2015遗传学实验-细胞与

细胞与遗传实验

实验室要求点名穿白大衣课上保持安静爱护公物，实验完毕物归原处课后由值日生清洁实验室细胞与遗传实验课要求以小组形式完成系统性实验并作好实验记录按时完成实验报告（下次实验课交）

实验安排（进度）第1、2周活细胞观察、细胞传代培养、细胞计数第3、4周不同应激对细胞活力的影响及应激影响细胞活力的机制探讨第5、6周翻译文献、实验设计（作业)第7、8周Bax在不同细胞中表达差异的检测第9、10周微核检测、传代细胞染色体标本的制备第11、12周遗传病致病基因检测（DNA提取）第13、14周遗传病致病基因检测（PCR法）作业：查阅文献及翻译文献来自近两年的权威杂志，如Science、Cell、Nature等，及其子刊文献以不少于四页为好，不包括参考文献第4次实验课交实验（一）活细胞观察细胞传代培养细胞计数细胞培养

取活体动物组织，在体外，无菌条件下，模拟体内环境（营养、激素、渗透压、温度、pH值、气体），对其进行培养，使细胞能够生存、生长、繁殖并保持原来生物学特性的一种实验方法（原代、传代）。细胞培养内容细胞原代培养细胞传代培养细胞形态观察、活力测定细胞计数细胞生长曲线、分裂指数细胞冻存与复苏等等细胞全生存过程：原代、传代、衰退期细胞原代培养（PrimaryCulture）：在无菌环境下从机体取出某种组织细胞，经过一定的处理（如消化分散细胞、分离等）后接种培养器血中（取材），从机体取出的组织细胞的首次培养称为原代培养。幼体组织（尤其是胚胎组织）比成年个体的组织容易培养，分化程度低的组织比分化高的容易培养，肿瘤组织比正常组织容易培养

细胞传代：细胞在支持物表面长满后，进行重新分配，再培养的过程。（所谓细胞“一代”一词，系仅指从细胞接种到分离再培养时的一段时间，与细胞倍增一代非同一含义）传代后对培养中的细胞应每隔一定时间进行观察，肉眼、镜下观察：细胞是否生长良好，形态是否正常，有无污染，培养基的PH是否太酸或太碱（酚红），培养温度、CO2浓度等原代培养物开始第一次传代培养后的细胞，即称之为细胞系潜伏期（LatentPhase）：细胞悬浮-贴附—细胞可运动但基本无增殖，潜伏期时间长短与细胞接种密度、细胞种类和培养基性质等密切相关。指数生长期（LogarithmicgrowthPhase）：细胞增值最旺盛的阶段，以细胞分裂相数量可作为判定细胞生长旺盛与否的一个重要标志。一般以细胞分裂指数（MitoticIndex）表示，即细胞群中每100个细胞中的分裂相百分比数。接触抑制（ContactInhibition）：正常细胞有，恶性细胞无

密度抑制（DensityInhibition）停滞期（StagnatePhase）：细胞虽不增殖，但仍有代谢活动，直至将培养液中营养物消耗殆尽衰亡冻存、复苏细胞应在原代培养期或传代后早期冻存。当前世界上常用细胞均在不出十代内冻存。如不冻存，则需反复传代以维持细胞的适宜密度，以利于生存。但这样就有可能导致细胞失掉二倍体性质或发生转化。一般情况下当传代10～50次左右，细胞增殖逐渐缓慢，以至完全停止，细胞进入衰退期。细胞生长曲线：测定细胞绝对生长数的常用方法，也是判定细胞活力的重要指标。一般细胞传代之后，经过短暂的悬浮然后贴壁，随后度过长短不同的潜伏期，即进入大量分裂的指数生长期。在细胞达到饱和密度后，停止生长，进入平顶期，然后退化衰亡。细胞生长曲线可以准确描述整个过程中细胞数目的动态变化，以存活细胞数(万/mL)对应培养时间(h或d)作图，即得生长曲线。实验室基本条件无菌环境仪器设备普通器材一般试剂无菌环境无菌室无菌操作无菌室结构图back超静工作台二氧化碳培养箱液氮罐back

