第6章 发酵条件及工艺控制

发酵工艺控制第六章目的要求：了解发酵类型及其发酵规律。掌握发酵控制、产物检测的方法，以保证发酵正常进行，获得高效产品。熟悉发酵工业的逐级放大过程。了解发酵过程的优化原理。几个问题1、发酵的类型2、发酵的规律3、发酵的控制4、发酵中所用的检测方法5、发酵过程的逐级放大定义发酵过程：即微生物细胞的生物反应过程，是指由微生物生长繁殖所引起的生物反应过程。它不仅包括了以往“发酵”的全部领域，而且还包括固定化细胞的反应过程、生物法废水处理过程和细菌采矿等过程。

为什么要研究发酵过程？

微生物发酵的生产水平不仅取决于生产菌种本身的性能，而且要赋以合适的环境条件才能使它的生产能力充分表达出来。为此我们必须通过各种研究方法了解有关生产菌种对环境条件的要求，如培养基、培养温度、pH、氧的需求等，并深入地了解生产菌在合成产物过程中的代谢调控机制以及可能的代谢途径，为设计合理的生产工艺提供理论基础。同时，为了掌握菌种在发酵过程中的代谢变化规律，可以通过各种监测手段如取样测定随时间变化的菌体浓度，糖、氮消耗及产物浓度，以及采用传感器测定发酵罐中的培养温度pH、溶解氧等参数的情况，并予以有效地控制，使生产菌种处于产物合成的优化环境之中，过量产生代谢产物。本章内容：第一节发酵工程常见的主要发酵类型第二节发酵工艺的控制第三节发酵的优化控制第四节发酵过程的计算机控制第五节发酵工业的逐级放大第六节发酵过程的参数检测第一节发酵工程常见的主要发酵类型

(p24-39)一、液体发酵与固体发酵二、厌氧发酵与好氧发酵三、分批发酵与连续发酵四、单一发酵与混合发酵五、固定化发酵技术采用哪种发酵方式？（p25）在微生物发酵工业生产中，究竟应该采用什么方式进行发酵主要取决于以下几点：菌种特性、原料特点、产物特色、设备状况、技术可行性、成本核算等。一般各种发酵方式往往是结合进行的。现代发酵工业主要的发酵方式：好氧、液体、深层、分批、单一纯种发酵方式结合进行的。优点：p25一、液体发酵与固体发酵（一）液体发酵（也叫液体培养）p25是指将微生物接种到液体培养基中进行培养的过程。如采用液体培养时利用的是好氧微生物则需要培养液中有较高的溶解氧。1、实验室常见的液体发酵方式实验室常见的好氧液体发酵方式：试管液体培养浅层液体培养摇瓶培养：装液量为三角瓶的10%以下，如250mL的三角瓶装量为10～20mL培养液。台式发酵罐：发酵罐的体积为几升至几十升。液体厌氧培养方式：在厌氧罐中进行。在培养基中添加还原剂。为满足微生物的厌氧需要采取的措施：培养基中添加有机还原剂（巯基乙醇、半胱氨酸）、无机还原剂（铁丝）。使培养基的氧化还原电位在﹣429～﹣

150mV。2、工业生产中常见的液体发酵方式p27静置培养（浅盘培养）：容器中盛装浅层培养液进行静止培养。通气培养（发酵罐深层培养）：在发酵罐中加入液体培养基，通入无菌空气并搅拌，进行微生物发酵的方式。厌氧发酵：在发酵罐中加入液体培养基不需通入无菌空气，进行微生物发酵的方式。（二）固体发酵

(p28-30)固体发酵（固体培养、固态发酵）就是利用固体培养基培养微生物的方法。1、固态发酵概述固体发酵：也称固态培养，是利用固体培养基进行微生物的培养。应用:固体培养在微生物鉴定、计数、纯化和保藏等方面发挥着重要作用。固态发酵主要是一些传统发酵工艺。例如生产大曲酒、麸曲酒就是典型的固态发酵。一些丝状真菌可以进行生产规模的固体发酵。固态发酵的一般过程：原料预处理，蒸煮灭菌，接种，固态发酵，发酵结束及时后处理。固体发酵的形式：好氧、厌氧厚层，25～30cm厚的物料。如曲池、曲箱等。薄层，1～2cm厚的物料。帘子、曲盘等。2、实验室常见的固体培养形式：试管斜面、培养皿平板、较大型的克氏扁瓶和茄子瓶斜面。用途：菌种的分离、纯化、保藏和生产种子的制备。方法：（1）用接种环挑取原始培养物后，在固体培养基表面划线接种（2）用涂布棒将少量的液体培养物涂布在整个固体培养基表面（3）将少量液体培养物与融化后降温至50～60℃的固体培养基混匀，倒入培养皿中，浇注成平板。（4）接种后的培养物直接放入培养箱中恒温培养。这些方法适用于好氧和兼性好氧微生物的培养。3、生产中常见的固体培养（1）好氧固体培养方法：在生产实践中，好氧真菌的固体培养方法都是将接种后的固体基质薄薄地摊铺在容器的表面，可使菌体获得充足的氧气，又可以将生长过程中产生的热量及时释放。特点：固体培养使用的基本培养基原料是小麦麸皮等。灭菌后待冷却到合适温度便可接种。固体培养基中的含水量控制在40％～80％之间（典型的液体培养基含水量在95％以上）。细菌和酵母菌将无法忍受如此低水含量的环境，所以，固体培养被细菌或酵母菌污染的可能性大大降低。发酵形式：厚层：25～30cm厚的物料。如曲池、曲箱等。薄层：1～2cm厚的物料。帘子、曲盘等。产品：麸曲、食用菌、酱油、米酒。（2）厌氧固体发酵我国传统白酒的生产采用的是大型深层地窖堆积式的固体发酵。酵母菌是兼性厌氧菌。4、固态发酵特点边糖化边发酵：一般都采用比较低的温度，让糖化作用和发酵作用同时进行；即采用边糖化边发酵的工艺。当采用20～30℃低温时，糖化酶作用缓慢，故糖化时间要延长。多菌种的混合发酵。除原料蒸煮过程能起到灭菌作用外，空气、水、工具和场所，窖池等都存在大量的多种多样的微生物，并把这些微生物带到发酵原料中，它们与曲中的微生物一起协同作用，生产出丰富的香味物质，如固体厌气发酵。开放式发酵，无菌程度要求不高。在霉菌发酵时就可以防止污染杂菌。设备简单。生产成本低、能耗低。原料来源广，价格低廉。固体发酵的产物回收一般步骤少，费用也省。缺点：发酵时间长耗费劳动力多占地面积大生产规模难以扩大pH、溶氧和温度难以控制固体发酵存在的主要工程问题是大规模生产时的散热比较困难，参数检测如pH值、温度、菌体增殖量、产物生成量等是很难实现的。因此，实现固体发酵的最优化困难重重。5、固态发酵的控制（1）固态发酵的温度控制固态发酵的温度控制靠控制进窖温度和淀粉含量来解决。因在窖内部没有冷却或加热装置，这样只好把进窖温度控制得比较低(18～22℃)。糖化进行缓慢，发酵也就缓慢，窖内升温慢些，酵母就不易衰老，发酵率就升高。进窖时原料淀粉含量不能太高，在发酵过程中一部分能量被放出，升高了发酵温度。一般发酵过程中，淀粉含量每降低1.0％时，酒醅温度实际约上升2℃左右。所以淀粉含量控制在14～16％，随气温的高低不同进行适当的调整。

