酶促反应动力学

生物化学酶的动力学张秀华酶化学之二1酶化学之二§6.4酶促反应动力学§6.5酶的分离提纯及活力测定§6.6重要的酶类§6.7酶在医药学上的应用2重点掌握：酶促反应动力学-米氏方程，温度、pH、激活剂、抑制剂对酶促反应速度的影响；掌握三种可逆抑制作用的动力学特点；了解：过渡态底物类似物对酶的抑制作用以及多酶体系、别构酶、共价调节酶、同工酶、固定化酶的概念。熟悉：酶的分离提纯的一般方法；酶活力、比活力的概念及其测定方法。【目的与要求】3Section4KineticsofEnzyme-CatalyzedReaction

第四节酶促反应动力学4

酶促反应动力学(kineticsofenzyme-catalyzedreactions)是研究酶促反应速度及其影响因素的科学。酶促反应的影响因素：酶的浓度、底物的浓度、pH、温度、抑制剂和激活剂等。在探讨各种因素对酶促反应速度的影响时，通常测定其初始速度来代表酶促反应速度，即底物转化量<5%时的反应速度。

5

1902年，Henri用蔗糖酶水解蔗糖的实验中观察到：在蔗糖酶浓度一定的条件下测定底物（蔗糖）浓度对酶反应速度的影响,它们之间的关系呈现矩形双曲线(rectangularhyperbola)。如下图所示：一、底物浓度对酶反应速度的影响6在底物浓度很低时，反应速度随底物浓度的增加而急骤加快，两者呈正比关系，表现为一级反应。

7随着底物浓度的升高，酶逐渐被底物饱和，反应速度不再呈正比例加快，反应速度增加的幅度不断下降。该阶段为混合级反应。8如果继续加大底物浓度，反应速度不再增加，表现为零级反应。此时，无论底物浓度增加多大，反应速度也不再增加，说明酶已被底物所饱和。9为解释酶被底物饱和现象，德国化学家Michaelis和Menten做了大量的定量研究，积累了足够的实验数据，提出了酶促反应的动力学方程：10为解释酶被底物饱和现象，德国化学家Michaelis和Menten做了大量的定量研究，积累了足够的实验数据，提出了酶促反应的动力学方程：11根据中间产物学说：E+SESE+Pk2k1k3k4米氏方程是在三个假设的基础上建立的：1.反应初期，产物生成量极少，E+P→ES可忽略不计；2.[S]>>[E],[S]-[ES]≈[S]3.E与S迅速生成ES复合物，并达到平衡（稳态）即[ES]的生成速度等于[ES]的分解速度；（一）米氏方程12

ES的形成速度＝k1[E][S]ES的分解速度＝（k2＋k3）[ES]

稳态平衡下:[ES]的形成速度等于[ES]分解速度

k1[E][S]＝（k2＋k3）[ES]

即：[E][S]/[ES]=（k2＋k3）/k1=Km

[ES]=[E][S]/KmE+SESE+Pk2k1k3k413

[ES]=[E][S]/Km恒态时[E]=[E0]

－[ES]代入上式得：

[ES]=[E0]

[S]/(Km＋[S])

而酶促反应的生成速度即是产物的生成速度：

V＝k3[ES]=k3[E0]

[S]/(Km＋[S])

＝Vmax[S]/(Km＋[S])其中Vmax＝k3[E0]

即为酶促反应可达到的最大反应速度（[s]很大，E全部转为ES，[ES]=[E0],此时V=Vmax)

E+SESE+Pk2k1k3k414

Vmax指该酶促反应的最大速度，[S]为底物浓度，Km是米氏常数，VO是在某一底物浓度时相应的反应速度。从米氏方程可知：15当底物浓度很低时[S]<<Km，则V≌Vmax[S]/Km，反应速度与底物浓度呈正比16当底物浓度很高时[S]>>Km，此时V≌Vmax

，反应速度达最大速度，底物浓度再增高也不影响反应速度。17当=

Vmax／2时，Km=[S]。因此，Km等于酶促反应速度达最大值一半时的底物浓度。──Vmax2Vmax[S]

Km+[S]

=(二）米氏常数（Km）的意义和应用18Km可以反映酶与底物亲和力的大小：

Km

值愈大，酶与底物的亲和力愈小；Km值愈小，酶与底物亲和力愈大。酶与底物亲和力大，表示不需要很高的底物浓度，便可容易地达到最大反应速度。(二）米氏常数（Km）的意义和应用Km等于酶促反应速度达最大值一半时的底物浓度19Km