器材back

试剂back

无菌操作

无菌间及超净台消毒（紫外灯。。。。）洗手着装试剂瓶等斜放（超净台中物品摆放次序。。。）酒精棉消毒近火焰操作注意：不要将超净台中物品拿出。。。

一、活细胞观察体外培养的、生长中的细胞，借助显微镜来进行察看、比较、判断，以求对细胞做出进一步处理（换液？传代。。。）器材倒置显微镜培养细胞株方法肉眼观察显微镜下观察肉眼观察培养液清浊度（支原体、细菌、真菌。。。）培养液颜色显微镜下观察细胞的密度细胞的透明度（折光性。。。）细胞的形状L02细胞(人正常肝细胞)--细胞呈梭型贴壁生长A549---人肺癌细胞（倒置显微镜X10）------细胞呈梭形，有伪足，贴壁生长PC-12---大鼠肾上腺嗜铬细胞瘤细胞---倒置显微镜X10---细胞呈不规则形态，贴壁生长，生长速度快

人成骨肉瘤细胞Saos-2细胞--荧光显微镜40*--细胞多角形，贴壁良好

宫颈癌HeLa细胞---贴壁生长，呈多角形

B－NHL(非何杰金淋巴瘤细胞株)--荧光显微镜显微镜X40；Hoechst33258染色---细胞呈圆形，成团生长Molt4细胞--成人T淋巴细胞白血病细胞株--细胞呈葡聚状生长，悬浮细胞，聚集呈团，如单个散开分布示状态不好

二、细胞传代培养

细胞在支持物表面长满后，进行重新分配，再培养的过程。传代培养也是一种将细胞种保存下去的方法，同时也是利用培养细胞进行各种实验的必经过程。（悬浮型、贴壁型）

器材与试剂：超净工作台二氧化碳培养箱倒置显微镜细胞株（HeLa细胞）滴管、培养瓶、瓶塞等（无菌）培养液：10%小牛血清DMEM（无菌）消化液：0.25%胰蛋白酶液（pH7.4）（无菌）操作(无菌)

细胞株——弃原培养液（可PBS或D-Hanks洗）——加胰旦白酶液（消化细胞）——弃胰旦白酶液（静置1-2min。。。，倒置显微镜观察）——定量加入培养液1ml，冲打细胞成悬液（适度、打匀、尽量不要产生气泡）——取1滴细胞悬液进行细胞计数——按需接种至新培养瓶（皿）——补足新鲜培养液（一传二，3ml/瓶）——37℃培养——观察细胞生长情况0.5min细胞传代消化法示意图

显微镜下细胞消化前后示意图注意1、无菌操作2、胰蛋白酶消化时间要严格控制(镜下观察、时间长影响细胞贴壁)(温度、pH、浓度；0.02%EDTA---细胞成团时)3、吹打细胞要适度4、对于状态不好的细胞可分次消化。。。5、影响细胞生长的因素：培养基（营养、激素、渗透压、pH值）、温度、气体、细胞接种密度、加入培养液的量、换液的掌握。。。三、细胞计数

细胞的传代、冻存、生化研究及生长曲线制作等，都需对细胞进行计数。细胞的多少对实验结果会有影响。仪器血球计数板普通光学显微镜材料和试剂细胞株（HeLa细胞）0.25%胰蛋白酶液（pH7.4）10%小牛血清DMEM培养液操作

单层细胞——胰蛋白酶液消化细胞——弃胰酶——定量加入培养液（1-2ml）——轻轻吹打细胞（单细胞悬液）——取少许悬液计数细胞

——根据传代所需细胞进行稀释。。。

计算公式细胞数/毫升＝（４大格细胞数÷4）×104

1ml＝1000mm3每格体积=1×1×0.1=0.1mm3=10-4ml注意：培养