第1章遗传的物质基础2

复习提问1.试解释染色体、同源染色体、染色单体的概念。2.有丝分裂的遗传学意义是什么?三、细胞的减数分裂

1．概念:减数分裂：性母细胞成熟时配子形成过程中发生的一种特殊有丝分裂

使体细胞的染色体数目减半。例如:猪2n=38、牛2n=60、山羊2n=60

减数分裂

n=19

n=30

n=30

n

(卵)+n(精)→

2n(体)

受精作用可保证物种染色体数恒定。(一)减数分裂（meiosis）过程：2．特点:

(1).各对同源染色体在细胞分裂前期配对（或联会）；(2).细胞分裂过程中包括两次分裂:

第一次分裂中染色体减数，这次分裂的前期较复杂，又可细分为五期（细线期→偶线期→粗线期→双线期→终变期）；

第二次分裂染色体等数。●减数分裂是性母细胞成熟时，配子形成过程中所发生的一种特殊的有丝分裂，又称成熟分裂(maturationdivision)。其结果是产生染色体数目减半的性细胞，所以称为减数分裂。减数分裂的特殊性表现在：●具有一定的时间性和空间性：生物个体性成熟后，动物性腺和植物造孢组织细胞中进行。●连续进行两次分裂：遗传物质经过一次复制，连续两次分裂，导致染色体数目的减半。●同源染色体在第一次分裂前期(前期I，PI)相互配对(paring)，也称为联会(synapsis)；并且在同源染色体间发生片段的交换。

减数分裂的过程(一)、间期(前间期,

preinterphase)(二)、减数第一分裂

(meiosisI)(三)、中间期

(interkinesis)(四)、减数第二分裂

(meiosisⅡ)前期I中期I后期I末期I前期II中期II后期II末期II减数分裂的过程

——间期(interphase)●性母细胞进入减数分裂前的间期称为前减数分裂间期，也称为前间期。●这一时期是为性细胞进入减数分裂作准备。其准备的内容包括：染色体复制；有丝分裂向减数分裂转化.特征：●持续时间比有丝分裂间期长，特别是合成期较长；●合成期间往往仅有约99.7%的DNA完成合成，而其余的0.3%在偶线期合成。

减数分裂的过程——前期I(prophaseI,PI)●这一时期细胞内变化复杂，所经历的时间较长，细胞核比有丝分裂前期核要大些。●根据核内变化特征，可进一步分为五个时期：(1)细线期(leptotene，PI1).(2)偶线期(zygotene，PI2).(3)粗线期(pachytene，PI3).(4).双线期(diplotene，PI4).(5)终变期(diakinesis，PI5).减数分裂的过程——细线期(leptonene，PI1)●染色体开始螺旋收缩，在光学显微镜下呈细长线状；有时可以较为清楚地计数染色体数目。●这时每个染色体含有两染色单体，由着丝点连接，但在光学显微镜下还不能分辨染色单体。减数分裂的过程——偶线期(zygotene，PI2)●同源染色体的对应部位相互开始紧密并列，逐渐沿纵向配对在一起，称为联会(synapsis)。●细胞内2n条染色体可配对形成n对染色体。配对的两条同源染色体称为二价体(bivalent)。●细胞内二价体(n)的数目就是同源染色体的对数。联会复合体(synaptonemalcomplex)的结构两条同源染色体在联会时形成一种特殊的结构——联会复合体，其构成如图所示：●两条同源染色体的主要部分(染色质DNA)分布在联会复合体的外侧；●中间部分(中央成分，centralelement)以蛋白质为主，也包含部分DNA(称为横丝)。减数分裂的过程——粗线期(pachytene，PI3)随着染色体的进一步螺旋，二价体逐渐缩短加粗，二价体具有四条染色单体，所以又称为四合体或四联体(tetrad)；联会复合体的结构完全形成；