(2)固体发酵的pH控制

一般工厂用酸度表示。酸度来源：原料本身，曲和酒醅是最主要的。发酵过程中酸度增加的原因：主要是杂菌的影响，淀粉浓度过高，糖化快，细菌生长繁殖快，造成酒醅酸度升高，也反过来影响酵母的生长，影响发酵，酸度低又影响糖化速度。控制原因：控制酸度既适宜酵母生长又抑制了细菌生长。控制程度：一般控制pH在1.4～2.0的酸度。(3)水分的控制固体发酵中水分的作用：水分是微生物生长的条件，适当的水分是良好发酵的重要因素。但入窖水分过高，会引起糖化和发酵作用加快，升温过猛，使发酵不彻底；而水分过少，会引起酒醅发干，残余淀粉高，酸度过低，槽不柔软，影响发酵正常进行。控制措施：一般大曲酒入窖水分为53～57％，小曲57～62％，因原料而异，冬天与夏天也不同。其他控制措施：另一方面为了调整淀粉浓度，增加疏松性，调节酸度，以利于微生物的生长繁殖，保持水分，在固态发酵时常常加入填充料、如谷壳等。二、厌氧发酵与好氧发酵(p30)厌氧培养：深层培养好氧培养：液体表面培养、固体培养、通氧深层培养（一）厌氧液态发酵厌氧发酵也称静置培养：是利用厌氧微生物在液体状态下进行的发酵。特点：液体发酵速度快，发酵完全，发酵周期短，原料利用率高，而且适于大规模机械化、连续化、自动化生产。液态厌氧发酵对无菌要求较高，因此培养基必须经过灭菌，对发酵容器也要定期灭菌。接种量大，在发酵过程中对pH、温度进行连续控制，中间分析也与好氧发酵相似。应用：酒精、丙酮、丁醇、乳酸、啤酒等发酵。三、分批发酵与连续发酵

（p31～37）（一）分批发酵（二）补料分批发酵（三）连续发酵■深层发酵按进行过程可分为：分批发酵(Batchfermentation)补料分批发酵(Fed-batchfermentation)连续发酵(Continuousfermentation)1、分批发酵的定义是指在一封闭系统内将细胞和培养液一次性装入反应器内，进行培养，细胞不断生长，产物不断形成，经过一段时间后将整个反应物取出的发酵方式。在这一过程中，除了氧气、消泡剂及控制pH的酸或碱外，不再加入任何其它物质。发酵过程中培养基成分减少，微生物得到繁殖。它是发酵工业中常见的一种方法。（一）分批发酵（p31-33）2、分批发酵的特点微生物所处的环境在发酵过程中不断变化，其物理，化学和生物参数都随时间而变化，是一个不稳定的过程。微生物处在限制性培养基中，只能在有限时间内维持微生物的增殖，其生长表现为典型的生长周期。发酵周期：包括空罐灭菌、加入灭菌过的培养基、接种、发酵过程、放罐和洗罐所需的整个时间。优点操作简单；操作引起染菌的概率低。不会产生菌种老化和变异等问题。缺点非生产时间较长、设备利用率低。生长到一定程度就要受到抑制（原因：基质抑制或产物抑制）。3、典型的分批发酵工艺流程（二）补料分批发酵（p33-34）1、定义

又称半连续发酵或流加分批发酵：是指在分批发酵过程中，间歇或连续地补加新鲜培养基的发酵方式。即在分批培养伊始，投入较低浓度的底物，然后在发酵过程中，当微生物开始消耗底物后，再以某种方式向培养系统中补加一定的物料，使培养基中的底物浓度在较长时间内保持在一定范围内，以维持微生物的生长和产物的形成，并避免不利因素的产生，从而达到提高容积产量、产物浓度和产物得率的目的。2、补料分批发酵的优缺点优点使发酵系统中维持很低的基质浓度，可以解除底物抑制、产物抑制和葡萄糖的分解阻遏效应；（可以除去快速利用碳源的阻遏效应、避免培养基积累有毒代谢物。）和连续发酵比、不需要严格的无菌条件；不会产生菌种老化和变异等问题。维持适当的菌体浓度，减少通风设备的压力，避免分批发酵初始阶段供需氧量大的问题。缺点存在一定的非生产时间；和分批发酵比，中途要流加新鲜培养基，增加了染菌的危险。分批补料系统并不连续地向罐外放出发酵液，因而发酵罐内的培养基体积不再是个常数，而是随时间和物料流速而变化的变量。3、适用范围培养基成分的浓度显著影响菌体和产物得率的发酵，利用此发酵方式可减轻高底物浓度的抑制作用，有利于更多产物的生成。受到分解代谢物阻遏的发酵。营养缺陷型菌株的培养。（流加该菌株所需的物质，不至于过量而产生反馈抑制或阻遏）前体的补充。（可以避免前体对细胞的毒害）目前补料分批发酵广泛应用于抗生素、氨基酸、酶蛋白、核苷酸、有机酸、色素及高聚物等的生产。液体发酵、固体发酵、混合发酵。4、补料量和补料率的确定目前生产中还只是凭经验。根据检测的静态参数如基质残留量、pH值、溶氧浓度等。5、补料分批发酵的类型补料方式连续流加不连续流加多周期流加补料成分单一组分流加多组分流加控制方式反馈控制（以DO值为反馈指标等）无反馈控制发酵过程中不同的补料方法对微生物细胞的密度、生长速度以及产率都有影响。参见p34表1-5（三）连续发酵（p34-37）1、定义

1、定义连续发酵：新鲜培养基料液连续输入发酵罐，并同时以相同速度放出含有产品的发酵液，使发酵罐内料液量维持恒定，微生物在近似恒定状态（恒定的基质浓度、恒定的产物浓度、恒定的pH、恒定菌体浓度、恒定的比生长速率）下生长的发酵方式。是在开放系统中进行的。2、连续发酵的优缺点优点（p35）能维持低基质浓度。缩短发酵周期，提高设备利用率和单位时间的产量。增加了生产效率。便于自动控制。恒定状态可以有效地延长分批培养中的指数生长期。在恒定的状态下，微生物所处的环境条件，如营养物质浓度、产物浓度、pH值，以及微生物细胞的浓度、比生长速率等可以始终维持不变，甚至还可以根据需要来调节生长速率。

缺点（p36-37）菌种发生变异的可能性较大。要求严格的无菌条件。工艺中的变量较分批发酵复杂，较难控制和扩大。不适于次级代谢产物的发酵生产。3、连续培养过程中的主要问题杂菌污染问题生产菌株突变问题（1）杂菌污染问题在连续发酵过程中，需要长时间连续不断地向发酵系统供给无菌的新鲜空气和培养基，这就不可避免地发生杂菌污染问题。杂菌污染问题是连续培养中难以解决的问题。要了解污染的杂菌在什么样的条件下会在系统中发展成为主要的微生物群体。（2）生产菌株突变问题微生物在复制过程中难免会出现差错引起突变，一旦在连续培养系统中的生产菌细胞群体中某一个细胞发生了突变，而且突变的结果使这一细胞获得在给定条件下高速生长的能力，那么它就有可能像杂菌一样，取代系统中原来的生产菌株，而使连续发酵过程失败。

4、分批培养与连续培养的关系

（p35）5、连续培养器6、连续培养的两种主要工艺类型(1)均匀混合的生物反应器恒化培养使培养基中限制性基质的浓度保持恒定。恒浊培养使培养基中菌体的浓度保持恒定。(2)活塞流反应器7、连续发酵的类型（p35-36）开放式连续发酵系统：单罐均匀混合连续发酵、多罐均匀混合连续发酵、管道非均匀混合连续发酵、塔式非均匀混合连续发酵封闭式连续发酵系统：8、连续发酵的代谢曲线从分批培养出发，无论在哪个时候开始加入新鲜培养基过渡到连续操作，达到一定的菌体浓度及限制基质浓度，则培养系统一定能成为稳定状态——连续发酵。9、连续发酵的应用

采用连续发酵的方法可以有效地提高产量，但是也存在着某些较难克服的困难，因此目前仅在一些比较简单的发酵产品中应用。如：酵母，单细胞蛋白，酒精发酵、丙酮、乳酸、丁醇、石油脱蜡、活性污泥废水处理等。其余产品的连续发酵尚未工业化生产。四、单一发酵与混合发酵

（p37-38）单一发酵：只用一种微生物的发酵。混合发酵：多种微生物混合在一起共用一种培养基进行发酵。五、固定化发酵技术

（p38-39）固定化酶：利用物理或化学的方法使水溶性的酶制剂变为不溶于水，但仍保持酶的催化能力的制剂。特点：用固相的酶作用于液相的底物。固定化细胞固定化细胞发酵技术的应用：p39表1-8第二节发酵工艺的控制

