第12章 细胞增殖及其调控

第十一章细胞增殖及其调控

第一节细胞周期与细胞分裂

细胞增殖是生命的基本特征：种族繁衍、个体发育、机体修复等离不开细胞增殖。胚胎发育从1个受精卵增至1012细胞，成年1014;成人每秒有数百万新细胞产生，补偿血细胞、小肠粘膜细胞和上皮细胞的衰老和死亡。细胞增殖是通过细胞周期(cellcycle)实现，细胞周期的运行受相关基因严格监视和调控。细胞增殖失控对个体是癌症，个体无限繁殖对地球是灾难。大肠杆菌按20min分裂1次，两天即可超过地球的重量。一、细胞周期（CellCycle)细胞周期：细胞分裂结束到下一次细胞分裂结束所经历的过程。可分4个阶段：①G1期(gap1)：分裂完成到DNA复制前的间隙②S期(synthesisphase)：DNA复制期；③G2期(gap2)：DNA复制完成到分裂开始前的一段时间；④M期(mitosis)：细胞分裂开始到结束。细胞周期可划分为四个阶段

依分裂行为，可将真核细胞分为3类：①持续分裂细胞，在细胞周期中连续运转称周期细胞，如表皮生发层细胞、部分骨髓细胞。②静止期细胞，暂时脱离细胞周期，在适当刺激下可重新进入细胞周期，称G0细胞，如淋巴细胞、肝、肾细胞等。③不分裂细胞，指不可逆地脱离细胞周期，不再分裂的细胞，又称终端细胞，如神经、肌肉、多形核细胞等。细胞周期的时间长短与物种的细胞类型有关：小鼠十二指肠上皮细胞的周期为10h；人类胃上皮细胞24h，骨髓细胞18h，培养的人成纤维细胞18h.不同类型细胞的G1长短不同，是造成细胞周期差异的主要原因。而S+G2+M变化相对较小二、细胞周期中各时相的主要事件1、G1期：从分裂完成到DNA复制前的时期，又叫合成前期。合成rRNA、蛋白质、脂类和糖类。在末期，DNA合成酶活性增加2、S期：DNA合成期，主要事件是DNA合成，还合成组蛋白、DNA复制所需的酶3、G2期：DNA含量已加倍，主要合成ATP、RNA、蛋白质等，为有丝分裂作准备；4、M期：染色质凝聚成染色体，平均分配到两个子细胞中三、细胞周期时间的测定标记有丝分裂百分率法是常用的测定细胞周期时间的方法。原理:对细胞进行脉冲标记、定时取材、放射自显影显示标记细胞，统计标记有丝分裂细胞百分数的办法测定细胞周期。①细胞经3H-TDR(胸腺嘧啶核苷)后，S期细胞均被标记。设初始值=0②S期细胞经G2期才进入M期。③开始出现M期细胞时，表示S期细胞已渡过G2期，从初始到出现M期细胞的时间间隔为TG2。④S期细胞逐渐进入M期，M期细胞数量上升，达到最高点时说明来自处于S最末阶段的细胞，已完成M，进入G1期。从开始出现M到PLM达到最高点(≈100%)的时间间隔就是TM。⑤M期细胞数量开始下降时，表明处于S期最初阶段的细胞也已进入M期，出现M期细胞到M期细胞数量又开始下降的一段时间等于TS。⑥从M期细胞出现到下一次M期细胞出现的时间就是TC，根据TC=TG1+TS+TG2+TM即可求出的TG1长度。细胞周期各阶段的时间与PLM的关系

四、细胞同步化(synchronization)为研究细胞周期中不同阶段的生化特征，须获得大量细胞周期一致性的细胞，即是细胞同步化。细胞同步化分自然同步化和人工同步化。自然同步化是自然过程中存在的现象人工同步化是利用细胞培养方法用各种理化因素处理获得的同步化生长细胞。常用的人工同步化有诱导同步化和选择同步化（一）自然同步化