●姊妹染色单体与非姊妹染色单体；

●非姊妹染色单体间成交换，导致同源染色体发生片段交换(exchange)，导致同源染色体间发生遗传物质重组(recombination)。粗线期细胞形态图非姊妹染色单体片断交换非姊妹染色单体片断交换减数分裂的过程——双线期(diplotene，PI4)●染色体继续缩短变粗；●非姊妹染色单体之间由于螺旋卷缩而相互排斥，同源染色体局部开始分开；●非姊妹染色单体间的交换部位仍由横丝连接，因而同源染色体间仍由一至二个交叉(chiasmata)联结。减数分裂的过程——终变期(diakinesis，PI5)●染色体进一步浓缩，缩短变粗；●同源染色体间排斥力更大，交叉向二价体两端移动，逐渐接近于末端，该过程称为交叉端化(terminalization)。●二价体在核内分散分布，因而常用以鉴定染色体数目，二价体数目就是同源染色体的对数。染色体交叉动态变化减数分裂的过程——中期I(metaphaseI,MI)●核仁和核膜消失，纺锤体形成，纺锤丝附着在着丝点上并将二价体拉向赤道板位置。●每个二价体的两同源染色体分布在赤道板的两侧，同源染色体的着丝点分别朝向两极，赤道板位置上是将同源染色体相连交叉部分(已经端化)。●在二价体趋向赤道板的过程中，两条同源染色体的排列方向(着丝粒取向)是随机的。●从纺锤体的极面观察，n个二价体分散排在赤道板的附近，因而这也是可用于鉴定染色体数目的重要时期之一。中期I二价体的随机取向●如果某生物有两对同源染色体：AA’和BB’，产生的性细胞具有AA’中的一条和BB’中的一条。●非同源染色体在性细胞中可能有22=4种组合（配子）。减数分裂的过程——后期I(anaphaseI,AI)●纺锤丝牵引染色体向两极运动，使得同源染色体末端脱开，一对同源染色体分别移向两极。●每极具有一对同源染色体中的一条(共有n条染色体)，使得子细胞中染色体数目从2n减半到n。●此过程并不进行着丝粒分裂，没有发生染色单体分离；每条染色体都仍然具有两个染色单体，并且由着丝粒相连。

减数分裂的过程——末期I(telophaseI,TI)●染色体到达两极之后，松散、伸长、变细(但通常并不完全解螺旋)；●核仁、核膜逐渐形成(核分裂完成)，产生两个子核。●细胞质也随之分裂，两个子细胞形成，称为二分体(dyad)。

减数分裂的过程——

中间期(interkinesis)中间期是减数分裂的两次分裂之间的一个间歇。此时期与有丝分裂的间期相比有显著不同：●时间很短暂。在许多动物之中，甚至没有明显的停顿和间歇存在。●不进行DNA复制，中间期前后细胞中DNA的含量也没有变化。●染色体的螺旋化程度较高。

减数分裂的过程——

减数第二分裂(meiosisⅡ)减数第二分裂是第一分裂所产生的两个子细胞继续进行同步分裂，与有丝分裂没有实质区别,仍可分为前、中、后、末四个时期：动物细胞减数分裂的模式图植物细胞减数分裂模式图(二)减数分裂的遗传学意义

减数分裂是有性生殖生物产生性细胞所进行的细胞分裂方式；而两性性细胞受精结合(细胞融合)产生合子是后代个体的起始点。减数分裂不仅是生物有性繁殖必不可少的环节之一，也具有极为重要的遗传学意义。保证了亲代与子代之间染色体数目的恒定性。双亲性母细胞(2n)经过减数分裂产生性细胞(n)，实现了染色体数目的减半；雌雄性细胞融合产生的合子(及其所发育形成的后代个体)就具有该物种固有的染色体数目(2n)，保持了物种的相对稳定。子代的性状遗传和发育得以正常进行。染色体数目的恒定(二)减数分裂的遗传学意义