值是酶的特征性常数：与酶的性质，底物和酶促反应条件（如温度、pH、有无抑制剂等）有关，而与酶的浓度无关。酶的种类不同，Km值不同，同一种酶与不同底物作用时，Km

值也不同。各种酶的Km

值范围很广，大致在10-1～10-7M

之间。(二）米氏常数（Km）的意义和应用20Km在实际应用中的重要意义（1）判断酶的最佳底物：如果一种酶作用于不同底物，就有几个不同的Km值，其中Km最小对应的底物就是酶的天然底物。如蔗糖酶既可催化蔗糖水解(Km=28mmol/L),也可催化棉子糖水解(Km=350mmol/L)，两者相比，蔗糖为该酶的天然底物。21（3）判断反应方向或趋势：催化正逆反应的酶，其正逆两向的反应的Km不同，如果正逆反应的底物浓度相当，则反应趋向于Km小对应底物的反应方向。（2）计算一定速度下的底物浓度：如某一反应要求的反应速度达到最大反应速度的99%，则[S]=99Km22（4）反应激活剂或抑制剂的存在：酶不仅与底物结合，也可与其他配体结合（如激活剂、抑制剂）而影响Km值。因此，若发现某种酶在体外测定的Km值与体内差别较大，可以预料体内可能存在着天然激活剂降低了Km值或抑制剂提高了Km值。

同时也可用不同物质对Km值的影响，识别生理上有重要意义的调节物。23（三）Km的求法24（三）Km的求法25双倒数作图法双倒数方程直线斜率：Km/Vmax1/V的截距:1/Vmax1/[S]的截距：-1/K26二、pH的影响与最适pH大多数酶活性受pH影响显著，在某一pH下表现最大活力，高于或低于此pH，酶活力显著下降。酶表现最大活力的pH称为酶的最适PH。典型的最适pH曲线是钟罩型曲线，但有的酶速度-pH曲线并非一定呈钟罩型。27大多数酶的最适pH在5～8之间，但也有例外，如胃蛋白酶的最适pH约1.5，肝精氨酸酶最适pH约为9.8。一些酶的最适pH1.528

pH对酶促反应速度的影响机理：1、pH影响酶和底物的解离:

酶活性基团的解离和底物的解离状态都受pH影响，在某一反应pH下，二者的解离状态最有利于它们的结合，酶促反应表现出最大活力。2、pH影响酶分子的构象：过高或过低pH都会影响酶分子活性中心的构象，或引起酶的变性失活。29一般来说，酶促反应速度随温度的增高而加快。但当温度增加达到某一点后，由于酶蛋白的热变性作用，反应速度迅速下降，直到完全失活。三、温度的影响与最适温度30酶促反应速度随温度升高而达到一最大值时对应的温度就称为酶的最适温度(optimumtempe-rature)。三、温度的影响与最适温度31温度对酶促反应速度的影响机理32最适温度不是酶的特征常数，因为酶的最适温度受酶的纯度、底物、激活剂、抑制剂、酶反应时间等因素的影响。因此，酶的最适温度与其它反应条件有关。三、温度的影响与最适温度33四、酶浓度对反应速度的影响在一定温度和pH下，酶促反应在底物浓度大大超过酶浓度时，反应初速度与酶的浓度呈正比，即ν=k[E]

。34五、激活剂的影响能提高酶的活性，促使酶促反应速度加快的物质称为激活剂（activator）。酶的激活剂大多数是无机离子（K+、Mg2+、Mn2+、等）。能除去抑制剂的物质也可以称为激活剂，如乙二胺四乙酸（EDTA）（金属螯合剂）能除去金属杂质。通常，酶对激活剂有一定的选择性，且有一定的浓度要求，一种酶的激活剂对另一种酶来说可能是抑制剂，当激活剂的浓度超过一定的范围时，它就成为抑制剂。

35六、抑制剂的影响凡能使酶的活性下降而不引起酶蛋白变性的物质称为酶的抑制剂(inhibitor)。抑制剂对酶有一定的选择性，一种抑制剂只能引起某一类或几类酶的抑制。使酶变性失活（称为酶的钝化）的因素如强酸、强碱等，不属于抑制剂。按照抑制剂的抑制作用，可将其分为不可逆抑制和可逆抑制两大类。36抑制剂与酶分子的必需基团共价结合引起酶活性丧失，不能采用透析、超滤等方法除去抑制剂而恢复酶活力。按其作用特点，又分专一性不可逆抑制及非专一性不可逆抑制两种。（一）不可逆抑制371.非专一性不可逆抑制抑制剂与酶分子中一类或几类基团作用，不论是必需基团与否，皆可共价结合，由于其中必需基团也被抑制剂结合，从而导致酶的抑制失活。

