脓汁和粪便标本中病原菌的检测-4

斜面培养物4支，营养肉汤4支，生理盐水2支，镜油瓶、拭镜纸1套，吸水纸1本，载玻片4张。器材准备染色瓶6组，染色架8个。医学微生物学实验

综合性实验一脓汁和粪便标本中病原菌的检测（四）斜面培养物的观察革兰染色法肉汤接种法显微镜油镜的使用斜面培养物的观察从普通平板上挑取的金黄色或白色菌落接种的斜面，菌苔的颜色，还是原来菌落的颜色，金黄色或白色。从伊红美蓝平板上挑取的紫黑色或粉红色菌落接种的斜面，菌苔已经没有原来菌落的颜色。菌苔灰白色、表面湿润、光滑、不透明或半透明。为了讲解方便，以后的实验，仍然沿用初次分离得到菌落的颜色—紫黑或粉红。从斜面上取菌时，一般只取半个小菌落大小的菌量；接种环或接种针在菌苔上轻刮一下即可。

脓汁和粪便标本中病原菌的检测

实验流程(6次课12学时）①培养基的制备②细菌的分离培养③细菌的纯培养④细菌的形态学检查⑤细菌的生化试验等⑥细菌的血清学试验、结果分析→实验论文撰写细菌染色法单染色法：只用一种染料染色，能清楚观察菌体大小、形态与排列，不能鉴别细菌。复染色法（鉴别染色）：采用两种以上的不同染料进行先后染色，可将细菌染成不同的颜色，以便鉴别细菌。抗酸染色:用于检查结核分枝杆菌、麻风分枝杆菌等抗酸性细菌(※一些一旦用某些方法染色后，能够抵抗酸性酒精脱色的细菌)，阳性者为红色。特殊染色：荚膜染色，芽胞染色，鞭毛染色，极体染色（用于白喉杆菌异染颗粒染色）。结核分枝杆菌抗酸染色麻风分枝杆菌抗酸染色产气荚膜梭菌荚膜Hiss染色破伤风梭菌芽胞芽胞染色变形杆菌鞭毛Leifson染色

白喉棒状杆菌异染颗粒Albert染色革兰染色法GramStaining

革兰染色法是丹麦内科医生ChristainGram于1884年创立的一种细菌染色方法，已有120多年的历史，仍在广泛使用，是细菌学中最为经典的染色法。革兰染色法原理的三种学说通透性学说：G+菌细胞壁结构比较致密，肽聚糖层厚，脂质含量少，酒精不易透入，反而可使细胞壁脱水而形成一道屏障，阻止染料向细胞外渗。G-菌细胞壁比较疏松，肽聚糖层很薄，而外膜、脂蛋白、脂多糖均含有大量脂质，易被酒精溶解，致使细胞壁通透性增高，细胞内的结晶紫—碘复合物容易被酒精脱出。等电学说：G+菌等电点(pH2～3)比G-菌(pH4～5)低，一般染色时染液的酸碱度在pH7.0左右，电离后阳性菌带的负电荷比阴性菌多，因此与带正电荷的结晶紫染料结合牢固，不易脱色。化学学说：G+菌细胞内含有某种特殊化学成分，一般认为是核糖核酸镁盐与多糖的复合物，它与染料—媒染剂复合物结合，使已着色的细菌不易脱色。革兰染色的意义鉴别细菌：把细菌分成G+和G-两大类。选择抗菌药物：例如G+球菌对青霉素敏感,G-杆菌耐药。了解细菌的致病机理：G+菌大多产生外毒素,G-菌产生内毒素。革兰染色的步骤涂片→干燥→固定→染色涂片的制备Preparea

Smear

甲→金黄，紫黑。乙→白色，粉红。丙→金黄，紫黑。丁→白色，粉红。↑细菌合适

↑细菌较多①接种环取盐水3ul×2滴,水滴间距小于2cm。②取菌苔少许（1mm小菌落半个）与盐水混匀，涂成大于1cm2均匀涂膜。③涂毕→环移至涂膜中央侧立，待环内菌膜破裂，接种环烧灼灭菌。固定Fixation手持载玻片一端，涂膜朝上，两个涂膜快速通过火焰外层3次，时间2～3秒钟。促使菌体蛋白质凝固，固定在载玻片上，以免染色水洗的时候，细菌被水洗掉。