为生物的变异提供了重要的物质基础。减数分裂中期I，二价体的两个成员排列方向是随机的，所以后期I分别来自双亲的两条同源染色体随机分向两极，因而所产生的性细胞就可能会有2n种非同源染色体组合形式(染色体重组，recombinationofchromosome)。另一方面，非姊妹染色单体间的交叉导致同源染色体间的片段交换(exchangeofsegment)，使子细胞的遗传组成更加多样化，为生物变异提供更为重要的物质基础(染色体片断重组，recombinationofsegment)。这也是连锁遗传规律及基因连锁分析的基础。如果某生物有两对同源染色体：AA’和BB’，产生的性细胞具有AA’中的一条和BB’中的一条。非同源染色体在性细胞中可能有22=4种组合。中期I二价体的随机取向非姊妹染色单体交叉与片断交换减数分裂有丝分裂第三节遗传物质的分子基础1、DNA是遗传物质的间接证据2、DNA是遗传物质的直接证据(1)细菌转化试验(2)噬菌体侵染与繁殖试验(3)烟草花叶病毒感染和繁殖实验一、核酸是遗传物质●

DNA含量的恒定性；●

DNA代谢的稳定性；●存在的普遍性；●基因突变与紫外线诱变波长的关系。DNA是遗传物质的间接证据(一)细菌转化试验●肺炎双球菌光滑型（S型）：SI、SII、SIII有毒性粗糙型（R型）：RI、RII、RIII无毒性●由于菌株间含有不同的多糖和蛋白质，感染动物以后诱导生成的抗体不同，区分为SI、SII、SIII等；R型由S型突变而来，相应为RI、RII、RIII等。1928年Griffith实验：DNA是遗传物质的直接证据●

1944年，Avery重复了上述实验，并把SIII型的DNA，Pr，夹膜提取物分别加入RII型培养基，结果只有DNA使少量RII型转化为SIII型，并能稳定的遗传下去。说明引起转化的物质是DNA。●上述工作是遗传学和生物化学发展史上的一个里程碑。

1952年，Hershey等用放射性同位素标记

32P标记T2噬菌体的DNA（DNA中无S）

35S标记T2噬菌体的Pr（Pr中无P）噬菌体侵染大肠杆菌实验烟草花叶病毒（TMV）感染实验烟草花叶病毒（TMV）感染实验Frankel-Conrat,Singer(1956)试验二、核酸的化学结构三、DNA的分子结构◆1953年Watson和Crick提出DNA分子双螺旋(doublehelix)模型，是分子遗传学及以之为核心的分子生物学建立的标志。DNA的二级结构(双螺旋)两条多核酸链间氢键相连A-T和C-G两种核苷酸对分子链内排列的位置和方向只有四种形式:A---TC---GA---TG---CC---GA---TG---CA---T

假设某一段DNA分子链有1000bp，则该段就可以有41000种不同的排列组合形式，反映出来的就是41000种不同性质的基因.DNA分子的一种不同构型现代显微镜下的DNA双螺旋结构我们今天认识的DNA结构四、DNA的复制(一)DNA复制的一般特点

1、复制方式：半保留复制2、复制起点：大多数细菌及病毒只有一个复制起点，一个复制子；真核生物是多起点的，多个复制子

3、复制方向：一般为双向复制

DNA半保留复制真核生物染色体多起点DNA复制电镜照片

1、半保留复制，双向复制2、有引物的引导，为RNA3、延伸方向为5'－3

'

。4、一条链一直从5'向3'方向延伸，称前导链，连续合成；另一条先沿5

'－3

'合成冈崎片段，再由连接酶连起来链，后随链，不连续合成

(二)原核生物DNA合成DNA解旋DNA合成之模型*在前导链上，DNA引物酶只在起始点合成一次引物RNA，DNA聚合酶III开始DNA的合成*在后随链上，每个冈崎片段的合成都需要先合成一段引物RNA，然后DNA聚合酶III才能进行DNA的合成。

后随链DNA的合成RNA病毒中RNA的自我复制

先以自己为模板（“＋”链）合成一条互补的单链（“－”链），然后这个“－”链从“＋”链模板释放出来，它也以自己为模板复制出一条与自己互补的“＋”链，形成了一条新生的病毒RNA。

