EnzymeThermistor的乳品安全快速分析技术

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Y谢斌瑞典Lund大学纯与应用生物化学系武汉2013.03EnzymeThermistor

-酶热生物传感技术及其乳品安全的快速分析什么是生物传感器?电活性物质电极pH变化pH电极热量热敏电阻光光敏元件质量变化压电晶体酶抗体微生物细胞分子识别信号传感电信号生物传感器原理生物量热–一种万能的生物分析平台生物反应中的热量变化是一种常见形式酶-底物催化的特异性生物反应产生足够的热量测量系统对光、浊度、电等不敏感采用差分量热，环境温度变化影响小极高的分析精度（<10-5℃)适合于有机相热敏传感器无需校正样品（如，血液、奶等）一无需预处理，可直接进样分析采用流动注射分析，检测快速、成本低（约1元人民币/样品）可连续、在线分析早期设计样品酶Peltier器件酶热敏电阻样品酶流动管热敏电阻热酶电阻(a)静态分析(b)静态或流动分析(c)流动分析酶热生物分析系统数据处理信号放大固相酶柱酶热传感器流动泵进样阀进样管路缓冲载液酶热生物分析仪生物固相固态表面固相及摧化反应酶热生物传感原理ΔT=ΔH·nρCγTrTmSCΔT=Tm-TrCγ:反应器热容量ΔH:反应中热焓的变化nρ:反应物摩尔数S:底物P:产物P酶催化热焓变化●多数酶催化反应为放热反应,ΔH<0-ΔH=-100kJ/mol为典型的过氧化物酶和氧化酶的热焓，其它酶在同一数量级氧化酶可与过氧化物酶共同固相-ΔH变化叠加，增加热信号-消除过氧化氢危害，稳定了酶活性-产生额外的50%氧●Tris缓冲液能加大质子热焓，从而对如，蛋白酶等增加约-47kJ/mol的热量传感装置参数流速:0.5-2ml/mL样品量:0.01-1mL测量时间:1-6min酶柱容量:0.2-1mL固相酶量:>50units/柱固相材料:CPG,传感器:热敏电阻传感器酶柱进样样品环：50-500µL酶柱内径（I.D）:1-2mm酶柱容量：0.5to1mL

固定化酶方法（戊二醛共价交联）可控多孔(120-160nm)玻璃珠(CPG):琼脂糖凝胶:CL-6B网状玻化碳（RVC）溶胶凝胶固定化细胞方法钙果胶凝胶海藻酸钙凝胶细胞嵌入琼脂糖颗粒酶热生物传感电极酶柱装载电极置位检测条件设置检测响应信号性能特点是一种万能的生物分析平台。原理上只要存在相应的酶，就能对其底物进行特异的检测