381.非专一性不可逆抑制某些重金属（Pb2+、Cu2+、Hg2+）能与酶分子的巯基进行不可逆结合，许多以巯基作为必需基团的酶(通称巯基酶)，会因此而遭受抑制。用二巯基丙醇或二巯基丁二酸钠等含巯基的化合物可使酶复活。

39该抑制剂专一地作用于酶的活性中心或其必需基团，进行共价结合，从而抑制酶的活性。2.专一性不可逆抑制

40有机磷杀虫剂能专一作用于胆碱酯酶活性中心的丝氨酸残基，不可逆地抑制酶活性，使其失去水解乙酰胆碱（Ach）的作用，造成Ach大量蓄积，使一些以乙酰胆碱为传导介质的神经系统处于过度兴奋状态，引起神经中毒症状。2.专一性不可逆抑制

41（二）可逆抑制作用抑制剂与酶以非共价键结合，用透析等物理方法除去抑制剂后，酶的活性能恢复，即抑制剂与酶的结合是可逆的。可逆抑制作用包括竞争性抑制、反竞争性抑制和非竞争性抑制几种类型。

421.竞争性抑制(competitiveinhibition)抑制剂(I)和底物(S)对游离酶(E)的结合有竞争作用，互相排斥，已结合底物的ES复合体，不能再结合I。同样已结合抑制剂的EI复合体，不能再结合S。(1)含义和反应式43竞争性抑制44Km

（1+）＋〔S〕〔I〕KiVmax〔S〕Vi＝（2）竞争性抑制剂的动力学方程45

竞争性抑制剂双倒数曲线，如下图所示：46有I存在时，Km值增大Vmax值不变，Km/Vmax增大。Kmapp随[I]浓度增大而增大。抑制程度取决于[I]与[S]，[I]越大，则抑制作用越大；但增加[S]可使抑制作用减弱甚至消除。（3）竞争性抑制动力学特点47磺胺类药物对二氢叶酸合成酶的竞争性抑制

对氨基苯甲酸磺胺类+二氢蝶呤啶+对氨基苯甲酸谷氨酸FH2合成酶FH248

FH2能转变为FH4，它是细菌合成核酸不可缺少的辅酶。由于磺胺药是FH2合成酶的竞争性抑制剂，进而减少细菌体内四氢叶酸的合成，使核酸合成障碍，从而抑制细菌的生长和繁殖。+二氢蝶呤啶+对氨基苯甲酸磺胺类谷氨酸FH2合成酶FH2磺胺类药物对二氢叶酸合成酶的竞争性抑制

49磺胺药物的抑菌作用50I和S与E的结合互不相关，既不排斥，也不促进。S可与E结合，也可与EI复合体结合；I可与E结合生成EI，也可与ES复合物结合生成ESI。一旦形成ESI复合物，再不能释放形成产物P。2.非竞争性抑制(non-competitiveinhibition)51非竞争性抑制动力学图Vm[S]·v=(Km+[S])(1+[I]Ki）52非竞争性抑制动力学图V1/Vmax1/Vmax（1+[I]/Ki)Vmax=appVmax1+[I]/Ki53Km不变，Vm减小；Km/Vmax增大。

随[I]的增加而减小；抑制程度与[I]成正比，而与[S]无关。非竞争性抑制的动力学特点VmaxappVmax=appVmax1+[I]/Ki543.反竞争性抑制（uncompetitiveinhibition)反竞争性抑制剂不能与游离酶结合,

