微生物细胞的含水量一般为70-90%，孢子或芽孢的含水量较低，只有60-70%。水分是微生物细胞代谢活动必不可少的条件，如果外界环境过于干燥，将影响微生物的正常代谢，甚至会造成细胞死亡。

当环境中缺水或大气相对湿度低于70%时，微生物细胞的生长会受到抑制。因此，可以借用干燥的方法来保存食品和物品。

除缺水会直接影响微生物的生长外，当环境中渗透压发生改变时，也可能导致细胞发生生理性缺水，使细胞不能进行正常的生长代谢。因此，可用蜜饯或盐渍的方法保存食品。

超声波是指振动频率超过2万Hz的声波。通过剧烈的振动，使细胞破裂，引起细胞内含物外泄死亡。

超声波的破碎效果与处理功率、频率、处理时间、微生物类型和生理状态等因素有关。

在研究工作中，常用超声波来破碎细胞。但超声波处理时会释放大量的热能，所以，必须在冰浴中进行，并作短时间的多次处理。三、超声波(一)pH值

环境的pH值对微生物的生长有较大的影响。微生物可在pH1-11的范围内生活，但不同的微生物对pH值的适应性有较大的差异。大多数细菌、放线菌的最适pH值为7.0-8.0，适应范围5.0-10.0，真菌的最适pH值多为3.0-6.0。

pH值的改变常造成微生物代谢途径的改变，并形成不同的代谢产物。

微生物也可以通过自身的代谢活动改变环境的pH值，因此控制发酵液的pH是控制生产的指标之一。常用方法：加入缓冲物质、适时加无机酸碱或生理活性物质等。应用pH的杀菌：强酸、强碱具有很强的杀菌力，但无机酸碱对人和器皿的腐蚀性强，故很少采用。乳酸、醋酸等有机酸对环境危害小，可用作防腐剂。石灰常用于环境卫生的消毒。

（二）氧气

氧气对微生物生长的影响也较大。

不同的微生物对氧气的需求不同，根据微生物对氧气的要求，可以将微生物分为五大类：好氧微生物

厌氧微生物

兼性厌氧微生物

微好氧微生物

耐/忌氧微生物

微生物极少单独存在，总是较多种群聚集在一起，当微生物的不同种类或微生物与其他生物出现在一个限定的空间内，他们见互为环境，表现出复杂的关系：（一）寄生（二）互生（三）共生（四）拮抗三、生物因素对微生物生长的影响二、化学消毒剂

不同的化学药剂对微生物生长的影响是不同的。大多数化学药剂只有在高浓度时才起杀菌作用，低浓度仅为抑菌作用，而极低浓度则没有作用或对微生物的生长有促进作用。

化学药剂对微生物的作用取决于药剂浓度、作用时间和微生物对药物的敏感性等。研究表明化学药剂对微生物的作用主要表现为三方面：（1）破坏细胞结构，如苯酚、乙醇。（2）干扰细胞能量代谢，如重金属、CO和氰化物。（3）干扰物质合成，如磺胺、氨基酸结构类似物。

根据化学药剂的性质和使用目的，可分为五种类型：

有机化学药剂无机化学药剂染色剂表面活性剂

化学治疗剂三、紫外线和射线

在环境中存在着各种能量的辐射线，不同能量的辐射线对微生物生长的影响不相同的。可见光波长397-800nm，是光能自养型和光能异养型微生物唯一的或主要的能量来源。1、紫外线（UV）

紫外线是波长为100-397nm的非电离辐射线，具有较强的杀菌和诱变作用，其最强的作用波长是265-266nm，这也是微生物细胞核酸的最大吸收波长。

紫外线主要作用于细胞DNA，使相邻的胸腺嘧啶形成二聚体、使DNA断裂或发生交联，最终使微生物细胞变异或死亡。另外还可促使氧形成臭氧。

通常低剂量的UV可用于诱变育种，而高剂量的UV可杀菌，但其穿透力较弱，一般仅用作空气、无色的水和器皿表面的灭菌。1.SPF值：一般类型皮肤的人8～12为宜；对光敏感的人12－20为宜；敏感性皮肤应挑选植物配方的防晒品或是含有二氧化钛的物理性防晒霜；只在上下班的路上接触阳光的上班族，15以下即可，以脸部防晒为主；在野外游玩、海滨游泳时30以上。游泳时最好选用防水的防晒护肤品。2.PA值：PA+有效防护时间大约4小时。PA++有效防护时间大约8小时。PA+++超强防护。2、电离辐射

电离辐射是高能电磁波，包括X-射线、α-射线、β-射线和γ-射线。这些射线的特点是波长短，能量大，穿透力强，杀伤力大。对微生物有致死作用。常用的高能射线是利用60Co源产生的γ-射线。可用于不耐热食品、塑料制品和草炭吸附剂的灭菌。激光有强烈杀菌能力的波长是在250~800nm间，特别是265nm波长最有效。微波是频率在3×102~3×105MHz的电磁波。3、激光与微波四、接种室的空气灭菌五、过滤除菌六、防霉剂1、有机化学药剂（1）酚及其衍生物

