紫外分光光度法测定核苷酸含量

生物化学实验：

核酸的紫外扫描及含量测定实验目的1.了解紫外分光光度计的基本原理并掌握其使用方法。2.掌握使用紫外分光光度法测定核酸含量的原理和方法。实验原理

核酸、核苷酸及其衍生物都具有共轭双键，具有紫外吸收。RNA和DNA的紫外吸收峰为260nm。一般在260nm波长下，每毫升含1mgDNA溶液的光吸收值约为0.020，每毫升含1mgRNA溶液的光吸收值为0.022。故测定待测浓度RNA或DNA溶液260nm的光吸收值即可计算出其中核酸的含量。此法操作简便，迅速。若样品内混杂有大量的核苷酸或蛋白质等能吸收紫外光的物质，则测定误差较大，故应设法事先除去。纯净的RNA溶液，其A260/A280≥2；纯净的DNA溶液，其A260/A280≥1.8。

实验原理如果已知待测的核酸样品不含酸溶性核苷酸或可透析的低聚多核苷酸，即可将样品配制成一定浓度的溶液(20～50mg/mL)，在紫外分光光度计上直接测定。

蛋白质由于含有芳香氨基酸，因此也能吸收紫外光。通常蛋白质的吸收高峰在280nm处，在260nm处的吸收值仅为核酸的十分之一或更低，故核酸样品中蛋白质含量较低时对核酸的紫外测定影响不大。

RNA在260nm与280nm处的吸收比值在2.0以上，DNA的比值则在1.9左右。当样品中蛋白质含量较高时，比值即下降。实验器材1.UV-1000型紫外可见分光光度计操作指南：1.打开仪器电源，系统自检，并预热20min。2.选择“光度测量”，按“enter”进入吸光度测量。3.关上暗盒盖，将装参比液的比色皿，推入光路中，按“enter”进入后，系统自动调整投射比为100%和0%。4.关上暗盒盖，将装参比液的比色皿，推入光路中，按“zero”键调使吸光度A为0.000。5.测量样品。将被测溶液推入光路中，待读数稳定后，读取吸光度。6.仪器使用完毕，取出比色皿，洗净、晾干。7.关闭电源开关，拔下电源插头，复原仪器。8.登记《仪器使用记录表》关于比色皿：比色皿的前后有2个光滑面，是用来对准光路的，左右有2个粗糙面，手只能拿比色皿的粗糙面，不能接触光滑面。比色皿的内部的清洗只能用蒸馏水润洗（用洗瓶），不可用卫生纸或其他物品捅进去擦洗，比色皿的2个光滑面一定要保持清洁，如发现有指纹或残液，须用卫生纸轻轻擦拭干净。比色皿是成套发放的，严禁混用，本实验使用的是石英比色皿。使用完毕后先用自来水内外冲洗干净比色皿，再用洗瓶冲洗比色皿的内外表面1次，将其粗糙面朝下斜靠在培养皿中。2.取样器：参见实验一，10uL、200uL各1支/组。

使用指南：接好套头（不漏气）→通过旋钮调节容量（如500表示5mL）→用活塞第一挡吸液→用活塞第一挡和第二挡放液→换套头→继续使用。注意，平时取样器应挂在架子上，绝不可倒置，以免溶液倒流入枪体中而损坏仪器。3.其他器材：试管，试管架、烧杯、卫生纸。实验试剂1.

蒸馏水

2.

待测的DNA溶液样品测定：1.取两个比色皿，一个加蒸馏水做空白对照。一个用来加DNA样品。2.取10uL的DNA样品,加入90uL的蒸馏水稀释10倍。进行测定含量。4．清洁紫外分光光度计（尤其是比色槽内）、清洗比色皿，整理好桌面上的仪器和试剂。数据处理第一组：试管1234567标准DNA溶液（ml）00.10.20.40.60.81蒸馏水（ml）54.94.84.64.44.24A26000.0270.0530.1210.1700.2550.324λ（nm）

240250260270280290A0.1780.2250.3230.2640.1850.081λm260

试管1234567A26000.0270.0530.1210.1700.2550.324

试管8对应于标准DNA溶液的毫升数V1.9ml

待测的DNA溶液的浓度（μg/ml）38μg/ml由公式V*100/5计算待测DNA溶液的A260/A2801.8待测的DNA溶液是否纯净不纯净第二组：试管1234567标准DNA溶液（ml）00.10.20.40.60.81蒸馏水（ml）54.94.84.64.44.24A26000.0400.0690.1320.2100.2640.309λ（nm）240250260270280290A0.1770.2650.3090.2560.1710.080λm260试管8对应于标准DNA溶液的毫升数V1.91ML待测的DNA溶液的浓度（μg/ml）38.1A260/A2801.76待测的DNA溶液是否纯净不纯净第三组：试管1234567标准DNA溶液（ml）00.10.20.40.60.81蒸馏水（ml）54.94.84.64.44.24A26000.0360.0640.1200.1730.2620.298λ（nm）240250260270280290A0.1740.2680.2980.2590.1670.079λm260试管8对应于标准DNA溶液的毫升数V1.97ML待测的DNA溶液的浓度（μg/ml）39.4A260/A2801.77待测的DNA溶液是否纯净不纯净思考题1.若样品中含有蛋白质，应如何排除干扰？答：当样品中蛋白质含量较高时，将样品移到试管中，加入一定量的吸烟溶液，用玻璃棒小心搅拌，使蛋白沉淀，滴加少量