（p150-175）发酵条件：是指影响发酵过程中各种化学及生物学反应的环境因素。发酵主要的条件有：营养基质的浓度、温度、pH值、通气和搅拌、泡沫、二氧化碳等。发酵工艺控制的主要内容：营养基质和菌体浓度温度pH值通气和搅拌泡沫二氧化碳发酵终点的判断影响发酵的主要因素：温度：根据发酵不同阶段，确定最适温度。发酵中释放发酵热，一般需要进行冷却操作。pH：pH不同产物不同，基质加缓冲性物质，生产过程中加入无机酸、碱等。通风和搅拌：可以生长和最适生长氧的浓度。染菌的控制：1）设备、管道、阀门漏损。2）设备及管道灭菌不彻底存在死角。3）空气净化不彻底。4）菌种不纯或培养基灭菌不彻底。5）无菌操作不严格，生产操作出错。工艺条件控制的目的：就是要为生产菌创造一个最适的环境，使我们所需要的代谢活动得以最充分的表达，从而生产出过量的代谢产物。一、营养基质和菌体浓度的影响及控制

(p150-155)（一）基质浓度和菌体浓度对发酵的影响1、基质浓度对发酵的影响（1）碳源种类和浓度（2）氮源种类和浓度（3）磷酸盐的浓度2、菌体浓度对发酵的影响及控制（二）基质浓度的控制（补料控制）（一）基质浓度和菌体浓度对发酵的影响

1、基质浓度对发酵的影响

（1）碳源种类和浓度碳源种类：快速利用碳源（分解代谢产物阻遏）、缓慢利用碳源。碳源浓度：不同微生物不同，同一微生物不同生长阶段不同。如培养基中碳源含量超过5%时，细菌生长不良；酵母和霉菌可耐受200g/L的葡萄糖浓度。（2）氮源的种类和浓度氮源种类和浓度对微生物生长和产物合成产生影响，不同的产物，需要不同的氮的浓度不同。氮源的种类：？有机氮（促进菌体生长、是前体物质）、无机氮速效氮、迟效氮不同种类的氮源对发酵的影响：？速效氮：有利于菌体的生长、不利于某些代谢产物的合成。迟效氮：可延长次级产物的分泌期、提高其产量。但过量时也易促进菌体生长。氮源的浓度：过高时导致细胞脱水死亡；过低菌体营养不足，影响产物合成。不同的发酵所需氮源浓度不同，各有一个合适的C/N比；不同的生长发育阶段所需氮源浓度不同：菌体生长阶段、产物合成阶段。（3）磷酸盐的浓度磷酸盐的浓度对微生物的生长和产物合成有一定影响；菌体生长和次级代谢产物的合成所需浓度相差悬殊：菌体生长所需的磷酸盐浓度为：0.32～300mmol/L；次级代谢产物所允许的最高浓度为：1mmol/L。2、菌体浓度对发酵的影响菌体浓度是指单位体积中菌体的含量。菌体浓度与菌体生长速率直接相关。菌体浓度大小对发酵产物得率会产生重要影响：对初级代谢产物有直接影响；对次级代谢产物则存在菌种浓度范围。菌体浓度的控制：在发酵中应将菌种浓度控制在一定范围内。控制的方法：接种量。培养基中营养物质的含量：通过各成分合适的配比、补料来控制菌种的浓度。（二）基质浓度的控制（补料控制）1、补料控制目的解除基质过浓的抑制解除产物的反馈抑制解除葡萄糖分解代谢阻遏效应补充微生物能源和碳源的需要。补充菌体所需要的氮源。补充微量元素或无机盐。2、补料的内容控制微生物的中间代谢，使之向着有利于产物积累的方向发展。为实现这一目标，在中间补料控制时，必须选择恰当的反馈控制参数和补料速率。3、补料的原则大多数补料分批发酵均补加生长限制性基质以经验数据或预测数据控制流加；以pH、尾气、溶氧、产物浓度等参数间接控制流加；以物料平衡方程，通过传感器在线测定的一些参数计算限制性基质的浓度，间接控制流加；用传感器直接测定限制性基质的浓度，直接控制流加。4、补料控制的策略5、补料控制参数的选择根据微生物在发酵过程中的代谢规律及对环境条件的要求来选择。为了有效地进行中间补料，必须选择恰当的反馈控制参数，以及了解这些参数与微生物代谢、菌体生长、基质利用以及产物形成之间的关系。采用最优的补科程序也是依赖于比生长曲线形态、产物生成速率及发酵的初始条件等情况。因此，欲建立分批补料培养的数学模型及选择最佳控制程序都必须充分了解微生物在发酵过程中的代谢规律及对环境条件的要求。常用的反馈控制参数恒pH法：通过pH值的变化推测菌体的生长状态，调节流加速度，使pH为恒定值。恒溶氧法：以溶氧为反馈指标，根据溶解氧的变化曲线调整碳源的流加量。菌体密度法：通过检测菌体的浓度，以及营养利用情况，调整碳源的加入量。二氧化碳释放率（CER）法：通过检测CER。估计碳源的利用情况，控制营养的流加。连续补料和分批补料发酵的比较7、补料速率的确定优化补料速率也是补料控制中十分重要的一环，因为养分和前体需要维持适当的浓度，而它们则以不同的速率被消耗，所以补料速率要根据微生物对营养等的消耗速率及所设定的培养液中最低维持浓度而定。例如，用连续培养方法测定了在不同比生长速率下青霉素生产菌产黄青霉的碳、氮、氧、磷、硫和乙酸盐及菌最适生长所需的各种基质的补料速率。

二、温度对发酵的影响及控制（一）影响发酵温度的因素（p155）（二）温度对微生物的生长和发酵的影响（p157-158）（三）最适温度的确定（p158）（四）温度控制的方法（一）影响发酵温度的因素（p155）产热因素：生物热、搅拌热、通气热散热因素：蒸发热、辐射热发酵热发酵热就是发酵过程中释放出来的净热量。

Q发酵=Q生物+Q搅拌+

Q通气-Q蒸发-

Q辐射生物热：生物热是生产菌在生长繁殖时产生的大量热量。培养基中碳水化合物，脂肪，蛋白质等物质被分解为CO2，NH3时释放出的大量能量。用途：合成高能化合物供微生物生命代谢活动热能散发影响生物热的因素：生物热随菌株，培养基，发酵时期的不同而不同。生物热的大小还与菌体的呼吸强度有对应关系。实验发现抗生素高产量批号（1）的生物热高于低产量批号（2）的生物热。说明抗生素合成时微生物的新陈代谢十分旺盛。

1、抗生素相对活性为12、抗生素相对活性为0.5发酵过程中生物热的变化在四环素发酵中，还发现生物热和菌的呼吸强度的变化有对应关系，特别是在80h以前。从此实验中还可看到，当产生的生物热达到高峰时，糖的利用速度也最大。另外也有人提出，可从菌体的耗氧率来衡量生物热的大小。

四环素生物合成过程中系列参数的动态变化过程1：效价；2：呼吸强度；3：生物热；4：糖浓度搅拌热：通风发酵都有大功率搅拌，搅拌的机械运动造成液体之间，液体与设备之间的摩擦而产生的热。

Q搅拌=3600（P/V）3600：热功当量（kJ/（kW.h））（P/V）：通气条件下单位体积发酵液所消耗的功率（kW/m3）蒸发热：通入发酵罐的空气，其温度和湿度随季节及控制条件的不同而有所变化。空气进入发酵罐后，就和发酵液广泛接触进行热交换。同时必然会引起水分的蒸发；蒸发所需的热量即为蒸发热。蒸发热的计算：Q蒸发=G（I2-I1）

G：空气流量，按干重计算，kg/h

I1、I2：进出发酵罐的空气的热焓量，J/kg（干空气）辐射热：由于发酵罐内外温度差，通过罐体向外辐射的热量。辐射热可通过罐内外的温差求得，一般不超过发酵热的5%。发酵热的测定（1）通过测定一定时间内冷却水的流量和冷却水进出口温度，由下式求得这段时间内的发酵热。（2）通过罐温的自动控制，先使罐温达到恒定，再关闭自控装置测得温度随时间上升的速率S，按下式可求得发酵热：影响微生物的生长（不同微生物不同、同一微生物不同培养条件不同）影响各种酶的反应速率和酶的特性影响发酵液的物理性质影响生物合成的方向。例如，四环素发酵中金色链霉菌同时能产生金霉素。在低于30℃温度下，该菌种合成金霉素能力较强。当温度提高，合成四环素的比例也提高。在温度达35℃则只产生四环素而金霉素合成几乎停止。