(三)真核生物DNA合成真核生物DNA的复制与原核生物的主要不同点：1、DNA的合成只是在S期进行，原核生物则在整个细胞生长过程中都进行DNA合成2、原核生物DNA的复制是单起点的，真核生物染色体的复制则为多起点的3、所需的RNA引物及后随链上合成的“冈崎片段”的长度比原核生物要短4、有二种不同的DNA聚合酶分别控制前导链（δ）和后随链（α）的合成；在原核生物中由聚合酶III同时控制二条链的合成5、染色体端体的复制：原核生物的染色体大多数为环状

真核生物DNA复制五、RNA的转录及加工

(一)三种RNA分子

1、mRNA2、tRNA：最小的RNA，由70到90个核苷酸组成，具有稀有碱基的特点

3、rRNA：核糖体的主要成分。在大肠杆菌中：rRNA量占细胞总RNA量的75～85％tRNA占15％mRNA占3～5％tRNA的三维结构========================================================================================================================================================================================================================================(二)RNA合成的一般特点1、所用原料为核苷三磷酸；在DNA合成时为脱氧核苷三磷酸2、只有一条DNA链被用作模板；DNA合成时，两条链分别用作模板3、RNA链的合成不需要引物；DNA合成一定要引物的引导4、RNA链的合成与DNA链的合成同样，也是从5′向3′端，由RNA聚合酶催化(三)原核生物RNA的合成*转录后形成一个RNA分子的一段DNA序列称为一个转录单位

*一个转录单位可能刚好是一个基因，也可能含有多个基因

*RNA转录分三步：(1)RNA链的起始；(2)RNA链的延长；(3)RNA链的终止及新链的释放

RNA的转录过程启动子的结构RNA链的延伸(四)真核生物RNA的转录及加工真核生物与原核生物RNA的转录的不同点1、真核生物RNA的转录是在细胞核内进行，而蛋白质的合成则是在细胞质内2、原核生物的一个mRNA分子通常含有多个基因；而少数较低等真核生物外，真核生物一个mRNA分子一般只编码一个基因3、原核生物只有一种RNA聚合酶催化所有RNA的合成；真核生物中则有RNA聚合酶I、II、III，分别催化不同种类型RNA的合成4、原核生物RNA聚合酶直接起始转录合成RNA；真核生物三种RNA聚合酶都必须在蛋白质转录因子的协助下才能进行RNA的转录

真核生物mRNA在转录后的加工：

1、5′端加上帽子(7－甲基鸟嘌呤核苷)在蛋白质翻译时识别起始位置及防止被RNA酶降解2、3′端加上尾巴(聚腺苷酸,polyA)对增加mRNA的稳定性及从细胞核向细胞质的运输具有重要作用3、切除非编码序列(内含子)，将编码序列(外显子)连接起来，才能进行蛋白质的翻译

真核生物mRNA的加工六、遗传密码与蛋白质的翻译

(一)遗传密码（1）三联体密码（2）通用性（3）简并现象（4）遗传密码间不能重复利用：除少数情况外，一个mRNA上每个碱基只属于一个密码子（5）起始密码子：AUGGUG和终止密码子:UAAUAGUGA(6)遗传密码间无逗号,即在翻译过程中，遗传密码的译读是连续的核糖体的结构原核生物70S核糖体哺乳动物原核生物80S核糖体

蛋白质合成的起始蛋白质合成链的延伸蛋白质合成的终止多聚核糖体中心法则及其发展第四节基因工程简介、基因工程概述、限制性内切核酸酶、载体、基因的分离与鉴定、基因工程的应用果蝇转基因

