第13章2-细胞增殖及其调控

CELLCYCLE第二节细胞周期的调控

细胞周期周而复始地进行着，这种周期性的重复过程受到严格地控制，使得不同的细胞周期事件在空间和时间上相互协调。（一）研究背景1.MPF的发现及其作用

1960年，Masui和Markert研究爪蟾卵母细胞，提出了成熟卵母细胞中存在一种促成熟因子（maturationpromotingfactor，MPF）。Rao和Johnson(1970、1972、1974)以Hela细胞为材料，发现M期细胞具有某种促进间期细胞进行分裂的因子，即促细胞分裂因子(mitosis-promotingfactor，MPF)。3M期细胞(Hela)融合的间期细胞染色体发生凝缩，称为早熟凝集染色体(prematurelycondensedchromosome，PCC)。G1期PCC为单线状，因DNA未复制。S期PCC为粉末状，因DNA由多个部位开始复制。G2期PCC为双线染色体，说明DNA复制已完成。甚至不同类的M期细胞也可诱导PCC产生，说明M期细胞具有促进间期细胞进行分裂的因子，即成熟促进因子(maturationpromotingfactor，MPF)。染色体超前凝集（PCC）细胞融合与PCC(Prematurechromosomalcondense)2.cdc基因

LelandHartwell、PaulNurse分别以不同的酵母为实验材料，发现了许多与细胞分裂有关的基因(celldivisioncyclegene，CDC)。如芽殖酵母的cdc28、裂殖酵母cdc2基因。

如何发现的？进一步研究发现：P34cdc2与P34cdc28是同源物，二者本身并不具有激酶活性，只有当其与有关蛋白结合后，其激酶活性才能够表现出来。例如：P34cdc2必须与另一种蛋白P56cdc13结合后才具有激酶活性。

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3.cyclin

1983年TimothyHunt首次发现海胆卵受精后，在其卵裂过程中两种蛋白质的含量随细胞周期剧烈振荡，在每一轮间期开始合成，G2/M时达到高峰，M结束后突然消失，在下一个周期中又重复这一消长现象，故命名为周期素或周期蛋白(cyclin)。随后cyclin很快被分离和克隆出来，证明其广泛存在于从酵母到人类等各种真核生物中，而且在功能上存在互补性。74.MPF－P34cdc2－Cyclin？？

1988年M.J.Lohka纯化了爪蟾的MPF，经鉴定由34KD和45KD两种蛋白组成，二者结合可使多种蛋白质磷酸化。

1990PaulNurse进一步的实验证明P34实际上是P34cdc2的同源物，P45是cyclinB的同源物，而且，对于P34cdc2的活性而言，cyclin是必需的。从而将细胞周期三个领域的研究联系在一起。8MPF=P34cdc2(CDK1)+CyclinB（催化亚单位）（调节亚单位）MPF的生化成分：含有两个亚单位MPF

=Cdc2+cyclin（催化亚单位+调节亚单位）11TheNobelPrizeinPhysiologyorMedicine2001"fortheirdiscoveriesofkeyregulatorsofthecell

cycle"LelandHartwell

TimothyHunt

PaulNurse

12（二）细胞周期的检验点1989年，Hartwell通过构建酵母细胞突变模型证实了细胞周期检验点（checkpoint）的存在，并首次提出检验点的概念。细胞周期的运行，是在一系列检验点的严格检控下进行的，它保证前一个事件完成之后，才启动下一个事件，检查点是细胞的错误监测机制。13主要检验点包括：G1/S检验点：在酵母中称start点，在哺乳动物中称R点(restrictionpoint)，控制细胞由静止状态的G1进入DNA合成期，相关的事件包括：DNA是否损伤？细胞外环境是否适宜？细胞体积是否足够大？

S期检验点：DNA复制是否完成？14G2/M检验点：是决定细胞一分为二的控制点，相关的事件包括：所有DNA都正确复制了吗？DNA是否有损伤？细胞体积是否足够大？中-后期检验点（纺锤体组装检验点）：所有染色体都排列在纺锤体上了吗？任何一个着丝点没有正确连接到纺锤体上，都会抑制APC活性，引起细胞周期中断。1517（三）细胞周期蛋白cyclin的种类繁多，目前从芽殖酵母、裂殖酵母和各类动物中分离出的周期蛋白有30余种，在脊椎动物中为A1-2、B1-3、C、D1-3、E1-2、F、G、H等。分别参与细胞周期中不同时相的调节。分为G1型、G1/S型S型和M型4类。18人类细胞周期蛋白线性结构示意图实心方框代表“cyclinbox”，方框代表“destructionbox”圆形框代表PEST序列19

cyclinbox：各类周期蛋白均含有一段约100个氨基酸的保守序列，称为周期蛋白盒(cyclinbox)，介导周期蛋白与CDK(cyclin–dependentkinase)结合。Cyclin也含有降解盒（destructionbox）或PEST（脯氨酸－谷氨酸－丝氨酸－苏氨酸）序列，它可以通过定时降解或恒定地迅速周转来调节这些蛋白质的水平，起着CDK的调节亚基的作用。20

G1期

细胞在生长因子的刺激下，G1期cyclinD表达，并与CDK4、CDK6结合，使下游的蛋白质如Rb磷酸化，磷酸化的Rb释放出转录因子E2F，促进许多基因的转录。21CyclinD与CDK结合使Rb释放结合的转录因子E2F23

