第12章 分子发光分析

第12章分子发光分析法MolecularLuminescenceAnalysis12-1分子发光分析概述

在化学反应过程中，分子吸收反应释放出的化学能而产生激发态物质，当回到基态时发出光辐射，这种分子受化学能激发后产生的发光现象称为化学发光。利用化学发光现象建立的分析方法称为化学发光分析。2/1/20231InstrumentAnalysis化学化工学院1.荧光和磷光的产生1）分子能级与跃迁

分子能级比原子能级复杂；在每个电子能级上，都存在振动、转动能级；

基态(S0)→激发态(S1、S2、激发态振动能级)：吸收特定频率的辐射；量子化；跃迁一次到位。12-2荧光和磷光分析基本原理2/1/20232InstrumentAnalysis化学化工学院激发态→基态：多种途径和方式(见能级图)；速度最快、激发态寿命最短的途径占优势；第一、第二、…电子激发单重态S1、S2…；第一、第二、…电子激发三重态T1、T2…；2/1/20233InstrumentAnalysis化学化工学院2）电子激发态的多重度

电子激发态的多重度：M=2S+1

S为电子自旋量子数的代数和(0或1)；平行自旋比成对自旋稳定(洪特规则)，三重态能级比相应单重态能级低；大多数有机分子的基态处于单重态；2/1/20234InstrumentAnalysis化学化工学院

S0→T1禁阻跃迁；通过其他途径进入(见能级图)；进入的几率小；

2/1/20235InstrumentAnalysis化学化工学院2）.激发态→基态的能量传递途径

电子处于激发态是不稳定状态，返回基态时，通过辐射跃迁(发光)和无辐射跃迁等方式失去能量。传递途径辐射跃迁荧光延迟荧光磷光内转移外转移系间跨越振动弛预无辐射跃迁2/1/20236InstrumentAnalysis化学化工学院

激发态停留时间短、返回速度快的途径，发生的几率大，发光强度相对大；荧光：10-7～10-9s,第一激发单重态的最低振动能级→基态；磷光：10-4～10s；第一激发三重态的最低振动能级→基态；2/1/20237InstrumentAnalysis化学化工学院S2S1S0T1吸收发射荧光发射磷光系间跨越内转换振动弛豫能量l2l1l

3

外转换l

2T2内转换振动弛豫2/1/20238InstrumentAnalysis化学化工学院非辐射能量传递过程

振动弛豫：同一电子能级内以热能量交换形式由高振动能级至低相邻振动能级间的跃迁。发生振动弛豫的时间10-14-10-12s。

内转换：同多重度电子能级中,等能级间的无辐射能级交换，时间10-13-10-11s。

。

2/1/20239InstrumentAnalysis化学化工学院通过内转换和振动弛豫，高激发单重态的电子跃回第一激发单重态的最低振动能级。外转换：激发分子与溶剂或其他分子之间产生相互作用而转移能量的非辐射跃迁；外转换使荧光或磷光减弱或“猝灭”。系间跨越：不同多重态,有重叠的转动能级间的非辐射跃迁,时间10-6-10-2s。

。改变电子自旋，禁阻跃迁，通过自旋—轨道耦合进行。2/1/202310InstrumentAnalysis化学化工学院

荧光发射：电子由第一激发单重态的最低振动能级→基态（多为S1→S0跃迁），发射波长为‘2的荧光；10-7～10-9s。

由图可见，发射荧光的能量比分子吸收的能量小，波长长；‘2>2>1；磷光发射：电子由第一激发三重态的最低振动能级→基态（T1→S0跃迁）；电子由S0进入T1的可能过程：（S0→T1禁阻跃迁）2/1/202311InstrumentAnalysis化学化工学院S0→激发→振动弛豫→内转移→系间跨越→振动弛豫→T1发光速度很慢：10-4～10s。光照停止后，可持续一段时间。2/1/202312InstrumentAnalysis化学化工学院2.激发光谱和发射光谱1）荧光(磷光)的激发光谱曲线

固定测量波长(选最大发射波长),化合物发射的荧光(磷光)强度与照射光波长的关系曲线（图中曲线I）。2/1/202313InstrumentAnalysis化学化工学院

激发光谱曲线的最高处，处于激发态的分子最多，荧光强度最大。2/1/202314InstrumentAnalysis化学化工学院2）荧光光谱(或磷光光谱)

固定激发光波长(选最大激发波长),化合物发射的荧光(或磷光强度)与发射光波长关系曲线(图中曲线II或III)。2/1/202315InstrumentAnalysis化学化工学院2/1/202316InstrumentAnalysis化学化工学院3）激发光谱与发射光谱的关系

a.Stokes位移激发光谱与发射光谱之间的波长差值。发射光谱的波长比激发光谱的长，振动弛豫消耗了能量。b.发射光谱的形状与激发波长无关电子跃迁到不同激发态能级，吸收不同波长的能量(如能级图2,1)，产生不同吸收带，但均回到第一激发单重态的最低振动能级再跃迁回到基态，产生波长一定的荧光(如‘2)。2/1/202317InstrumentAnalysis化学化工学院c.镜像规则通常荧光发射光谱与它的吸收光谱（与激发光谱形状一样）成镜像对称关系。2/1/202318InstrumentAnalysis化学化工学院镜像规则的解释