–半乳糖苷酶基因工程概述★遗传工程一般可分为广义和狭义的两种。广义的遗传工程包括细胞工程、染色体工程、细胞器工程等。狭义的遗传工程即是通常讲的基因工程。本节只介绍基因工程。★基因工程中的DNA重组主要是指创造自然界中没有的DNA分子的新组合。这种重组不同于经典遗传学中经过遗传交换产生的重组。基因工程是采用分子生物学、核酸生物化学以及微生物遗传学的现代方法和手段建立起来的基因操作技术。１.概念：

基因工程：在分子水平上，采取工程建设方式

按照预先设计的蓝图

借助于实验室技术将某种生物的基因或基因组转移到另一生物中去

使后者定向获得新遗传性状的一门技术。

基因工程技术的建立，使实验生物学领域产生巨大变革。2.发展：1971年史密斯（SmithH.O.）等人从细菌中分离出的一种限制性酶

酶切病毒DNA分子，标志着

DNA重组时代的开始。1972年伯格（BergP.）等用限制性酶分别酶切猿猴病毒和噬菌体DNA，将两种DNA分子用连接酶连接起来

得到新的DNA分子。1973年科恩（CohenS.）等进一步将酶切DNA分子与质粒

DNA连接起来，并将重组质粒转入E.cloi

细胞中。1982年

美国食品卫生和医药管理局批准，用基因工程在细菌中生产人的胰岛素投放市场。1983年转基因烟草和马铃薯获得成功。1994年

延熟保鲜的转基因番茄

商品生产。1997年

克隆羊“多莉”诞生（苏格兰科学家利用6岁成年母羊乳腺细胞）。1998年

美国夏威夷大学用一只实验鼠的细胞克隆了3代共50只实验鼠。2000年

美国用无性繁殖技术克隆猴子“泰特拉”，意味克隆人体已无技术障碍。2001年

美国宣布首次克隆成功处于早期阶段的人体胚胎。2002年

12月法国研究者宣布克隆出第一个女婴，但一直未获得证实。2003年

5月意大利宣布克隆成功克隆马“普罗梅泰亚”

（世界上首次由哺乳动物生下它自己的克隆体，即是母女、又是姐妹关系）

。2003年

12月美国德州农业机械大学

宣布克隆成功白尾鹿。

2005年

12月韩国克隆狗斯努皮

Snuppy（中）。

1996年全世界转基因植物种植面积为170万ha，1997年为1100万ha，1998年2780万ha，1999年3990万ha，2000年4420万ha，2001年5260万ha，2002年5000万ha。1996199719981999

2000

2001

20022001年全世界转基因作物占相应作物种植总面积的比较2001年种植面积>100万公顷的转基因作物：大豆（3330万ha，

占全世界转基因作物的63%，

均为抗除草剂大豆）、玉米（980万ha

，占19%）、棉花（680万ha，占13%）、油菜（270万ha

，占5%

）；其它还有水稻、

小麦、

花生、

向日葵、

亚麻、

甘蓝、马铃薯，番茄、烟草、南瓜、木瓜、番木瓜、若干草坪草等多种转基因作物已培育成功。主要分布在美国（3570万ha）、阿根廷（1180万ha

）、加拿大（320万ha

）和中国（150万ha

）等国。

2001年我国的转基因农作物和林木已达22种，其中转基因棉花、大豆、马铃薯、烟草、玉米、花生、菠菜、甜椒、小麦等进行了田间试验，转基因棉花已经大规模商品化生产。3．内容：

①．从细胞和组织中分离DNA；②．限制性内切酶酶切DNA分子，制备DNA片段；③．将酶切DNA分子与载体DNA连接

构建能在宿主细胞内自我复制的重组DNA分子；④．把重组DNA分子引入宿主受体细胞

复制；⑤．重组DNA随宿主细胞的分裂而分配到子细胞

建立无性繁殖系（clone）或发育成个体；⑥．从细胞群体中选出所需要的无性繁殖系

并使外源基因在受体细胞中正常表达，翻译成蛋白质等基因产物、回收；或筛选出获得定向性状变异的个体。目的基因的获得目的基因与载体的连接成重组DNA分子重组DNA分子导入受体细胞筛选重组克隆基因表达与产物分离基因工程的内容重