（二）温度对微生物的生长和发酵的影响

（p157-158）最适温度是一种相对概念，是指在该温度下最适于菌的生长或发酵产物的生成。最适发酵温度与菌种，培养基成分，培养条件和菌体生长阶段有关。最适发酵温度的选择和控制：在发酵的整个周期内仅选一个最适培养温度不一定好。温度的选择要参考其它发酵条件。温度的选择还应考虑培养基成分和浓度总之要考虑各方面的因素，并通过实验和实际生产过程研究其规律性，最终有效提高产物的产量。（三）最适温度的确定（p158）

升温设备：降温设备：

发酵罐：夹套（体积在10M3以下）盘管（蛇管）（体积在10M3以上）温度传感器（四）温度控制的方法三、pH对发酵的影响及控制

（p159-162）发酵过程中培养液的pH值是微生物在一定环境条件下代谢活动的综合指标，是一项重要的发酵参数。它对菌体的生长和产品的积累有很大的影响。因此，必须掌握发酵过程中pH的变化规律，及时监测并加以控制，使它处于最佳的状态。尽管多数微生物能在3～4个pH单位的pH范围内生长，但是在发酵工艺中，为了达到高生长速率和最佳产物形成，必须使pH在很窄的范围内保持恒定。（一）pH值对微生物的生长繁殖和产物合成的影响影响：pH不同会形成不同的代谢产物。微生物菌体生长和产物的形成的pH往往不同。影响微生物生长和代谢的原因：pH影响酶的活性。pH影响微生物细胞膜所带电荷的状态。直接影响代谢过程：pH影响培养基某些营养物质和中间代谢产物的解离，影响微生物对这些物质的利用，从而引起菌体代谢过程的不同，使代谢产物的质量和比例发生改变，影响代谢产物的合成（二）发酵过程中pH的变化微生物生长阶段产物生成阶段微生物自溶阶段碳源过量消泡油添加过量微生物生长过程中形成了生理酸性物质引起pH下降的因素氮源过多微生物生长过程中形成了生理碱性物质中间补料，碱性物质添加过多引起pH上升的因素原则：有利于菌体生长和产物的合成。一般根据实验结果确定。最适pH与菌株，培养基组成，发酵工艺有关。应按发酵过程的不同阶段分别控制不同的pH范围。（三）最适pH的选择最适pH与微生物生长，产物形成之间相互关系的四种类型：菌体比生长速率μ和产物比生产速率QP的最适pH在一个相似的较宽的范围内（比较容易控制）；μ较宽，Qp范围较窄，或μ较窄，Qp范围较宽（难控制，应严格控制）；μ和Qp对pH都很敏感，其最适pH相同（应严格控制）；更复杂，μ和Qp对pH都很敏感，并有各自的最适pH（难度最大）；调节基础培养基的配方调节碳氮比（C/N）添加缓冲剂（如磷酸盐）补料控制直接加酸加碱补加碳源或氮源（氨水等）（四）pH值的控制方法（一）发酵过程中对氧的需求大多数发酵过程是好氧的，因此需要供氧。如果考虑呼吸的化学计量，则葡萄糖的氧化可由下式表示：

C6H12O6

十6O2＝6H2O十6CO2

只有当这两种反应物均溶于水后，才对菌体有用。氧在水中的溶解度比葡萄糖要小约6000倍左右(氧在水中的饱和度约为l0mg/L

。28˚C时氧在发酵液中100%的空气饱和浓度只有7mg/L

)。许多发酵的生产能力受到氧利用限制，因此溶氧（DO）成为影响发酵效率的重要因素。四、氧对发酵的影响（p162-167）基质微生物g氧/g干菌体葡萄糖大肠杆菌0.4甲醇假单孢菌C1.2辛烷假单孢菌1.7生长于不同基质上的不同微生物的需氧要求由于菌体的代谢是受发酵液中的溶氧（DO）浓度的影响，故简单地依据总需求来供氧是欠妥的，而影响溶解氧的因素有许多，如供氧、通气搅拌、微生物的需氧情况等。如何判断溶氧是否能够满足微生物的需求的有效方法是就地检测发酵液中溶氧的浓度。常用的方法是在发酵罐中安装溶氧电极。（二）微生物的临界氧浓度（C临界）临界氧浓度（C临界）：指不影响菌体呼吸所允许的最低氧浓度，或微生物对发酵液中溶解氧浓度的最低要求。各种微生物的临界氧值以空气饱和度%来表示。不同微生物不同，同种微生物的呼吸临界值不一定与产物合成临界值相同。■一些微生物的临界氧浓度微生物温度（˚C）临界氧浓度%细菌373-10酵母303-10放线菌305-30青霉素2410-15（三）溶氧对发酵的影响由此可知，只有使溶氧浓度高于其临界值，才能维持菌体的最大比摄氧率，得到最大的菌体合成量。如果溶氧浓度低于临界值，则菌体代谢受到干扰。但是，发酵工业的目标是要得到菌体发酵的产物而不是菌体本身。因此，由氧饥饿而引起的细胞代谢干扰，可能对形成某些产物是有利的；同理，当提供的氧浓度远大于临界值时，虽对菌体形成无妨，但也许能刺激产物的形成；所以，某种产物形成的最佳条件可能不同于菌体生长的最佳通气条件。

根据需氧不同，可将初级代谢发酵分为：（p163）

a.供氧充足条件下，产量最大；若供氧不足，合成受强烈抑制。如：谷氨酸，精氨酸，脯氨酸等。

b.供氧充足条件下，可得最高产量；若供氧受限，产量受影响不明显。如：异亮氨酸，赖氨酸，苏氨酸，天冬氨酸等。

c.若供氧受限，细胞呼吸受抑制时，才获得最大量产物；若供氧充足，产物形成反而受抑制。如：亮氨酸，缬氨酸，苯丙氨酸等。由此可见，供氧大小与产物的合成途径密切相关。但在实际生产过程中需注意两种情况：溶解氧浓度过低（代谢异常，产量降低）溶解氧浓度过高（代谢异常，菌体提前自溶）■实例一在对黄色短杆菌(Brevibacteriumflavum)生物合成氨基酸进行研究时发现，溶氧浓度对相关的氨基酸的生物合成具有很大的影响。研究表明：菌体的临界溶氧浓度为0.01mg/L；并根据“安全”的程度予以考虑供氧的程度，也即把菌体的呼吸率作为最大呼吸率的一个组成部分。因此，氧安全值低于最大呼吸率就意味着其溶氧浓度低于临界值。当溶氧浓度低于1.0时，谷氨酸和天冬氨酸族氨基酸合成受到影响，但苯丙氨酸，缬氨酸和亮氨酸最佳合成的溶氧浓度分别为0.55、0.60和0.85。从合成途径中可知，谷氨酸和天冬氨酸族的氨基酸来自于三羧酸循环(TCA)的中间体，而苯丙氨酸、缬氨酸和亮氨酸来自于糖酵解的中间体，即来自于丙酮酸和磷酸稀醇式丙酮酸。Feren和Squires(1969)对顶头孢霉产生头孢菌素和卷曲霉素(Capreomycin)的研究即是一个氧对次级代谢影响的例子。研究表明，头孢菌素产生菌的临界氧浓度在0～7％的空气饱和度间；而对卷曲霉素产生菌则为13～23％。但就抑制抗生素生物合成的溶氧浓度来说，对头孢菌素为低于10～20％；而对卷曲霉素则为8％。因此，在生产头孢菌素时，应使其溶氧浓度远大于临界值，而在生产卷曲霉素时，则应使其溶氧浓度低于临界值。■实例二（四）发酵过程的溶氧变化规律（p164）发酵前期：由于微生物大量繁殖，需氧量不断大幅度增加，此时需氧超过供氧，溶氧明显下降。发酵中期，溶氧明显受工艺控制手段的影响，如补料的数量、时机和方式等。微生物需氧量仍然大，溶氧虽有波动但变化不大，维持在一定水平。发酵后期由于菌体衰老，呼吸减弱，溶氧浓度也会逐步上升，一旦菌体自溶，溶氧就会明显地上升，甚至是直线上升。