基态上的各振动能级分布与第一激发态上的各振动能级分布类似；

基态上的零振动能级与第一激发态的二振动能级之间的跃迁几率最大，相反跃迁也然。

2/1/202319InstrumentAnalysis化学化工学院2/1/202320InstrumentAnalysis化学化工学院200250300350400450500荧光激发光谱荧光发射光谱nm蒽的激发光谱和荧光光谱2/1/202321InstrumentAnalysis化学化工学院3.荧光效率罗丹明B乙醇溶液的Φ＝0.97,荧光素水溶液Φ＝0.65,菲乙醇溶液Φ＝0.10。一般都在0.10-1之间。2/1/202322InstrumentAnalysis化学化工学院4.荧光和分子结构的关系

1）分子产生荧光必须具备的条件（1）具有合适的结构；（2）具有一定的荧光量子产率。2/1/202323InstrumentAnalysis化学化工学院2）化合物的结构与荧光（1）跃迁类型：*→的荧光效率高，系间跨越过程的速率常数小，有利于荧光的产生；（2）共轭效应：提高共轭度有利于增加荧光效率并产生红移（3）刚性平面结构：可降低分子振动，减少与溶剂的相互作用，故具有很强的荧光。如荧光素和酚酞有相似结构，荧光素有很强的荧光，酚酞却没有。2/1/202324InstrumentAnalysis化学化工学院（4）取代基效应：芳环上有供电基，使荧光增强。2/1/202325InstrumentAnalysis化学化工学院2/1/202326InstrumentAnalysis化学化工学院5.荧光定量分析原理(1)定量依据荧光强度If正比于吸收的光量Ia和荧光量子效率：

If=Ia由朗-比耳定律：Ia=I0(1-10-lc)If=I0(1-10-lc)=I0(1-e-2.3lc)浓度很低时，将括号项近似处理后：

If=2.3I0lc

=Kc2/1/202327InstrumentAnalysis化学化工学院（2）环境对荧光强度的影响①溶剂的影响

除一般溶剂效应外，溶剂的极性、氢键、配位键的形成都将使化合物的荧光发生变化。②温度的影响

荧光强度对温度变化敏感，温度增加，外转换去活的几率增加。③溶液pH

对酸碱化合物，溶液pH的影响较大，需要严格控制。2/1/202328InstrumentAnalysis化学化工学院④各种散射光的影响

主要有瑞利散射光和拉曼散射光干扰。通过选择合适的激发波长来消除。⑤激发光照射的影响

有的荧光物质在激发光的照射下容易分解，引起荧光强度急剧下降。⑥荧光的猝灭

碰撞猝灭；氧的熄灭作用等。2/1/202329InstrumentAnalysis化学化工学院6.荧光定性分析

根据荧（磷）的激发光谱和发射光谱进行化合物的鉴定。2/1/202330InstrumentAnalysis化学化工学院1.仪器结构流程

测量荧光的仪器主要由四个部分组成：激发光源、样品池、双单色器系统、检测器。

特殊点：有两个单色器，光源与检测器通常成直角。12-3荧光和磷光分析仪器2/1/202331InstrumentAnalysis化学化工学院

基本流程如图：(1)光源：灯和高压汞灯，染料激光器(可见与紫外区)(2)试样池：石英材料制成，四面透光。(3)单色器：选择激发光波长的第一单色器和选择发射光(测量)波长的第二单色器；(4)检测器：光电倍增管。2/1/202332InstrumentAnalysis化学化工学院磷光检测器

荧光计上配上磷光测量附件即可对磷光进行测量。在有荧光发射的同时测量磷光。

测量方法：（1）通常借助于荧光和磷光寿命的差别，采用磷光镜的装置将荧光隔开。（2）采用脉冲光源和可控检测及时间分辨技术。室温测量时，不需要杜瓦瓶。2/1/202333InstrumentAnalysis化学化工学院2/1/202334InstrumentAnalysis化学化工学院仪