组

DNA

技

术二限制性内切核酸酶

★限制性内切核酸酶或限制性酶(restrictionenzymes)是细菌中这些酶的功能是降解外来DNA分子的一类酶。以限制(restriction)或阻止病毒侵染。★限制性酶据其作用特点，可分为两类。

※第Ⅰ类限制性酶每隔一段DNA序列随机切割双链DNA分子，没有序列特异性。

※第Ⅱ类限制性酶能识别一段特异的DNA序列，准确地酶切双链DNA的特异序列。第Ⅱ类限制性酶识别的序列是对称的，即在一条链中从5’到3’方向的序列，与其互补链从5’到3’方向的序列完全相同。这种从两个方向阅读而序列相同的序列称为回纹对称序列(palindrome)。二限制性内切核酸酶

二限制性内切核酸酶

三载体

一个DNA片段只有与适合的载体(vector)DNA连接构成重组DNA后，在载体DNA的运载下，才可以高效率地进入宿主细胞(hostcell)，并在其中复制、扩增、克隆出多个拷贝。可作为DNA载体的有质粒、噬菌体、病毒、细菌或酵母菌人工染色体（BAC、YAC）等。作为载体DNA分子，需要具备以下四个条件：★具复制原点(ori)，在宿主细胞中不仅能独立地自我复制，而且能带动携带的外源DNA片段一起复制，★具有多克隆位点(multiplecloningsite,MCS)，而每一种酶的切点只有一个，用于克隆外源DNA片段。这些酶切位点不存在于复制原点或抗性选择标记基因内。★至少具有一个选择标记基因，使有或无载体的宿主细胞具有易鉴别的表型。★易从宿主细胞中回收。

四基因的分离与鉴定(一)从基因库中分离基因(二)聚合酶链式反应(PCR)扩增基因(三)人工合成基因

构建基因库基因库(library)是一组DNA和cDNA序列克隆的集合体。从基因库中分离基因，首先要构建基因库。只有利用合乎要求的基因库才有可能筛选出所需要的基因，很多分子遗传学工作才能继续深入下去。(一)从基因库中分离基因

2.筛选基因库

◆从基因库中筛选、分离基因，可据对待选基因相关信息的了解程度，确定筛选方法和条件。◆大多数方法是利用一段核苷酸序列(DNA，cDNA或寡核苷酸)作探针(probe)，用放射性同位素或非放射性同位素标记探针，也可用抗体作探针，筛选基因库。◆如菌斑杂交法(plaquehybridization)筛选λ噬菌体核基因库。3.阳性克隆的分析与鉴定（1）限制性酶图谱

◆构建阳性克隆的限制性酶图谱常是分析阳性克隆的第一步。根据同源性分析，可以了解阳性克隆片段的酶切位点及相对位置，用于进一步亚克隆(subcloning)或同已知的其它序列比较。◆一个15kbDNA片段的限制性酶图谱构建方法。★实验过程：首先将阳性克隆DNA分装在3个管中，分别用不同的酶及酶的组合酶切DNA。酶切的产物用于琼脂糖凝胶电泳，染色，在紫外灯下就可见到DNA带。各条带的分子量大小可根据分子量标记估测。★结果分析●从凝胶电泳结果可见，用NotⅠ酶切产生二条带，用SalⅠ酶切也产生二条带。根据模式Ⅱ预计的三个片段长度与实验结果一致，因此模式Ⅱ就是这个15kbDNA片段用上述两种酶酶切后的限制性酶图谱。●采用类似的方法，将不同DNA用限制性酶消化，根据其产生的多型性，即限制性酶片段长度的多型性(restrictionfragmentlengthpolymorphism，RFLP)，来分析DNA水平的变异程度，以RFLP作为分子标记进行基因组图谱分析。（1）限制性酶图谱