酚类化合物是医学上常用的消毒剂，其作用主要是损伤微生物的细胞膜，钝化酶和使蛋白质变性。苯酚的有效杀菌浓度为2-5%，但因具有难闻的气味和对皮肤的强烈刺激性，很少在临床上使用。甲酚、间苯二酚等苯酚衍生物的刺激性小，杀菌作用较强，常用于医院对痰液、粪便及手术前的消毒。煤皂酚（来苏尔）是乳化的甲酚溶液，常用3-5%的煤皂酚来消毒桌面、用具等。

（2）醇类

可通过细胞膜中的类脂而破坏膜结构，并使蛋白质变性，但对芽孢和无囊膜病毒的作用效果较差。70%的乙醇杀菌力最强，常用于皮肤的消毒。加入1%的碘可使其杀菌力大大的增强。异丙醇的杀菌力较乙醇强，挥发性低，常用于皮肤和用具的消毒。

（3）醛类

醛可与蛋白质的多种基团发生共价结合而使之变性。37-40%的甲醛溶液俗称福尔马林，常用于保存生物标本。实验室用0.5-10%的甲醛溶液，加热熏蒸进行空气消毒。其缺点是对眼睛和粘膜具有刺激性，穿透力较差，作用慢，气味难闻。戊二醛的刺激性和异味均较小，杀菌力强，在3-10h内可杀死细菌芽孢，常用2%戊二醛消毒医疗器械和用具。

（4）酸类

有机酸能抑制微生物酶和代谢活性，对人毒性小，常加入食品、饮料和化妆品中，以防止霉菌生长。山梨酸钾，苯甲酸钠等常用于食品防腐。

可用5~10ml/m2的醋酸来熏蒸灭菌，所以酿醋的工人很少感冒。（5）新型有机化学杀菌剂

环氧乙烷是目前广泛应用的一种新型空气和器械表面消毒剂，可使蛋白质变性，能在4~18小时内杀死微生物细胞和芽孢，常用于不耐热物品的消毒，但缺点是毒性大、纯品易爆，使用时需与CO2和N2混合使用。

2、无机化学药剂

主要包括卤化物、重金属、氧化剂、无机酸和碱等。

常用碘和氯。（1）卤化物碘可与酶或蛋白中的酪氨酸结合，对各类都有较好的杀菌作用。碘酒可用于皮肤、伤口和粘膜表面的消毒。氯包括氯气和氯化物，可用作饮水、游泳池、垃圾场器具的消毒。氯气和氯化物的杀菌作用在于产生次氯酸和原子氧，初生态的原子氧是强氧化剂，能破坏细胞膜，杀死微生物。

（2）重金属及其化合物

重金属离子具有很强的杀菌效力，以Hg+、Ag+和Cu2+的作用最强。重金属离子进入细胞后可与酶和蛋白质上的巯基（-SH）结合，使之失活或变性。汞的化合物中常用的是0.1%的升汞（氯化汞）和有机汞，如红汞、硫柳汞等。由于无机汞毒性较大，并具有残留毒性，因此无机汞化物只用于种子表皮和器皿表面的消毒。有机汞毒性较小，可用于伤口和皮肤表面的消毒。银的化合物以硝酸银应用较多，0.1~1%的浓度可用作滴眼剂和皮肤消毒剂。铜的化合物使用最多的是硫酸铜，一般用1ppm的硫酸铜防止藻类在清洁水体中生长。波尔多液是硫酸铜与生石灰（CaO）的混合液，可用于防治农作物的真菌病害。

（3）氧化剂

氧化剂主要通过对细胞成分的氧化作用来达到杀菌的目的。常用的有0.1%的高锰酸钾和3%的过氧化氢。臭氧的氧化性非常强，可用于饮水的消毒，但目前的成本比较高。

3、染色剂

许多生物染色剂在低浓度下具有明显的抑菌效果和一定的特异性。碱性染料的阳离子基团可与蛋白质氨基酸上的羧基或核酸上的磷酸基团结合，从而阻断正常细胞的代谢过程。

常用的有结晶紫、吖啶黄等碱性染料。G+细菌对碱性染料十分敏感，结晶紫在3~10ppm即可抑制G+细菌的生长，而对G-细菌的抑制浓度达到100ppm。

4、表面活性剂

表面活性剂是指可降低液体分子表面张力的化学物质，如肥皂、洗衣粉等。表面活性剂能够影响细胞膜的稳定性和透性，使细胞的某些必要成分（如K+）流失而引起微生物生长停滞并死亡。肥皂和洗衣粉等阴离子表面活性剂的杀菌力不强，主要通过洗涤来减少微生物的数量。季胺类阳离子表面活性剂具有