器

光

路

图2/1/202335InstrumentAnalysis化学化工学院12-4荧光分析法磷光分析法的特点和应用1.特点（1）灵敏度高：比紫外-可见分光光度法高2～4个数量级。检测下限：0.1～0.1g/cm-3；相对灵敏度：0.05mol/L奎宁硫酸氢盐的硫酸溶液。（2）选择性强：既可依据特征发射光谱，又可根据特征吸收光谱；（3）试样量少缺点：应用范围小。2/1/202336InstrumentAnalysis化学化工学院2.荧光分析法和磷光分析法的应用（1）痕量分析（2）联用技术的检测器（3）分子结构性能的测定2/1/202337InstrumentAnalysis化学化工学院(1)无机化合物的分析与有机试剂配合物后测量；可测量约60多种元素。铍、铝、硼、镓、硒、镁、稀土常采用荧光分析法；氟、、铁、银、钴、镍采用荧光熄灭法测定；铜、铍、铁、钴、锇及过氧化氢采用催化荧光法测定；铬、铌、铀、碲采用低温荧光法测定；铈、铕、锑、钒、铀采用固体荧光法测定(2)生物与有机化合物的分析见表1）荧光分析法的应用2/1/202338InstrumentAnalysis化学化工学院2/1/202339InstrumentAnalysis化学化工学院2/1/202340InstrumentAnalysis化学化工学院2）磷光分析法的应用1.稠环芳烃分析

采取固体表面室温磷光分析法快速灵敏测定稠环芳烃和杂环化合物（致癌物质）；见表2.农药、生物碱、植物生长激素的分析

烟碱、降烟碱、新烟碱，2，4-D等分析检测限0.01g/cm-3

3.药物分析和临床分析

见表2/1/202341InstrumentAnalysis化学化工学院2/1/202342InstrumentAnalysis化学化工学院2/1/202343InstrumentAnalysis化学化工学院12-5化学发光分析法

ChemiluminescenceAnalysis化学发光的反应，必须满足两个条件：（1）化学反应必须提供足够的能量，又能被反应产物分子吸收，使之处于激发态。（2）处于激发态的分子，必须能释放出光子或能够将能量转移给另一个分子，使该分子激发并以辐射光子的形式回到基态。2/1/202344InstrumentAnalysis化学化工学院

在化学反应过程中，某些化合物接受能量而被激发，从激发态返回基态时，发射出一定波长的光。A+B=C+D*D*→D+h（1）能够发光的化合物大多为有机化合物，芳香族化合物；（2）化学发光反应多为氧化还原反应，激发能与反应能相当E=150～400kJ/mol；位于可见光区；（3）发光持续时间较长，反应持续进行；化学发光反应存在于生物体(萤火虫、海洋发光生物)中，称生物发光(bioluminescence)。2/1/202345InstrumentAnalysis化学化工学院化学发光强度与化学发光分析的依据

在化学发光分析中，被分析物相对于发光试剂小得多，对于一级动力学反应：

dc/dt=Kc；K为反应速率常数。定性依据：（1）在一定条件下，峰值光强度与被测物浓度成线性；2/1/202346InstrumentAnalysis化学化工学院（2）在一定条件下，曲线下面积为发光总强度(S)，其与被测物浓度成线性：液相中的化学发光反应机理研究较多，在分析中应用最多；可测痕量的H2O2、Cu、Mn、Co、V、Fe、Cr、Ce、Hg、Th等。2/1/202347InstrumentAnalysis化学化工学院

应用最多的发光试剂：鲁米诺（3-氨基苯二甲酰肼）；化学发光反应效率：0.15～0.05；鲁米诺在碱性溶液中与双氧水的反应过程：2/1/202348InstrumentAnalysis化学化工学院

该发光反应速度慢，某些金属离子可催化反应；利用这一现象可测定这些金属离子。（1）该发光反应速度慢，某些金属离子可催化反应；利用这一现象可间接测定这些金属离子。可测痕量的Cu2+、Mn2+、Co2+、V4+、Fe2+、Fe3+、Ni2+、Ag+、Au3+、Hg2+等化学与生物发光分析的应用2/1/202349InstrumentAnalysis化学化工学院氨基酸+O2

酮酸+NH3+H2O2氨基酸氧化酶葡萄糖+O2+H2O葡萄糖酸+H2O2通过测定生成的H2O2，确定氨基酸、葡萄糖含量。葡萄糖氧化酶（2）可检测低至10-9mol/L的H2O2；（3）间接测定某些生物试样2/1/202350InstrumentAnalysis化学化工学院生物发光分析应用1

在pH7～8；荧光素酶(E)和Mg2+的存在下，荧光素(LH2)与磷酸三腺甙(ATP)的反应，生成磷酸腺甙(AMP)荧光素和荧光素酸的复合物和镁的焦磷酸盐(ppi)：ATP+LH2+E+Mg2+

AMP·LH2·E+Mgppi+2H+pH7-8复合物与氧反应，产生化学发光：2/1/202351InstrumentAnalysis化学化工学院

AMP·LH2·E+O2[氧化荧光素]*+AMP+CO2+

H2O[氧化荧光素]*氧化荧光素+h最大发射波长562nm。

烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADH)在细菌中的黄素酶作用下，在氧化型黄素单核苷酸(FMA)存在下，发生发光反应：