1.多核体：粘菌只进行核分裂，胞质不分裂，形成多核体。多核处于同一胞质中，进行同步化分裂，使细胞核达108，体积达5~6cm。2.水生动物受精卵：海胆卵可同时授精，最初3次分裂同步；海参卵受精后，前9次分裂同步。3.增殖抑制解除后的同步分裂：真菌休眠孢子移入适宜环境后，它们一起发芽，同步分裂。（二）人工同步化1.选择同步化1）有丝分裂选择法：细胞单层培养时，有丝分裂细胞变圆隆起，与培养皿附着性低，振荡使之脱离器壁，悬浮培养，可获一定数量中期细胞。优点：操作简单，同步化程度高，细胞不受药物伤害；缺点：获得细胞数量较少(约1%～2%）.2）沉降分离法：不同时期细胞体积不同，在给定离心场中沉降的速度与其半径的平方成正比，可用离心方法分离。优点：可用于任何悬浮培养的细胞，缺点：同步化程度较低。2.诱导同步化1）DNA合成阻断法：用DNA合成抑制剂，可逆地抑制DNA合成，不影响其它时期细胞，最终可将细胞群阻断在S期或G/S交界处。常用的抑制剂有高浓度ADR、5-氟脱氧尿嘧啶、羟基脲、氨甲蝶呤等。可逆性好2）中期阻断法：利用破坏微管聚合的药物将细胞阻断在中期，常用药物有秋水仙素和秋水仙酰胺。该过程可逆性差第二节细胞分裂一、细胞分裂的类型细胞分裂(celldivision)可分3种类型:无丝分裂(amitosis)：直接分裂，核伸长，中部缢缩，后质分裂，无纺锤体形成及染色体变化。原核生物及高等动植物均有有丝分裂(mitosis):间接分裂:有纺锤体、染色体,染色体均分到子细胞，普遍存在于高等动植物。减数分裂(meiosis):染色体复制一次细胞分裂两次，是高等动植物配子体形成方式。二、有丝分裂有丝分裂是细胞周期的M期进行的分裂活动M期持续的时间很短,但形态变化很大,依形态变化的特征,常分5个时期:①前期(prophase)②早中期(premetaphase)③中期(metaphase)④后期(anaphase)⑤末期(telophase)。（一）前期(prophase)前期发生的主要事件：①染色质凝缩;②分裂极确定,纺锤体开始形成;③核仁解体;④核膜消失。最显著特征是染色质经螺旋化和折叠，变短变粗，形成光镜下可分辨的染色体，每条染色体包含2个染色单体。（二）早中期核膜解体后细胞即进入早中期。该时期主要事件是纺锤体装配.染色体进一步凝缩,形成明显的X染色体结构.染色体剧烈地活动,徘徊于两极之间,并被纺锤体捕获:一侧纺锤体微管的自由端捕获一条染色体一侧的动粒,接着另一侧纺锤体捕获另一侧的动粒,该过程是随机的.

左，早中期；右，中期

（三）中期每条染色体凝缩至最短，并整齐地排列在赤道板.位于染色体两侧的动粒微管长度相等,作用力均衡.极微管在赤道区域相互搭桥中期，右图显示与染色体联接的微管

（四）后期姊妹染色单体分开并移向两极，当子染色体到达两极后，标志该期结束。后期姊妹染色单体分离

后期A染色体分离，后期B两极延伸

（五）末期子染色体到达两极，染色体解螺旋成细丝状,核膜和核仁重新组装。末期

(六)胞质分裂M期主要进行核分裂,也涉及胞质分裂胞质分裂开始于后期,完成于末期动物细胞的胞质分裂是以形成缢缩和起沟方式完成：由大量平行排列的肌动蛋白和肌球蛋白装配成收缩环，收缩环工作原理和肌肉收缩一样，使肌动蛋白环紧缩，最终将胞质一分为二动物细胞的胞质收缩环

植物细胞的胞质分裂不同于动物，末期两极微管消失，中间微管保留，并数量增加，形成桶状的成膜体。来自高尔基体的囊泡沿微管运到成膜体中间，融合形成细胞板。囊泡内物质沉积为初生壁和中胶层，不断运来的囊泡使细胞板扩展，形成完整的细胞壁，将子细胞一分为二。囊泡膜形成新的质膜，两侧质膜来源于共同的囊泡，膜间有连通的管道，形成胞间连丝。