发酵过程中溶氧的异常（p164）溶氧的异常：发酵过程中溶氧明显上升或下降的现象。溶氧下降出现的原因：污染好气杂菌菌体代谢异常某些设备或工艺发生故障或变化。（五）溶氧的控制措施调节通风与搅拌。限制基础培养基的浓度，使发酵器内的生物体浓度维持于适当水平；并以补料方式供给某些营养成分而控制菌体生长率和呼吸率。改善发酵液的黏度。五、发酵过程中的泡沫及其控制（p168-172）（一）泡沫的性质泡沫是气体被分散在少量液体中的胶体体系。泡沫间被一层液膜隔开而彼此不相连通。发酵过程中所遇到的泡沫，其分散相是无菌空气和代谢气体，连续相是发酵液。一类存在于发酵液的液面上。

这类泡沫气相所占比例特别大，并且泡沫与它下面的液体之间有能分辫的界线。如在某些稀薄的前期发酵液或种子培养液中所见到的。另一种泡沫是出现在粘稠的菌丝发酵液中。

这种泡沫分散很细，而且很均匀，也较稳定。泡沫与液体间没有明显的波面界限，在鼓泡的发酵液中气体分散相占的比例由下而上地逐渐增加。（二）泡沫的类型由外界引进的气流被机械地分散形成（通风、搅拌）；发酵过程中产生的气体聚结生成（发泡性物质）。（三）泡沫产生的原因降低发酵设备的利用率增加了菌群的非均一性增加了染菌的机会导致产物的损失消泡剂会给后提取工序带来困难（四）泡沫对发酵的不利影响通气与搅拌的强度培养基的配比及原材料组成培养基的破坏程度接种量的大小培养液本身性质的变化培养基灭菌的方法和操作染菌（五）影响泡沫稳定的因素不同搅拌速度和通气量对泡沫影响不同浓度蛋白质原科的起泡作用灭菌时间对泡沫稳定性的影响

（六）发酵过程泡沫的变化发酵过程中泡沫的消长规律（1）发酵初期，泡沫稳定，其原因是发酵液的高表面粘度和低表面张力。（2）发酵进程中，表面粘度下降，表面张力上升，泡沫寿命缩短而减少，原因是微生物产生的胞外酶把造成泡沫稳定的物质如蛋白质等逐步降低的结果。（3）发酵后期，随菌体的自溶，导致培养基中的可溶性蛋白质的增加，又产生泡沫。

（七）发酵过程泡沫控制的方法1、物理消泡法2、化学消泡法使用时要注意：加入量及时机，一般要尽可能减少消泡剂的用量。在应用前要做比较性试验，找在已知培养基中消泡剂对微生物生理特性影响最小，消泡效率最大的条件，并要考虑成本及对终产物的影响。1、物理消泡法方法罐内消泡法：可在搅拌轴上安装消泡浆（最简单的方法）。

罐外消泡法：将泡沫引出罐外，泡沫消除后再回罐内。

原理靠机械力引起强烈振动或者压力变化，促使泡沫破裂，或借机械力将排出气体中的液体加以分离回收。优点不需要引进外界物质、节省原材料、减少污染机会。缺点不能从根本众消除引起稳定泡沫的因素。2、化学消泡法机理消泡剂消泡的原理：降低泡沫液膜表面的机械强度；降低泡沫液膜表面的黏度。当泡沫的表层存在着由极性的表面活性物质形成双电层时，可以加入另一种具有相反电荷的表面活性剂，以降低泡沫的机械强度或加入某些具有强极性的物质与发泡剂争夺液膜上的空间，降低液膜强度，使泡沫破裂。当泡沫的液膜具有较大的表面粘度时，可以加入某些分子内聚力较小的物质，以降低液膜的表面粘度，使液膜的液体流失，导致泡沫破裂。3、选择消泡剂的依据对发酵过程无毒，对人、畜无害和不影响酶的生物合成。消泡作用迅速，效果高和持久性能好能耐高压蒸气灭菌而不变性，在灭菌温度下对设备无腐蚀性或不形成腐蚀性产物。不影响以后的提取过程。消沫剂的来源多，价格低，添加装置简单。不干扰分析系统，如溶解氧、pH测定仪的探头。最好还能做到不影响氧的传递。4、消泡剂的种类和性能天然油脂：常用的有玉米油、米糠油、豆油、棉子油、鱼油及猪油等。化学合成物质：聚醚类：在生产上应用较多的是聚氧丙烯甘油和聚氧乙烯氧丙烯甘油(又称泡敌)。高级醇类：十八醇是较常用的一种，可以单独或与载体一起使用。据报导，它与冷榨猪油一起控制青男素发酵的泡沫，效果较好。聚二酵具有消沫效果持久的特点，尤其适用于霉菌发酵。硅酮类：硅酮类消沫剂主要是聚二甲基硅氧烷及其衍生物。六、CO2对发酵的影响及控制（p172-174）CO2是微生物的代谢产物，它是细胞代谢的重要指标。同时也是某些合成代谢的基质。在发酵过程中，CO2有可能对发酵有促进作用，也有可能有抑制作用。（一）CO2对发酵的影响一般适宜的CO2浓度为0.02%～0.04%。CO2浓度过高对菌体具有抑制作用：当排气中CO2的浓度高于4%时，微生物的糖代谢和呼吸速率下降。例如，发酵液中CO2的浓度达到1.6×10-1mol，就会严重抑制酵母的生长；当进气口CO2的含量占混合气体的80%时，酵母活力与对照相比降低20%。CO2对发酵也有影响对发酵促进：如牛链球菌发酵生产多糖，最重要的发酵条件是提供的空气中要含5%的CO2。对发酵抑制：如对肌苷、异亮氨酸、组氨酸、抗生素等发酵的抑制。影响发酵液的酸碱平衡

CO2溶于水后形成HCO3-主要是影响细胞膜的结构，导致膜的流动性及表面电荷密度发生改变，影响到细胞膜的输送效率，导致细胞生长受到抑制、形态发生改变。培养液中的CO2主要作用于细胞膜的脂质核心部位。HCO3-影响细胞膜的膜蛋白。（二）CO2对发酵影响的机理（三）CO2的控制CO2在发酵液中的浓度变化不像溶解氧那样有一定的规律。它的大小受到许多因素的影响，如细胞的呼吸强度、发酵液的流变学特性、通气、搅拌程度、罐压大小、设备规模等。在发酵过程中通过调节通风和搅拌来控制。如果对产物形成有抑制作用，要降低其浓度；如果有促进作用，则提高其浓度。七、高浓度微生物的培养（补充）（一）为什么要采用高浓度微生物的培养？微生物利用分批培养技术，但发酵液中最终细胞浓度不高。如果通过改进工艺技术，使发酵液中微生物细胞增殖到很高的浓度，那么，高浓度的细胞将会产生高浓度的发酵产物，这样就可以大大提高发酵设备的利用率，降低生产成本。基于这种目的，人们开始研究微生物高细胞浓度的培养技术。采用高细胞浓度培养技术，发酵液中菌体浓度比分批式培养可高10倍以上。例如用高细胞浓度连续培养技术，培养大肠杆菌HBl01(pPAKS2)，可得到95g／L的菌体。用同样的方法培养酒精酵母可得到219g／L的菌体。而一般用分批法培养酵母和细菌，得到的菌体浓度仅为10g／L左右。

高密度培养技术（HighCell-densityCulture）是指利用一定的培养技术或装置提高菌体的密度，使菌体密度较分批培养技术有显著的提高，最终提高特定产物的比生产率的技术。（二）高细胞浓度培养技术的原理

采用一定的工艺技术，保证微生物生长的适宜条件，延长微生物的指数增殖过程，从而得到高浓度的细胞。（三）高细胞浓度培养技术的优点可大大提高发酵设备的利用率节省能源

（四）高浓度细胞培养的方法流加培养（补料分批发酵）高细胞浓度连续培养菌体循环利用1、流加培养优点实现对发酵过程的控制，如控制代谢途径、菌体比生长速率等。无需增添设备。解除底物抑制。解除分解代谢阻遏。解除葡萄糖效应。流加培养的控制方式无反馈控制恒速流加变速流加指数流加反馈控制DO-恒定控制pH-恒定控制CO2生成速率控制细胞浓度控制底物浓度控制2、高浓度细胞连续培养原理无菌培养基以一定速度连续补入发酵液，同时采用离心、膜过滤等方法，回收排出液中的细胞，使之重新进入发酵液中，这样微生物就可以在发酵液中高浓度地积累。高浓度的细胞产生大量的发酵产物，这些产物随排出液排出进入提取过程，同时对细胞生长起抑制作用的代谢产物也被排出。除去抑制物质的方法透析培养萃取发酵过滤培养3、菌体循环利用这种方法大致过程是：待分批发酵终了将菌体与发酵液分离，收集的菌体经去杂菌等处理后返回发酵罐，再加入无菌培养基进行第二批发酵，因发酵液中菌体浓度很高，故发酵时间可大大缩短。第二批发酵终了，进行同样处理，然后再开始第三批发酵；这种技术与前面所述两种技术原理不同，但也能起到缩短发酵时间、提高设备利用率的作用。4、高细胞浓度培养中的问题培养基流加控制与其他条件控制菌体分离装置的效能菌种退化