传感器与流动样品隔离，不受光，电和化合物的直接干扰，无需经常校正

无需对待测样品，如全血、发酵液、奶等进行预处理，可直接进样分析

可进行现场的连续、在线分析，如发酵过程检测和血糖动态监测

可实现多分析物的同步检测和分析

酶柱可反复使用数百次，检测成本低，并易于更换

测量快速（约1-5分钟/样品），操作简便，可实现自动检测分析

已实现商品化和系列产品，并能根据用户的特殊要求打造

除酶分析外，还可用于细胞、微生物、酵母、ATP等分析

应用领域●

临床分析，如糖尿病●发酵过程监测，如青霉素发酵●食品安全检测分析，如乳品中非法添加剂青霉素、

β-内酰胺酶等●环境污染分析，如持续有机污染物氯酚、重金属、农药残留物等●生物分析中，如酶分析、免疫分析、细胞分析、微生物分析、DNA分析等●远程健康监测

已检测的分析物实例乳品安全快速检测分析

牛奶非法添加剂Illegaladditionofβ-lactamasewasdiscoveredinChina,in2007.Accordingtothereport,β-lactamaseactivitywasfoundin49outof77individuallypackedmilksamplescollectedfrom5retailstoresin3cities.Someofthesesampleshadextremelyhighβ-lactamaseactivity.TheministryofhealthofthePeople’sRepublicofChinaincludedβ-lactamaseintoitsnewlypublished“blacklist”ofillegalfoodadditives.β-内酰胺酶检测MethodsHPLCCylinderplatemethodchromogenicmethodDisadvantagesSamplepreparationTimeconsuming:24hr/testTimeconsuming:30min-24hr/testModifiedcylinderplatemethod:beta-lactamaseactivityisdefinedasadifferencebetweentheinhibitoryzonesofthetestsamplesandcontrolsamples.Chromogenicmethod:hydrolyticactivityofbacterialfl-lactamaseswasestimatedbythemeasurementofabsorbancechangesofnitrocefinandpiridinium-2-azo-p-dimethylamilinechromophase(PADAC).乳品快速检测装置β-内酰胺酶响应待测奶样品乳品中β-内酰胺酶检测β-内酰胺酶检测分析是基于这一原理:即，将特异性的酶催化反应与精确的流动量热分析结合起来，从而实现独一无二的、快速的乳品分析。其检测原理如下图所示。测量方法和结果1.Calibration1.Effectofflow-rate2.Effectofsamplevolume3.Effectofmilkcontents牛奶中β-内酰胺酶的检测响应0.25U/ml0.5U/ml1.0U/ml2.0u/ml5.0U/mlControl01020304050607080

Time（min）Penicillinaseactivitydeterminedinmilkwith3%fatand50%(v/v)dilution.1mMpenicillinG,flowrateof0.5ml/minandthesamplevolumeof350μlwereapplied.

不同方法优缺点对比costpersampleTime(min/sample)ContinuityDetectionlimitModifiedETmethod≈0.1$6minSemi0.5u/mlCylinderplatemethod[5]n/a>24hrNo4u/mlChromogenicmethod[7]n/a30min~24hrn/a0.49u/mlET特点分析方法简单、仪器操作方便

待测奶样品无需特殊预处理测量快速（约5-7分钟/每样品）

检测成本低（约1元人民币/每样品）灵敏度高（β-内酰胺酶的检测低于0.5U酶活性/ml奶样品）适合原料奶、奶制品和其他液态食品中的β-内酰胺酶的检测可用于其它酶的检测或酶底物的分析乳腺炎奶检测牛乳腺炎影响奶质量，严重的会引起人体中毒，因此需要严格控制原料乳中的乳腺炎感染状况。乳腺炎奶通常其乳酸的含量会增加数十倍。测量乳品中的乳酸含量不仅可控制原料乳的质量，还可追踪成品乳制品的产奶牛的健康状况。因此，乳品中乳酸的检测对于控制乳品质量具有非常重要的意义。牛奶中的乳酸的检测Comparisonoftheresultsofbuffersamplesandmilksamples.(A)buffersamples,withflow-rateof0.75ml/minandsamplevolumeof250μL.(B)1:1dilutedmilksampleswithflow-rateof0.75ml/minandsamplevolumeof250μL.分析结果固相酶柱在34天后其活性维持在82.5%（每天测量0.5mM的乳酸数次）

牛奶样品（1：1稀释）的乳酸检测精度为62

µM检测线性范围0.06–1mM以上（用乳酸氧化酶）检测时间5分钟/样品奶中尿素的检测两分析物检测原理多指标检测系统ReferencesignalMeasurementsignalCalorimetriccylinderPeristalticpumpWasteBufferInjectionvalveReferencecolumnMeasurementcolumnThermistorsReferenceprobe乳品中乳酸和尿素的同步检测双通道ET的乳酸和尿素检测

A3A4B3B4UreainSMlactateinSMlactateinVL乳酸和尿素的检测比对Thecorrelationsofureadeterminationsintwodifferenttypeofmilksbefore(A1)andafter(A2)substractingthereferencesignalofthebackground(A4)fromthemeasurementsignal(A3).Similarly,thecorrelationsforlactatebefore(B1)andafter(B2)subtractingthebackground(B4)fromthemeasurements(B3).感谢！

联系方式：电话中国手机）

+46707686216(瑞典手机）邮箱：bin.xie@tbiokem.lth.se瑞典地址：PureandAppliedBiochemistry,Box124,S-22100Lund,Sweden中国地址：欧米克生物科技（武汉）有限公司，武汉东湖新技术开发区华光大道18号，高科大厦8058室，邮编430074。电人简介

1982年毕业于华中工学院电子工程系,获工学学士1988年毕业于同济同科大学生物医学工程专业,获医学硕士1996年毕业于瑞典Lund大学纯与应用生物化学系,获博士学位1997-1998年在