植物细胞成膜体的形成三、减数分裂（Meiosis）减数分裂的特点是DNA复制一次，细胞连续分裂两次，形成四个单倍体的子细胞。减数分裂过程中同源染色体间发生交换，使配子的遗传多样化，增加了后代的适应性。通常，减数分裂Ⅰ分离的是同源染色体，所以称为异型分裂(heterotypicdivision)或减数分裂(reductionaldivision)。减数分裂Ⅱ分离的是姊妹染色体，类似于有丝分裂，也称同型分裂(homotypicdivision)或均等分裂(equationaldivision)。减数分裂模式图

第一次减数分裂1、前期Ⅰ持续时间长,变化最复杂,呈现许多减数分裂的特征性变化:同源染色体配对与交换，分为5个时期：①细线期(leptotene);②偶线期(zygotene);③粗线期(pachytene);④双线期(diplotene);⑤终变期(diakinesis)。1)细线期：染色体已经复制，并开始凝缩，所以又称为凝线期(synizesis)，但染色体呈细线状，光镜下分辨不出两条染色单体。在有些物种中表现为染色体细线一端在核膜的一侧集中，另一端放射状伸出，形似花束，称为花束期(bouquetstage)。2)偶线期：同源染色体发生配对，配对的过程又称联会(synapsis)。配对的结果是两条结合在一起的染色体，称为二价体(bivalent)。每一对同源染色体都经过复制，含四个染色单体，又称四分体(tetrad)。在同源染色体联会的部位形成联会复合体(synaptonemalcomplex，SC)。3)粗线期：持续时间较长。染色体明显变粗变短，结合紧密，是明显的四分体。同源染色体非姊妹染色单体间发生交换，而且在联会复合体部位的中间有一圆球型结构形成，称重组节也有DNA合成，称P-DNA，编码一些与DNA修复、连接的酶类4）双线期：染色体进一步缩短，已看不到联会复合体。联会的同源染色体开始分离，但非姐妹染色体间还存在交叉点(chiasma)。植物双线期一般较短，但动物双线期停留的时间长，人的卵母细胞在5个月胎儿已达双线期，直到排卵都停在双线期。在鱼类、两栖类、爬行类、鸟类以及昆虫中，双线期的二价体解螺旋形成灯刷染色体。5）终变期：染色质在被装配成短棒状染色体。四分体在核内均匀分布。交叉的数目和位置在二价体上不固定，随时间向端部移动，称端化，端化过程一直进行到中期。核仁开始消失，核被膜解体。中心粒已加倍，中心体移向两极，纺锤体装配2、中期Ⅰ核被膜解体是中期Ⅰ开始的标志。纺锤体微管侵入核区，捕获分散于核中的四分体四分逐渐向赤道方向移动，最终排列在赤道面。每个二价体有4个动粒、同源染色体中的一条的动粒位于一侧。从一极发出的微管只与一条同源染色体的两个动粒相联3、后期I

二价体的两条同源染色体分开，分别向两极移动由于每条染色体仍含两条染色单体，每个极让含有两套染色体。同源染色体移向两极是随机的，使来自母本和父本染色体发生随机组合，产生基因组的变异。如人有23对染色体，染色体组合方式有223种(不包括交换)，除同卵孪生外，几乎不可能得到遗传上等同的后代。4、末期Ⅰ与减数分裂间期经后期Ⅰ后,细胞进一步变化有两种类型:①染色体到达两极后，解旋为细丝状、核膜重建、核仁形成，并进行胞质分裂,形成2个子细胞②没有明显的染色体解聚,而是立即进行第二次减书分裂。（二）、减数分裂Ⅱ可分前、中、后、末四个四期，与有丝分裂相似每个过程中细胞的形态变化也与有丝分裂相似：如在末期Ⅰ形成子细胞，则在前期Ⅱ发生核被膜解体，重新进行染色体凝聚。中期Ⅱ，染色体排列在赤道板，姐妹染色体中的动粒分别被两极的微管结合；后期Ⅱ：着丝粒对称断裂，姐妹染色体被拉向两极；末期Ⅱ：染色体完全移向两极，开始去凝聚，重新形成核膜。经过两次减数分裂形成4个子细胞，但在不同生物种类中这4个子细胞命运不同。在雄性动物中，4个子细胞大小相似，进一步发展为精子。在雌性动物中，第一次分裂为不等分裂，产生1个大的卵母细胞和1个小的极体，极体很快死亡解体。卵母细胞进行第二次减数分裂，也是不等分裂，产生1个卵细胞和1个第二极体，该极体也很快死亡解体。三、减数分裂的遗传重组及其机制1、联会复合体(SC)是减数分裂偶线期两条同源染色体间形成的一种结构，与染色体配对，交换和分离密切相关。电镜下SC由3部分组成：两侧是约40nm的侧生组分，电子密度高，主要是DNA、RNA和组蛋白；两侧之间为宽约100nm中间区，电子密度低，中央为中央组分，约30nm，为非组蛋白。侧生组分与中央组分之间有横向排列的粗约7~10nm的SC纤维，使SC外观呈梯子状。一种昆虫的联会复合体