◆采用类似的方法，可将不同DNA用限制性酶消化，根据其产生的多型性，即限制性酶片段长度的多型性(restrictionfragmentlengthpolymorphism，RFLP)，来分析DNA水平的变异程度，以RFLP作为分子标记进行基因组图谱分析。◆此外，上述经NotⅠ或SalⅠ消化的片段，可以亚克隆到pUC18等质粒上，进一步用于限制性图谱分析或序列测定。（1）限制性酶图谱（2）核酸分子杂交——Southern杂交(Southernblotting)（4）核酸序列分析◆测定的核酸序列是不是所需要的基因，或具有什么功能，还要用计算机软件或生物学实验进一步分析，才能最后得出结论。●同源性比较。可将测出的核酸序列同杂交的探针序列进行比较，或将得到的序列发到BLAST等DNAData库的网址上比较，明确测得的序列与所有的已知序列之间的同源程度。●分析核酸序列的阅读框架。一个ORF就是一段能编码一条多肽链，并通常具有翻译起始信号以及一种终止信号的核苷酸序列。◆对于那些同已知序列无任何同源性的新序列，可能还要进行基因功能性研究。(二)聚合酶链式反应(PCR)扩增基因◆聚合酶链式反应(polymerasechainreaction，PCR)是体外快速扩增DNA的方法。

◆

PCR反应包括三个步骤：

●变性：在94-95℃使模板DNA的双链变性成单链。

●复性：两个引物分别与单链DNA互补复性，复性的温度在50-60℃

●延伸：在引物的引导及Taq酶的作用下，于72℃合成模板DNA的互补链

◆

这三个步骤称为一个循环，PCR反应常有25-35个循环。◆PCR.EXE(三)人工合成基因

◆根据已知的基因或氨基酸序列，将化学合成寡核苷酸的方法与酶促合成DNA的方法结合起来，可以很快地人工合成基因。◆例如，首先化学合成多个含有80-100个核苷酸的寡核苷酸，每个寡核苷酸之间具有19-24个核苷酸的重叠序列(图9－16)，再将各个寡核苷酸等量混合，在DNA聚合酶(或Taq酶)作用下，各寡核苷酸又作为引物合成新链，使单链部分补齐成为双链，再用两个PCR引物，经PCR扩增出DNA片段。若将两个DNA片段放在一起，经SOE-PCR(sequenceoverlappedextension，SOE)扩增出完整的基因片段。目的基因与载体连接(DNA分子重组)DNA分子重组目的基因导入受体

目前，基因工程研究发展迅速，已取得一系列重大突破。基因工程技术已广泛用于工业、农业、畜牧业、医学、法学等领域，为人类创造了巨大的财富。五、基因工程的应用：具有生长激素的转基因鼠转基因的方法和技术

：㈠基因工程工业：

最早应用基因工程生产人的蛋白质的方法是在细菌中表达人的胰岛素（1982）。

基因工程生产人的胰岛素的方法如图所示。

现已在细菌中生产10多种药品，例如表皮生长因子、人生长激素因子、干扰素、乙型肝炎工程疫苗等。目前，酵母菌、植物悬浮细胞、植株和动物培养细胞均成功地应用于表达外源蛋白。基因工程应用大肠杆菌生产人类生长激素㈡植物基因工程：