G1/

S期

cyclinE与CDK2结合，促进细胞通过G1/S限制点而进入S期。向细胞内注射CyclinE的抗体能使细胞停滞于G1期，说明细胞进入S期需要CyclinE的参与。

S期

将CyclinA的抗体注射到细胞内，发现能抑制细胞的DNA合成，推测CyclinA是DNA复制所必需的。24

G2/M期

cyclinA、cyclinB与CDK1结合，CDK1使底物蛋白磷酸化,如将组蛋白H1磷酸化导致染色体凝缩，核纤层蛋白磷酸化使核膜解体等下游细胞周期事件。25

M期

在分裂中期当MPF活性达到最高时，通过一种未知的途径，激活后期促进因子APC(anaphasepromotingcomplex)，负责将泛素连接在cyclinB上，导致cyclinB被蛋白酶体（proteasome）降解，完成一个细胞周期。26哺乳动物细胞周期中各时相不同cyclin的作用27（四）CDK及其调控

CDK即细胞周期蛋白依赖性激酶(cyclin–dependentkinase,CDK)，控制着细胞周期各期之间的顺序转换。CDK是一组相关联的Ser/Thr蛋白激酶。不同类型的CDK/cyclin复合体*包括D1-3，各亚型cyclinD在不同细胞中的表达量不同，但具有相同的功效。酵母中细胞周期的进程主要由单一的CDK（P34cdc2/cdc28）所控制。多细胞生物中，细胞周期各期之间的转换需要不同的CDK。30脊椎动物的CDKCDK结合的相应cyclin作用的细胞周期CDK1CDK2

CDK3CDK4CDK5CDK6CDK7CyclinA,BCyclinACyclinD1,D2,D3CyclinE

CyclinD1,D2,D3P35*,CyclinD1,D2,D3CyclinD1CyclinH,P36*G2/M转换；M早期S期G1期G1/S转换G1期G0/G1转换、G1期神经纤维的磷酸化、G1期G0/G1转换活化CDK*P35，P36的结构与细胞周期蛋白无相似性31

1．Cyclin的结合是CDK激活的第一步CDK活性的最初调节者是cyclin亚单位。Cyclin与相应的CDK结合后，引起CDK空间构象改变，暴露其催化亚基。各种细胞周期蛋白程序化的合成和降解保证各对应CDK适时的活化，维持细胞周期的正确时序。细胞周期各时相MPF、P34、P56的变化332．CDK的磷酸化与去磷酸化

以P34cdc2(CDK1)为例，如果对P34cdc2磷酸化作用位点不同，则对该酶的活性分别产生正向和负向的控制。完整的P34cdc2-cyclin复合物需要磷酸化才能被激活，驱动细胞进入有丝分裂。35

P34cdc2的Thr14和Tyr15的磷酸化引起P34cdc2-cyclin复合物的失活，Weel是催化Tyr15磷酸化的激酶，Myt1是Thr14磷酸化的激酶；催化Thr14及Tyr15脱磷酸化的蛋白磷酸酶为双特异性磷酸酶Cdc25蛋白。36P34cdc2的Thr161的磷酸化是酶的活性所必需的。CDKs活化激酶CAK（CDKsactivitingkinase）应答Thr161的磷酸化，这是另一种蛋白激酶CDK7-CyclinH复合物。当磷酸酶-1将此位点的磷酸水解，P34cdc2又失去激酶活性。373．CDK抑制剂的作用

除了磷酸化／去磷酸化可以调节MPF活性外，另有一类CDK抑制因子（CDCkinaseinhibitor,CKI）可与CDK结合抑制其活性。38（1）Ink4(Inhibitorofcdk4)：如P16ink4a、P15ink4b、P18ink4c、P19ink4d，专一地与CDK4、CDK6结合，阻止CDK和cyclinD的结合。使细胞周期不能从G1期的调控点进入到下一个时相。39（2）Cip/Kip：包括P21cip1(cyclininhibitionprotein1)、P27kip1(kinaseinhibitionprotein1)、P57kip2等，能与多种cyclin-CDK复合物包括cyclinE–CDK2、cyclinD–CDK6、cyclinD–CDK4结合，抑制cyclin-CDK复合物的蛋白激酶活性，使一些细胞增殖所需要的蛋白质磷酸化受阻，细胞停留在G1期。40

此外P21cip1还可与DNA聚合酶δ亚单位PCNA(proliferatingcellnuclearantigen,PCNA)相互作用，抑制DNA复制，但不影响DNA修复。41CDK1的激活需要Thr14和Tyr15去磷酸化和Tyr161的磷酸化

CDK1的调节与活化;CAK=CDK1-ActivitingKinase

在中期当MPF活性达到最高时，通过一种未知的途径，激活后期蛋白复合体-APC，将遍在蛋白连接在cyclinB上，导致cyclinB被蛋白酶体（proteasome）降解，完成一个细胞周期·APC介导选择性降解的靶蛋白与Ubiquitin结合

(通过泛素依赖性途径降解)·APC主要介导两类蛋白降解:AnaphaseInhibitors和MitoticCyclin.前者维持姐妹染色单体粘连,抑制后期启动；后者的降解意味着有丝分裂即将结束，即染色体开始去凝集，核膜重建。