从形态来看，SC形成偶线期，成熟于粗线期，并存在数天，消失于双线期。一直认为SC将同源染色体组织在一起，使伸入SC的DNA之间产生重组，但实验证明SC的形成晚于基因重组的启动，且在基因突变不能形成SC的酵母中，同源染色体间可以发生交换。现在认为它与同源染色体间的交换有关。2、染色体重组：交换与交叉在同源染色体联会期间，同源染色体要发生断裂和重接，在此过程中发生同源染色体间的交换。随着双线期进行，交叉开始远离着丝粒，并逐渐向染色体臂的端部移动，即端化交叉是交换的结果，交叉是可见的，而交换是不可见的第三节细胞周期调控细胞周期调控的研究有几十年历史50-60年代，细胞周期4个时期的发现在细胞周期调控研究中起有重要作用近十多年，细胞周期调控取得重要突破一、蛋白激酶在细胞周期调控中的作用（一）细胞融合实验70年，Colorado大学的Rao用处于细胞周期不同阶段的同步化细胞：G1期间和S期HeLa细胞进行融合发现S期细胞中有促进G1期细胞进行DNA复制的起始因子但S期细胞中的起始复制因子对已进行了DNA复制的G2期的细胞核没效果其它一些融合实验证明：M期细胞总能诱导非有丝分裂细胞中的染色体凝聚：染色体超前凝聚（PCC）由于G1期、S期和G2期细胞中染色质的状态不同，PCC的形态也不同：G1期PCC为单线状，因DNA未复制；S期PCC为粉末状，DNA多个部位开始复制；