八、发酵终点的判断(p174)（一）发酵终点的判断（即放罐时间的判断）1、判断发酵终点时要考虑的因素不同类型的发酵，要求达到的目的不同，因而对发酵终点的判断标准各有不同。2、一般终点判断标准归纳起来有两个：即产品的质量和经济效益（成本）一般原材料成本占整个生产成本核算主要部分的发酵。主要追求提高生产率、得率（转化系数）和发酵系数。若下游提取精制成本占主要部分，且产品价格比较昂贵，则除了要求高的产率和发酵系数外还要求高的产物浓度。因此，如以提高总的生产率就要缩短发酵周期，就要在产物合成速率较低时结束发酵。放罐过早、过晚都将对下阶段提取有不利的影响。因残留物对提炼有影响。（二）判断放罐的依据主要有：产物浓度、过滤速度、氨基酸、菌丝形态、DO（溶氧）、pH值、培养液的外观、粘度等。菌体自溶的迹象：氨基酸开始升高、pH值上升、菌丝碎片增多、粘度增加、过滤速度降低等。抗生素放罐时间的判断：老品种的抗生素发酵放罐时间一般都根据作业计划放罐。但在发酵异常时，放罐时间要当机立断，以免倒罐。新品种发酵要摸索合理的放罐时间。不同抗生素品种发酵终点判断有出入。绝大多数以菌体开始自溶前，极少数则在菌丝部分自溶后，以便抗生素从菌丝体内释放出来。合理放罐时间是由实验确定得，即根据不同发酵时间所得的产物量计算出发酵罐的生产能力和产品成本，采用生产力高而成本低的时间为放罐时间。同时，还要综合分析各方面的因素。第三节发酵的优化控制(p23、p175-177)一、概述如何才能更好地发挥现代生物技术的作用？以工业微生物为例，选育或构建一株优良菌株仅仅是一个开始，要使优良菌株的潜力充分发挥出来，还必须优化其发酵过程，以获得较高的产物浓度(便于下游处理)、较高的底物转化率(降低原料成本)和较高的生产强度(缩短发酵周期)。发酵过程优化：最佳控制发酵过程的方案。（一）发酵过程优化的目的目的：使细胞生理调节、细胞环境、反应器特性、工艺操作条件与反应器控制之间这种复杂的相互作用尽可能地简化，并对这些条件和相互关系进行优化，使之最适于特定发酵过程的进行。发酵过程优化的基础：是进行生物反应宏观动力学和生物反应器的研究。发酵过程优化的结果

发酵过程优化底物转化率高

菌种性能的发挥

产物浓度高有利于下游处理（二）发酵过程优化的主要研究内容第一个方面是细胞生长过程研究第二个方面是微生物反应的化学计量第三个方面是生物反应过程动力学的研究（主要研究生物反应速率及其影响因素）第四个方面的内容是生物反应器工程（包括生物反应器及参数的检测与控制）生物反应器的形式、结构、操作方式、物料的流动与混合状况、传递过程特征等。它是影响微生物反应宏观动力学的重要因素。生物反应器工程的研究内容（三）如何实现发酵过程的优化控制？生物反应过程动力学动力学模型的建立发酵过程优化控制实现发酵过程优化控制的过程建立动力学模型的目的：是为了模拟实验过程，对适用性很强的动力学模型，还可以推测待测数据，进而确定最佳生产条件。发酵过程优化涉及非结构模型和结构模型的建立。(1)生物模型；(2)传感器技术；(3)适用于生物过程的最优化技术；(4)系统动力学；(5)计算机─检测系统─发酵罐之间的接口技术（四）实现发酵过程的优化与控制必须解决的五个问题:20世纪40年代初抗生素工业的兴起，标志着发酵工业进入了一个新阶段。40年代末一门反映生物和化工相交叉的学科──生化工程诞生。1954年,Hasting指出,生化工程要解决的十大问题是深层培养、通气、空气除菌、搅拌、结构材料、容器、冷却方式、设备及培养基除菌、过滤、公害。1964年Aiba等人认为通气搅拌与放大是生化工程学科的核心，其中放大是生化工程的焦点。20世纪60年代中期，建立了无菌操作的一整套技术。（五）发酵过程优化的研究进展1973年Aiba等人进一步指出，在大规模研究方面，仅仅把重点放在无菌操作、通气搅拌等过程的物理现象解析和设备的开发上是不够的，应当进一步开展对微生物反应本质的研究。1979年，日本学者山根恒夫编著了《生物反应工程》一书，认为生物反应工程是一门以速度为基础，研究酶反应、微生物反应及废水处理过程的合理设计、操作和控制的工程学。1985年，德国学者卡尔许格尔提出生物反应工程的研究应当包括两个方面的内容∶一是宏观动力学，它涉及生物、化学、物理之间的相互关系；二是生物反应器工程，它主要涉及反应器本身，特别是不同的反应器对生物化学和物理过程的影响。发酵过程优化的研究进展目前一般认为生物反应工程是一门以生物反应动力学为基础，研究生物反应过程优化和控制以及生物反应器的设计、放大与操作的学科。生物反应工程的研究主要采用化学动力学、传递过程原理、设备工程学、过程动态学及最优化原理等化学工程学原理，也涉及到生物化学、微生物学、微生物生理学和遗传学等许多学科领域，因此是一门综合性很强的边缘学科。生化反应工程的核心是生物反应过程的数量化处理和动力学模型的建立，实现发酵过程优化则是生物反应工程的研究目标。发酵过程优化的研究进展1)针对有关发酵产品的生产过程进行微生物生长和产物形成的动力学研究，提出新的或修正的动力学模型或表达式。2)结合现代生物技术产品的开发，进行基因工程菌、哺乳动物细胞或植物细胞的生长动力学和产物形成动力学的研究。3)在动力学研究的基础上进行过程优化控制的研究，包括状态观察方程的建立、观察数据的噪声过滤、不可测参数及状态的识别、过程离线或在线的优化控制。其中尤以流加发酵的最优化研究报道居多。（六）运用生物反应工程原理进行发酵过程优化控制的研究发酵过程优化的微生物反应原理发酵过程数量化方法