植物基因转化是指将外源基因转移到植物细胞内、并整合到植物基因组中稳定遗传和表达的过程。许多植物基因已经被分离、克隆。

农杆菌转化法和基因枪转化法应用最多。对照转基因抗棉铃虫品种对照抗虫稻转基因花卉如：转基因康乃馨、

矮牵牛等转基因康乃馨（1999年开始在日本销售）1.根癌农杆菌转化技术：

根癌农杆菌介导的植物转化技术应用最早（双子叶植物单子叶植物）。

过程：将目的基因与启动子（花椰菜病毒35S）及终止子组成嵌合DNA分子插入到Ti衍生质粒RB与LB内构成重组质粒

转化农杆菌细胞

利用重组农杆菌去感染植物细胞

使质粒部分DNA包括目的基因，整合到植物染色体，实现

遗传转化。

利用抗草甘膦（glyphosate）

E.coli中分离克隆的EPSP合成酶基因

培育出高抗除草剂转基因植物。农杆菌转化法：2.基因枪转化技术：

以高压气体为动力，高速发射包裹有重组DNA的金属颗粒将目的基因直接导入植物细胞整合到染色体上。转化的载体多以

pUC系列质粒为基础构建通常具有细菌复制原点及抗性选择标记、可在植物中表达的启动子终止子及调控序列、植物抗性选择标记（如除草剂、潮霉素等抗性）。

不同基因枪类型的共同特点：是用一种动力系统将金属微粒和包被DNA导入受体细胞或组织进行转化。

1.位于高压气体桶底部的爆破片；

2.载有重组DNA和金属微粒的大载体；

3.阻挡板；

4.包裹有重组DNA

的金属微粒；

5.被轰击样品。抽真空

1991年，国家启动“转基因抗虫棉”研究。

单价抗虫棉：Bt（苏云金杆菌）杀虫晶体蛋白基因

（CryIA）；双价抗虫棉：CryIA

CpTI（豇豆胰蛋白酶抑制剂

基因），更持久抗虫。

转基因抗棉铃虫品种对照抗虫方面主要采用的基因是苏云金杆菌的毒蛋白基因（Bt），害虫在转基因植株上取食会出现厌食症状而死亡。

利用抗草甘膦（glyphosate）

E.coli中分离克隆的EPSP合成酶基因，已培育出高抗除草剂转基因植物。通过转基因技术已育成稻米胚乳中含有胡萝卜素的“黄金稻”（Ye等，Science，2000，287（14））。我国至2001年，农业部批准商业化生产的转基因食物有耐贮番茄、抗黄瓜花叶病番茄和甜椒3种作物。浙江农科院原子能所陈锦清等利用基因工程改良的甘蓝型油菜超油2号含油量达到52.8%（普通油菜含油量约35%），2001年通过专家鉴定。㈢转基因动物:

转基因动物：目的基因

载体

重组DNA

微量注射法将重组DNA导入受体合子细胞核

遗传转化。如：利用转基因羊大量表达人类的抗胰蛋白酶。

可分泌人类生长因子Ⅸ的转基因羊“Polly”

。（Wilmut等，Nature385,1997）受精卵细胞注射法

转基因牛：受精卵注射法转移有人类生长激素转基因鼠同胞鼠对照人类生长激素转基因猪转基因发光鱼（新加坡育成）㈣遗传疾病诊断：

利用重组DNA技术进行遗传疾病诊断，是直接从DNA即基因水平进行诊断

准确度高，速度快。如进行产前诊断，分析胎儿是否有遗传疾病。1.RFLP法：

①.原理：限制性内切酶能识别并切割特异核苷酸序列。某位点核苷酸序列发生突变

有可能导致缺失或产生新的限制性酶切位点。若突变只发生在同源染色体的一条上，另一条正常，限制性内切酶酶切

DNA片段带型可用于鉴别同源染色体的差异。酶切后产生的DNA片段长度的差异，称为限制性片段长度多态性

（restriction

fragment

lengthpolymorphisms，RFLP）。

RFLP差异具有共显性特点。BamHI

酶切位点②.镰刀性贫血病的诊断：

该病由

－球蛋白基因一个核苷酸突变（由GAG变成GTG）导致的，这个核苷酸改变也正好导致一个限制性酶切位点改变。杂合体经酶切产生带型差异，识别该位点。2.

等位基因特异寡核苷酸法（allele-specific

oligonucleotide,ASO）：

当已知突变基因的核苷酸序列时，可用人工合成的寡核苷酸进行PCR反应，将PCR产物用作点杂交分析，鉴定基因型。这种用于检测单个核苷酸变异的方法，称为ASO法。

许多遗传疾病可用该法诊断。㈤基因治疗：

特异基因导入并整合到有遗传缺陷患者基