涂片smear干燥dry革兰染色方法步骤TheGramStainProcedure涂片→干燥→固定→↓结晶紫→初染1分钟→水洗→↓卢戈碘液→媒染1分钟→水洗→↓95％乙醇→脱色约20秒钟→水洗→↓稀释品红→复染1分钟→水洗→↓吸干,镜检。★取菌适量,涂片均匀,水洗轻缓,脱色适当。★影响革兰染色的关键步骤是涂片和脱色。革兰阳性菌Gram-Positive革兰阴性菌Gram-NegativeG+链球菌G-双球菌G+杆菌G+短杆菌G-弧菌G-螺菌液体培养基接种BrothTransfer—悬浮法SuspendingMethod甲→金黄,乙→白色,丙→紫黑,丁→粉红。标记：组号，颜色37℃培养4小时4～5×108cfu/ml①接种环斜面取菌，在靠近培养基液面管壁上，上下研磨接种。②在管壁上，将接种环内的菌膜拍破。退出接种环，烧灼灭菌。生物安全警告本次实验操作，可产生几十至几百个微生物气溶胶颗粒。气溶胶粒径＞100um沉降很快,＜50um在0.4s内扩散开,＜5um通过呼吸道直接到达肺泡。Pike博士对实验室感染统计分析结果发现，不明原因的感染高达82%，大多数是气溶胶在空气中扩散引起的。实验时应坐着，在火焰周围10～20厘米内操作，保持安静、有序，尽量少说话、少走动，以免感染病原菌。显微镜油镜的使用P13将标本放置、移动到光路上，用“黄色圈”的10×物镜找到、看清楚标本。将聚光器调到最高处。调整孔径光阑,将与物镜相对应倍率调到正面（10×→100×）。在标本观察部位上滴加一滴香柏油。将“白色圈”100×物镜放入光路，浸泡于香柏油中，可看到模糊物象。调整亮度及微调旋钮，直到物象清晰为止→观察物象，记录结果→关闭电源。油镜处理：擦镜纸拭去香柏油→擦镜纸沾少许乙醇和乙醚（3:7）混合液擦拭→擦镜纸擦拭油镜。显微镜罩上防尘罩→横放在实验柜内。※

(顺德校区）实验台两侧的电源插座，只能插入一个插头，请选择离你最近的电源插座。※（校本部）实验台中间，三个位的插座，中间那位插孔没有电，不能使用，只能用两侧的插座。100倍浸油物镜使用方法油镜放入光路之前，一定要在标本的观察部位上加一滴浸油。旋转物镜转盘，使油镜进入光路，用微调旋钮对好焦距。如果浸油内有气泡，会影响观察，可稍微旋转物镜转盘，使油镜来回通过1～2次浸油，排除油内气泡。温馨提示因染色场地受限，1～5组先涂片染色，后接种肉汤。6～10组先接种肉汤，后涂片染色。待染色和肉汤接种完毕，桌面收拾干净，才可镜检，以免污染。镜检过的载玻片不必擦拭，直接投入玻片缸内消毒、灭菌。革兰染色法P15

甲→金黄，紫黑乙→金黄，紫黑丙→白色，粉红丁→白色，粉红肉汤接种法P10

甲→金黄乙→白色丙→紫黑丁→粉红油镜的使用P13

10×物镜→看清标本→滴加香柏油→100×油镜→浸泡油中→模糊物象→细调节调焦，观察物像→记录结果→关闭电源→擦镜纸拭去香柏油→擦镜纸沾少许乙醇和乙醚（7:3）混合液擦拭→擦镜纸擦拭油镜。聚光镜孔径光阑环上的物镜倍率（10×或100×）转到正面。思考题革兰染色法的关键步骤是什么?为什么?染色时为什么通常要用新鲜的细菌培养物?如何使用油镜?实验小结用普通平板，从浓汁标本中分离得到金黄、白色两种菌落，这两株细菌，显微镜油镜下均为G+球菌，排列不规则，呈葡萄串状，是典型的葡萄球菌。结合菌落色素，这两株葡萄球菌可能是金黄色葡萄球菌和白色葡萄球菌。葡萄球菌（电镜）金黄、白色形态与染色（油镜）酸葡萄金黄、白色菌落特征黄色白色葡萄球菌三个种的鉴别试验金黄色葡萄球菌表皮葡萄球菌腐生葡萄球菌血浆凝固酶+--甘露醇发酵+--新生霉素敏感性SSRA蛋白+--α溶血素+--致病性强弱或无无注：敏感（SensitiveS）,耐药（ResistantR）。用伊红美蓝平板,从粪便标本分离、获得紫黑色和粉红色半透明两种菌落。紫黑色菌落可能是能分解乳糖的非致病菌大肠埃希菌。粉红色菌落是不能分解乳糖的致病菌。显微镜下，均为G-杆菌，散在排列，从形态上不能鉴别是什么细菌。杆菌（电镜）紫黑、粉红细菌的形态与染色（油镜）紫黑