微生物反应动力学

微生物反应优化的一般原理二、发酵过程优化原理１、大肠杆菌生长过程中观察到下列现象∶在大肠杆菌快速生长期间，生物合成的中间体很少渗漏到胞外培养基中，结构单元(氨基酸、核酸等)的合成速率和聚合形成大分子的速率一致。大肠杆菌胞内的大分子物质随比生长速率而变化。一旦生长培养基中的结构单元足够，细胞就不再合成这些物质。特定的代谢途径代谢特定的底物，只有底物存在时，细胞才合成相应的酶。若两个不同的底物同时存在于培养基中，细胞先合成能在一种底物上以较高比生长速率生长的酶系，当这种底物消耗完毕，再合成利用另一底物的酶。（一）发酵过程优化的微生物反应原理２、细胞生长过程可分为三个步骤：底物传递进入细胞。通过胞内反应，将底物转变为细胞质和代谢产物。代谢产物排泄进入非生物相，即胞外培养基。３、底物、代谢产物和细胞质成分的定义为：底物是一种存在于初始非生物相或者摄入物中起作用的可交换的化合物。代谢产物是一种作为代谢物产生于某代谢途径进入非生物相的化合物。细胞质成分是一种细胞利用底物产生的不可交换的化合物。研究表明在膜上可能存在三种不同的运输机制：(1)自由扩散(2)协助扩散(3)主动运输前两种机制是沿着浓度梯度进行运输，是被动的过程，在运输过程中不需要提供外部能量。而主动过程逆着浓度梯度进行运输，需要输入一定的吉布斯自由能。分解代谢反应糖类在转化为代谢产物(CO2、乳酸、乙酸和乙醇等)的同时，还形成ATP、NADH和NADPH。NADH和NADPH都在分解代谢反应中产生，但NADPH主要消耗于合成代谢中，NADH则主要消耗于分解代谢途径，如氧化磷酸化。生物合成和聚合反应为了合成细胞物质，需要合成结构单元并将其聚合。合成蛋白质需消耗大量的自由能，细胞一般根据其自身需求来调节蛋白质的合成,其合成由蛋白质合成系统(PSS)负责，该系统中核糖体是主要部分。E.coli中大约70%的能量和还原力用于合成蛋白质。４、微生物细胞的胞内反应细胞合成所需要的结构单元数在75～100之间，这些物质都是从12种前体代谢物合成得到的，这些前体代谢物就是分解代谢反应的中间产物，因此分解代谢在细胞生长过程中起着双重的作用(为生物合成提供能量和前体代谢物)。次级细胞代谢细胞代谢和生长过程偶联在一起的过程，称之为初级代谢。但许多工业上重要的产品，其合成反应并不与生长过程偶联，我们称之为次级代谢，这些反应合成的产物叫次级代谢产物，就象初级代谢形成的产物叫初级代谢产物一样。乳酸是初级代谢产物，但它是乳酸菌在非生长条件下形成的，许多其它的初级代谢产物也同样是在非生长条件下产生的。发酵过程的数量化处理包括：发酵过程的速度化学计量学和热力学生产率、转化率和产率只有当变量可测量时，才有可能对发酵过程进行数量化处理。（二）发酵过程数量化方法１、发酵过程优化的一般步骤反应过程的简化：是指把工艺过程的复杂结构压缩为少数系统，这些系统可以用关键变量来表示。定量化：系统、准确地检测发酵过程的各种参数。分离：是指在生物过程和物理过程的各种速度相互不影响的情况下，精心设计实验以获得关于生物和物理现象的数据。（三）微生物反应优化的一般原理数学建模数学模型是能以简化的形式表征过程行为，并实现特定目的的数学公式。数学模型可将特定结果通用化，并为推论系统的其它性质提供基础。建立数学模型的主要目标是：(a)为了预见任何系统的转化率或生产率；(b)用以检查在各种操作条件下工厂操作的性质和行为，检查模型适用的范围(包括外推性)；(c)用于进行工艺优化和计算机模拟；(d)用于检测出可能重要但被忽视了的参数；(e)检查是否已有效地区分生物现象和物理现象；(f)有助于阐明反应机理。从工程角度来看，要建立比较理想的模型应遵循以下原则首先要明确建立模型的目的。除为了深入研究微生物生长这一复杂现象之外，多数是为了设计微生物反应器、探索最优操作条件，或者对反应过程进行最优控制要明确建立模型的假设，从而明确模型的适用范围。模型中所含的参数，最好能分别通过实验测定。模型应尽量简单。据以上4点，可以说决定论的均相模型最合适，且使用方便。微生物是微生物反应的主角，所以希望由底物得到目的代谢产物的量最大，或者像废水的生物处理过程那样希望底物消耗量最大时，根据对微生物生长速率的影响来考虑环境条件。单一细胞或悬浮絮凝物微生物的反应动力学研究的核心是微生物的生长速率。

建立数学模型的一般原则

最优化的目标函数：产量、生产率、纯利润等，有时也对这些指标的其中二个以上进行多目标函数优化。最优化的操作变量：反应时间、培养基组成、温度、pH、溶氧等。培养基组成的优化２、分批微生物反应过程的优化无机离子或生长因子等一旦被细胞吸收，在细胞内保持原化学状态，且含量恒定不变。这类营养物质称为储存性底物。可根据这些物质在菌体内的实际含量，用类似于上式的方法确定其需要量。当代谢产物的产量与培养基组成之间的关系很复杂，不能用解析函数的方式表示时，可采用实验设计法确定最优初始浓度。利用最优实验设计法，即使不能提高产量，也可探索培养基组分的最小需用量，从而避免不必要的浪费。第四节发酵过程的计算机控制

(p177-180)发酵过程的自动控制是根据过程变量的有效测量和对发酵过程变化规律的认识，借助于由自动化仪表和计算机组成的控制器，控制一些发酵的关键变量，达到控制发酵过程的目的。一、计算机在发酵过程中的功能1、过程数据的存储通过在发酵罐上安装的与计算机连接的仪表实现对发酵参数的记录。2、数据分析由计算机的分析系统完成，可反映出发酵的状态和性质，并可显示或打印出分析结果。3、过程控制由计算机程序来完成，即计算机的信号被送至泵、阀或由接口的开关等执行元件，对发酵过程进行控制。二、发酵过程计算机控制系统及功能组成：计算机控制系统：控制硬件、操作软件被控对象：发酵罐、发酵液、菌种计算机控制系统的功能：数据信息的采集和处理、发酵过程的操作控制

发酵自控系统的硬件组成传感器变送器执行机构转换器过程接口监控计算机发酵自控系统的硬件组成三、发酵过程控制水平的三个层次第一级水平的控制：阀、泵的开关、仪表的重新校对、在线维持及故障切断过程等顺序操作。如培养基的灭菌等操作。第二级水平控制：将各种控制回路与控制系统相连，这些控制回路主要是温度、pH、泡沫、溶解氧等简单的参数。最高级控制：是生产能力提高和过程最优化的控制水平。目前仍处于初级发展阶段。四、发酵过程自动控制的内容

包括三方面内容：与发酵过程的未来状态相相联系的控制目标（温度、pH、生物量、浓度）；一组可供选择的控制动作（阀门的开或关、泵的开动或停止）；能够预测控制动作对过程状态影响的模型（用加入基质的浓度和速率控制细胞生长率时，表达两者之间关系的数学式）三者互相联系、互相制约，组成具有特定自动控制功能的自控系统。五、发酵过程进行自动控制的优点提高产品的得率；改进产品的质量；降低后续加工过程的损耗；在整个操作过程中能稳定的保持最优条件；提高对原料质量波动的适应性；减少人为因素的影响；提高工厂的生产效率；降低能耗；降低分析和操作成本。六、存在的问题发酵是一个较复杂的生化反应过程，太滞后和时变性是其主要特征。传感器：不能蒸汽灭菌；会和产品发生反应；过分敏感。第五节发酵工业的逐级放大

（24）一、发酵工业的逐级放大二、逐级放大的阶段一、发酵工业的逐级放大

由实验室小型设备到试验工厂小规模设备的试验发酵，再转为大规模设备的工业发酵生产，这个过程称为发酵的逐级放大。（二）逐级放大的阶段逐级放大的阶段：小试：小型试验中试：中间试验大试：大规模性工业试验工业发酵过程的三种规模：实验室规模——进行菌种的筛选和培养基等的研究。中试工厂规模——确定菌种培养的最佳操作条件。工厂生产规模——进行大规模生产，取得经济效益的过程。1、小试设备：实验室的小型设备。如三角瓶、1-50L发酵罐等。研究的内容：培养基的成分、配比、pH值、培养温度、通气量的大小。得出小试最佳发酵条件。产物的初步分析：产物的功能、安全性、结构。小试目标：初步评估出所发酵的产物是否具有效益性和生产的可能性。2、中试设备：试验工厂或发酵车间的小规模设备。如50L-5000L的发酵罐等。以及与之相适应的分离、过滤、提取、精制设备。研究的内容：验证小试中的最佳发酵条件、改进，使最佳发酵条件接近大规模生产，为大生产提供各种参数。核算成本、生产提供出足够的产品，进行正式的功能性、安全性、质量分析鉴定等试验，取得具有法律效力的新产品等文件。中试目标：基本确定发酵产物能否进行工业规模生产，初步确定生产该产品的必要性和可能性。3、大试大试：也称为试验性生产或工程性试验研究。设备：5000L以上的发酵罐。以及与之相适应的分离、过滤、提取、精制大型设备。研究内容：根据中试获得的最佳发酵参数进行生产，以验证、或者改进中试工艺，生产出质量合格、具有经济价值的商业性产品。核算成本、制定生产规程等。取得具有法律效力的生产许可证等有关证书。目标：确定发酵产物能否进行工业性大规模生产，生产该产品的必要性和可能性。第六节发酵过程的参数检测