而是与ES结合成EIS，并阻止产物生成，称酶的反竞争性抑制。55酶561Vi＝KmVmax1〔S〕+1Vmax〔I〕Ki(1+)Vi＝Vmax〔S〕〔S〕〔I〕Ki（1＋）Km＋反竞争性抑制动力学图Km1-（1+Ki[I])57当I存在时，Km和Vmax都减小，Km/Vmax不变；表观Km和Vmax都随[I]的增加而减小。抑制程度与[I]、[S]均成正比。反竞争性抑制的特点Vmax=appVmax1+[I]/KiKm=appKm1+[I]/Ki5859某种类似于一个酶促反应中底物的过渡态的物质是酶的有效抑制剂，这种物质称为过渡态类似物。酶的自杀底物是一类酶的天然底物的衍生物或类似物。（三）过渡态类似物与自杀底物60在自杀S的结构中含有一种化学活性基团，当E把它们作为底物来结合时，其潜在的化学基团能被解开或激活，并与酶的活性部位发生共价结合，使结合物停留在某种状态，从而不能分解成产物，酶因而致“死”，此过程称为酶的自杀，这类底物称为自杀底物(suicidesubstrate)。（三）过渡态类似物与自杀底物61第五节酶的分离、提纯和活性测定Section5theseparation,purificationandmeasurationofactivityofenzyme62

一、酶的分离提纯胞外酶：水解酶类，易收集，不必破碎细胞，缓冲液或水浸泡细胞或发酵液离心得到上清液即为含酶液。

胞内酶：除水解酶类外的其它酶类，需破碎细胞，不同的酶分布部位不同，最好先将酶存在的细胞器分离后再破碎该细胞器，然后将酶用适当的缓冲溶液或水抽提。酶在细胞中的分布：63分离提纯的原则选择酶含量丰富的材料避免蛋白质变性：避免强酸、强碱，低温每一步骤，都要测定酶的总活力和比活力64每一步都要测定酶的纯度(比活力)并计算纯化倍数和产率以决定该步骤的效益和取舍。酶的比活力(纯度)=活力单位数/毫克蛋白纯化倍数=每次比活力/第一次比活力产率=(每次总活力/第一次总活力)×100%纯化分离提纯的步骤选材-破碎细胞-抽提-纯化-保存65二、酶的活力测定(定量)

酶的活力:一般把酶催化一定化学反应的能力称为酶活力。

酶的活力大小的表示：在一定条件下E所催化的某一化学反应的速度，一定量的酶制剂催化某一化学反应速度快，活力大；反之，活力小。66酶活力单位:最适条件下,单位时间内,酶催化底物的减少量或产物的生成量。

1961年国际酶学委员会统一规定1个酶活力国际单位（1U）:特定条件下,1分钟内生成1微摩尔/升产物的酶量(或转化1微摩尔底物的酶量)。

1972年国际酶学委员会又推荐一种新单位，即Katal(Kat)单位：最适条件下,每秒钟可使1mol/L底物转化的酶量。即1Kat=6×107IU67第六节重要的酶类一、寡聚酶(oligomericenzyme)含有2个以上的亚基，分子量大（35000以上）。可分为含相同亚基的寡聚酶和含不同亚基的寡聚酶。含不同亚基的寡聚酶的不同亚基执行不同的功能。催化功能和底物载体的功能。68二、同工酶(isoenzyme)概念：

催化相同的化学反应，但分子结构、理化性质乃至免疫学性质不同的一组酶。

存在于同一种属或不同种属，同一个体的不同组织、同一细胞的不同亚细胞结构中。乳酸脱氢酶（LDH）是研究的最多的同工酶，具有多种分子组成形式：LDH5（M4）、LDH4（M3H）、LDH3（M2H2）、LDH2（MH3）、LDH1（H4）。69乳酸脱氢酶同工酶形成示意图多肽亚基mRNA四聚体结构基因ab乳酸脱氢酶同工酶电泳图谱+–H4MH3M2H2M3HM4点样线70不同组织中LDH同工酶的电泳图谱LDH1(H4)LDH2(H3M)LDH3(H2M2)LDH4(HM3)LDH5(M4)心肌肾肝骨骼肌血清-+原点71四、调节酶

该类酶分子中有活性区和调节区，其催化活力可因与调节剂的结合而改变，有调节代谢反应的能力。分为共价调节和变构调节。72（一）共价调节酶调节剂通过共价键与酶分子结合,以增减酶分子上的基团来改变酶的活性(高/低,有/无)。

常见类型磷酸化与脱磷酸化（最常见）乙酰化和脱乙酰化甲基化和脱甲基化腺苷化和脱腺苷化－SH与－S－S互变73变构酶又称为别构酶，分子中除活性中心外,还有别构中心(结合调节物或称效应剂)。变构效应:调节物与别构中心结合引起酶蛋白构象变化,使酶活性中心对底物的结合和催化作用受影响(改变酶活性),从而调节酶促反应速度。（二）变构酶74变构剂：凡能使酶分子发生别构作用的物质。变构激活剂:酶产生变构效应后，导致酶激