G2期PCC为双线染色体，DNA复制已完成。不同形态的PCC（二）促成熟因子的发现M期细胞可以诱导PCC，提示在M期细胞中存在一种诱导染色体凝集的因子，称促成熟因子（Maturationpromotingfactor，MPF）。88年从非洲爪蟾卵中纯化出MPF。经鉴定：MPF主要含P32和P45两种蛋白质。P32和P45结合后表现出蛋白激酶的活性。从而证明MPF是一种蛋白激酶。（三）p34cdc激酶及其与MPF的关系Hartwell利用芽殖酵母分离出几十个温度敏感型突变体；Nurse以裂殖酵母也分离出温度敏感突变体；所有突变体在正常温度下能进行细胞分裂，而在限定温度下不能分裂，是由特定基因突变所导致酵母中这些与细胞分裂相关的基因被称为cdc（celldivisioncycle）基因Cdc基因依发现顺序而命名：cdc2、cdc25等Cdc基因是第一个发现的基因，表达产物是一种34KD的蛋白，称p34cdc2，具蛋白激酶活性，在裂殖酵母细胞周期中起重要作用Cdc28是第二个被分裂出来的基因，其产物也是一种34KD的蛋白，称p34cdc28，也是一种蛋白激酶，在芽殖酵母细胞周期调控中起重要作用。P34cdc28和p34cdc2都在G2/M转变中起调节作用，两者是同源物。P34cdc28对G1/S转换也必需P34cdc2和P34cdc28本身都不具备激酶活性，只有同其它蛋白结合才具激酶活性，如p34cdc2需与p56cdc16结合才表现激酶活性P34cdc2与MPF的关系：Nurse等经免疫实验证明：P32是P34cdc2的同源物；TimHunt以海胆卵为材料研究发现在卵细胞中有2种蛋白随细胞周期变化而变化，并称之为细胞周期蛋白（cyclin）对MPF进一步研究证实，MPF的另一种组分为细胞周期蛋白B，而且细胞周期蛋白B与酵母P56cdc13为同源物基于这些研究，MPF的组成被确定下来：含cdc2蛋白和周期蛋白两个亚基，其中cdc2为催化亚基，周期蛋白为调节亚基，两者结合后才具激酶活性MPF=CDC2+CyclinB（四）细胞周期蛋白（cyclin）83年发现后，已经从各种生物中克隆了数十种周期蛋白：酵母中：Cln1-3、Cld1-6；高等动物：A1-2、B1-3、C、D1-3等有些周期蛋白只在G1期表达并只在G1/S转化中起作用，称G1期周期蛋白：Cln1-3、C、D、E有些在间期积累，但只在M期才具调节作用，称M期周期蛋白：周期蛋白A、B所有周期蛋白具有共同结构特点：①具100个左右aa的周期蛋白框，介导周期蛋白与CDK结合，不同的框识别不同的CDK；②在N端有一9个aa组成的特殊序列，称破坏框，主要参与泛素介导的周期蛋白A和B的降解；③G1期周期蛋白N端没有破坏框，但C端含有一段特殊的PEST序列不同细胞周期蛋白分别在细胞周期的不同时期表达，并与不同CDK结合，调节CDK的激酶活性不同类型的周期蛋白激酶复合体脊椎动物芽殖酵母CyclinCDKCyclinCDKG1-CDKCyclinD*CDK4、6Cln3CDK1(CDC28)G1/S-CDKCyclinECDK2Cln1、2CDK1(CDC28)S-CDKCyclinACDK2Clb5、6CDK1(CDC28)M-CDKCyclinBCDK1(CDC2)Clb1-4CDK1(CDC28)*包括D1-3，各亚型cyclinD，在不同细胞中的表达量不同，但具有相同的功效（五）泛素介导的cyclin的降解泛素(ubiquitin)由76个氨基酸组成，高度保守，普遍存在于真核细胞，故名泛素。共价结合泛素的蛋白质能被蛋白酶体识别和降解，这是细胞内短寿命蛋白和一些异常蛋白降解的普遍途径，泛素相当于蛋白质被摧毁的标签。26S蛋白酶体是一个大型的蛋白酶，可将泛素化的蛋白质分解成短肽。泛素蛋白加到周期蛋白上需三种不同酶的介导：①泛素蛋白活化酶（E1）：②泛素蛋白缀活酶（E2）：③泛素蛋白连接酶（E3）：三种酶介导的周期蛋白泛素降解的过程：首先，E1上的Cys与泛素蛋白的羧基端结合形成硫酯键使泛素蛋白激活；然后，泛素蛋白从E1上转移到E2的Cys上；E2和E3一起将泛素蛋白转移到周期蛋白的Lys上进行多泛素化；最后，多泛素化的周期蛋白被蛋白酶体降解有3种cyclin激发爪蟾卵母细胞的成熟：cyclinA和两个结构相似的cyclinB。3种蛋白在N端都有一个被称为破坏框的同源区在有丝分裂后期，周期蛋白开始降解：在周期蛋白合成不久，就有泛素蛋白与之结合，后通过多泛素蛋白化作用，将周期蛋白进行标记，以便蛋白酶体将周期蛋白降解细胞周期蛋白的降解盒与降解途径

（六）APC的活性与cyclinB的降解触发周期蛋白多泛素化的E3又称促后期复合物（APC）；周期蛋白B的降解是通过对APC活性的控制进行调节的，其模型为：当MPF活性在有丝分裂中期达高峰时，MPF将APC磷酸化并激活。APC介导周期蛋白多泛素化，引起周期蛋白B降解。由于周期蛋白B是MPF的必需亚基，它的降解导致MPF失活。在G1期APC失活，导致周期蛋白B浓度升高，提高了MPF活性，细胞进入下一有丝分裂期CyclinB的降解途径