(p180-182)要实施发酵过程的控制，就必须选取一些参数，并且只有通过对各种参数的检测，才能对生产过程进行定性和定量的描述，才能实现对发酵过程的控制。发酵参数可正确地反映发酵条件和代谢的变化。因此，通过对发酵参数的检测可以较好地指导生产，实现对发酵的控制。

一、发酵过程参数检测的意义二、发酵过程的参数三、发酵过程参数的检测一、发酵过程参数检测的意义（一）发酵过程检测发酵过程检测：采用一定的方法获得所给定发酵过程及其菌株的生理生化特征数据，以便对发酵过程实施有效控制。（二）目的了解过程变量的变化是否与预期的目标值相符；决定种子罐移种和发酵罐放罐时间；对不同测变量进行间接估计；对过程变量按给定值进行手动控制或自动控制；通过过程模型实施计算机控制；总之，通过对发酵参数的检测可以较好地指导生产，实现对发酵的控制。（三）检测的意义发酵工程的基本任务是高效利用微生物所具有的内在生产力，以较低的能耗和物耗最大限度的生产生物产品。要达到这样的目的，主要取决于能否维持一个生长受控的和对生产良好的环境，而要达到这样的环境，最直接和最有效的方法是通过直接测量发酵的变量来调节生物过程。因此，在线测量是高效过程运行的先决条件。在线检测对于发酵过程的控制具有十分重要的意义。二、发酵过程的参数（一）直接状态参数能直接反映发酵过程中微生物生理代谢状况的参数。包括：物理参数、化学参数、生物参数（二）间接状态参数由直接参数计算求得的参数。（一）直接参数（直接状态参数）1、物理参数2、化学参数3、生物参数1、物理参数（1）温度指发酵整个过程或不同阶段所维持的温度。温度的高低与下列参数有密切关系发酵中的酶反应速度。菌体生长速度，产物合成速度。氧在培养液中的溶解度，传递速度。发酵罐维持的压力。罐内维持正压，可防止外界空气中杂菌的侵入，保证纯种培养。罐压的高低与氧，CO2在培养液中的溶解度有关，间接影响菌体代谢。罐压一般维持在0.2～0.5公斤。（2）压力（3）搅拌转速是指搅拌器在发酵罐中转动速度。搅拌转速大小与发酵液的均匀性和氧在发酵液中的传递速率有关。发酵罐的容积(L)搅拌转速范围(r/min)3200~200010200~120030150~100050100~80020050~40050050~3001000025~2005000025~160指搅拌器搅拌时所消耗的功率，常指每立方米发酵液所消耗的功率（kW/m3）。它的大小与溶氧传递系数KLa有关。（4）搅拌功率指单位时间内单位体积发酵液通入空气的体积。它的大小与氧的传递和其它控制参数有关。一般控制在0.1～1.0vvm之间vvm：每分钟通气量与罐体实际料液体积的比值。

（5）空气流量粘度大小可作为细胞生长或细胞形态的标志之一。在发酵过程中通常用表观粘度表示。粘度的大小可改变氧传递的阻力。粘度的大小可表示相对菌体浓度。（6）粘度能及时反映单细胞生长状况。（7）浊度2、化学参数（1）pH发酵过程中各种产酸，产碱生化反应的综合结果，与菌体生长和产物合成有重要的关系。pH的高低与菌体生长和产物合成有着重要的关系。指发酵液中糖、氮、磷等重要营养物质的浓度。基质浓度的变化对产生菌的生长和产物的合成有重要影响，也是提高代谢产物产量的重要控制手段。（2）基质浓度氧是微生物体内一系列细胞色素氧化酶催化产能反应的最终电子受体，也是合成某些产物的基质。利用DO浓度的变化，可以了解微生物对氧利用的规律，反映发酵的异常情况，是一个重要的控制参数。（3）溶解氧（DO）浓度培养基氧化还原电位是影响微生物生长及其生化活性的因素之一。（4）氧化还原电位

是发酵产物产量高低，代谢正常与否的重要参数，也是决定发酵周期长短的根据。（5）产物浓度尾气中O2浓度与生产菌的摄氧率和体积氧传质速率KLa有关。尾气中CO2是产生菌呼吸放出的CO2。从尾气中O2和CO2浓度的含量可以算出产生菌的摄氧率、呼吸商和发酵罐的供氧能力。从而了解产生菌的呼吸代谢规律。（6）尾气O2浓度和CO2浓度

菌体RNA,DNA含量，以及ATP,ADP,AMP体系，NAD(P)-NAD(P)H体系。分别表示菌体生长情况，能量代谢能力，生物合成能力。（7）其它参数3、生物参数

菌（丝）体浓度（生物量biomass）

菌体浓度的大小和变化速度对生化反应有影响，特别是对抗生素等次级代谢产物的发酵，菌体浓度与培养液的粘度，DO都有关。（二）间接参数（间接状态参数）根据发酵液的菌体量和单位时间的菌浓、溶氧浓度、基质浓度和产物浓度等参数的变化值，可分别计算出菌体的比生长速率、氧的比消耗速率、基质的比消耗速率和产物比生产速率，以及摄氧率（OUR）、CO2释放速率（CER）、呼吸商（RQ）等。摄氧率r：单位体积培养液每小时所消耗的氧量（mmol/L.h）

。1、摄氧率呼吸强度QO2：单位重量的干菌体每小时所消耗的氧量（mmol/g.h）

。2、呼吸强度呼吸商RQ：发酵过程中氧的消耗比速与二氧化碳生成比速的商。3、呼吸商三、发酵过程参数的检测（一）发酵过程参数检测方式（二）参数检测常用的方法（三）参数在线测定（四）菌体浓度的测定（一）发酵过程参数检测方式１、利用仪器进行在线检测所用仪器：传感器。用于测定：罐温、压力、空气流量、电机显示搅拌转速等，以及测量状态参数pH、溶氧以及尾气中O2、CO2等。近年来菌体量、基质浓度和产物浓度也可以在线测量。２、从发酵罐中取样品进行离线检测常采用的分析方法：湿化学法、分光光度、原子吸收、高效液相色谱（HPLC）、气相色谱（GC）、气相色谱-质谱联用（GC-MS）、核磁共振（NMR）等。测定参数：发酵中的基质（糖、脂质、盐、氨基酸）、前体和代谢产物质（抗生素、酶、有机酸和氨基酸）以及菌量等。（二）参数检测常用的方法1、物理参数常用的检测方法2、化学、生物参数的测定方法参数名称单位测试方法意义、主要作用温度罐压空气流量搅拌转速搅拌功率粘度浊度泡沫体积氧传质系数KLa

ºCPaV/V.minR/minKWPa.s透光度

l/h

传感器压力表传感器传感器传感器粘度计传感器传感器间接计算维持生长、合成维持正压、增加溶氧供氧、排泄废气、提高KLa物料混合、提高KLa反映搅拌情况、KLa反映菌的生长、KLa反映菌的生长情况反映发酵代谢情况反映供氧效率1、物理参数常用的检测方法参数名称单位测试方法意义、主要作用pH基质浓度溶解氧浓度氧化还原电位产物浓度尾气氧浓度尾气CO2浓度菌体浓度RNA、DNA含量ATP、ADP、AMPNADH含量摄氧率呼吸强度呼吸商比生长速率

g/mlppmmVg/mlPa%G(DCW)/mlMg(DCW)/gMg(DCW)/gMg(DCW)/ggO2/L.hgO2/g菌.h

1/h传感器取样传感器传感器取样传感器传感器取样取样取样取样间接计算间接计算间接计算间接计算了解生长和产物合成了解生长和产物合成反映氧供需情况反映菌的代谢情况产物合成情况了解耗氧情况了解菌的呼吸情况了解生长情况了解生长情况了解能量代谢活力了解菌的合成能力了解耗氧速率了解比耗氧速率了解菌的代谢途径了解生长2、化学、生物参数常用的测定方法目前较常测定的参数：温度、罐压、空气流量、搅拌转速、pH、溶氧、基质浓度、菌体浓度(干重、离心压缩细胞体积%)等。不常测定的参数：氧化还原电位、粘度、尾气中的O2和CO2含量等。（三）参数在线测定1、参数在线测定的优点及问题优点：主要是