（七）CDK和CDK抑制物CDK（cyclin-dependentkinase）即细胞周期蛋白依赖性蛋白激酶，只有在和周期蛋白结合后才表现出激酶活性。已发现的CDK有CDK1-8，cdc2是第一个被发现的，被命名为CDK1在CDK中有一小段序列相当保守，称PSTAIRE序列，参与同周期蛋白的结合细胞中还有对CDK进行负调控的物质，称CDK抑制物（CDKI），主要分两大家族：①Ink4(Inhibitorofcdk4)：P16ink4a、P15ink4b、P18ink4c、P19ink4d，特异性抑制cdk4。②Kip(Kinaseinhibitionprotein)：P21cip1(cyclininhibitionprotein1)、P27kip1(kinaseinhibitionprotein1)、P57kip2等，能抑制大多数CDK活性P21cip1还能与DNA聚合酶δ的辅助因子PCNA产物(proliferatingcellnuclearantigen)结合，直接抑制DNA的合成。经过上述研究，有关细胞周期的调控机制已逐步变得较为清晰：CDK激酶在细胞周期调控中起核心作用，不同类型的周期蛋白与不同的CDK结合，构成不同的CDK激酶的活性，对细胞周期不同时期进行调节2001年美国人Leland

Hartwell、英国人PaulNurse、Timothy

Hunt因对细胞周期调控机理的研究而获诺贝尔生理医学奖。二、真核细胞的细胞周期调控模型3种类型CDK：G1期、S期和M期CDK复合物。细胞被激活进入细胞周期→G1CDK复合物表达→诱导S期CDK抑制物降解，激活S期CDK复合物→将DNA预复制物中蛋白质的调节位点磷酸化→激活DNA预复制物，阻止新预复制复合物形成→DNA复制→激活M期CDK复合物→诱导染色体凝聚、核膜解体、纺锤体装配，激活后期启动复合物→使后期抑制物降解，细胞从M期转到后期→APC诱导M期周期蛋白降解→M期CDK活性降低→染色体去凝聚、核膜重建，形成两个子细胞细胞生长因子生长因子是一大类与细胞增殖有关的信号物，已发现几十种，具促进细胞增殖功能，又称有丝分裂原(mitogen)生长因子可通过ras途径激活MAPK，MAPK进入核内，促进细胞增殖相关基因表达。如通过一种未知途径激活c-myc，myc作为转录因子促进cyclinD、SCF、E2F等G1-S有关的许多基因表达，细胞进入G1期。生长因子的作用机理

cyclinD表达与CDK4、CDK6结合，使下游的蛋白质Rb磷酸化，磷酸化的Rb释放出转录因子E2F，促进多个基因的转录，包括编码cyclinE、A和CDK1的基因。

CyclinD与CDK结合使Rb释放结合的转录因子E2F

在G1-S期，cyclinE与CDK2结合，促进细胞通过G1/S限制点进入S期。向细胞内注射CyclinE的抗体能使细胞停滞于G1期，说明细胞进入S期需要CyclinE参与。同样将CyclinA的抗体注射到细胞内，能抑制细胞DNA合成，说明CyclinA是DNA复制所必需。DNA复制

:是由起始复制点开始，起始复制点即自主复制序列。在细胞周期中，起始复制点上结合有起始识别复合体(ORC)，作用象一个停泊点，供调节因子停靠。cdc6是其中1个调节因子，在G1期cdc6含量增高，并结合在ORC上，促进MCM复合体和其它蛋白结合到ORC上，形成预复制复合体(pre-RC)S-CDK触发pre-RC启动，并将cdc6磷酸化，使其脱离ORC，磷酸化的cdc6随后被SCF参与的泛素化途径降解,保证了DNA只复制一次。每个细胞周期启动一次DNA复制

在G2-M期，cyclinA、cyclinB与CDK1结合，CDK1使底物蛋白磷酸化，如将组蛋白H1磷酸化导致染色体凝缩，核纤层蛋白磷酸化使核膜解体等下游细胞周期事件。M期CDK的激活M期CDK的激活起始于M期cyclin的积累，在胚胎细胞周期中cyclin一直在合成，其浓度取决于降解的速度；但多数细胞的分裂周期中，cyclin的积累是因为G2-M期M-cyclin基因转录的增强。随着M-cyclin的积累，结合周期蛋白的M-CDK（CDK1）增加，但没有活性，因为Wee