现代分子生物学第5章

第五章分子生物学研究法（上）DNA、RNA及蛋白质操作技术现代分子生物学的快速发展，得益于上个世纪中叶以来研究方法、特别是基因操作和基因工程技术的进步。P166基因操作主要包括DNA分子的切割与连接、杂交、电泳、细胞转化、核酸序列分析以及基因人工合成、表达、定点突变和PCR扩增等，是分子生物学研究的核心技术。基因工程是指在体外将核酸分子插入病毒、质粒或其它载体分子，构成遗传物质的新组合，使之进入原先没有这类分子的寄主细胞内并进行持续稳定的繁殖和表达。基因工程技术是核酸操作技术的一部分，只不过它强调了外源核酸分子在另一种不同的寄主细胞中的繁衍与性状表达。事实上，这种跨越物种屏障、把来自其它生物的基因置于新的寄主生物细胞之中的能力，是基因工程技术区别于其它技术的根本特征。P166P166(一)工具酶1.限制性内切核酸酶P157/166能够识别DNA上的特定碱基序列并从这个位点切开DNA分子。第一个核酸内切酶EcoRI是Boyer实验室在1972年发现的，它能特异性识别GAATTC序列，将双链DNA分子在这个位点切开并产生具有粘性末端的小片段。图5-1几种主要DNA内切酶所识别的序列及其酶切末端。P157/168EcoRV2.T4DNA连接酶

从T4噬菌体感染的大肠杆菌中发现和分离，它是T4噬菌体基因的产物，由一条多肽组成，分子量为68KD。催化两条DNA链的3’-OH和5’-P之间形成磷酸二酯键而把两个DNA分子连接在一起。图5-2DNA连接酶能把不同的DNA片段连接成一个整体T4DNA连接酶催化反应条件

必须存在Mg2+和ATP。最佳pH为7.5—7.6；温度在37℃时酶活力最高，5℃以下活力显著降低。由于同时必须考虑DNA的稳定性和粘性末端的退火温度，在进行连接反应时的温度，对平齐末端连接—般采用20一25℃，对粘性末端连接则采用12℃左右。仅仅能在体外利用限制性核酸内切酶和DNA连接酶进行DNA的切割和重组，还不能满足基因工程的要求，只有将它们连接到具备自主复制能力的DNA分子上，才能在寄主细胞中进行繁殖。（二）基因克隆的载体P158/167具备自主复制能力的DNA分子就是分子克隆的载体（vector）。病毒、噬菌体和质粒等小分子量复制子都可以作为基因导入的载体。（二）基因克隆的载体大肠杆菌质粒载体:1、pSC101质粒载体低拷贝数严紧型复制控制的大肠杆菌质粒载体，平均每个寄主细胞仅有1~2个拷贝。长9.09kb，带有四环素抗性基因（tetr）及EcoRI、HindIII、BamHI、SalI、XhoI、PvuII以及SmaI等7种限制性核酸内切酶的单酶切位点，在HindIII、BamHI和SalI等3个位点插入外源基因，会导致tetr失活。

大肠杆菌pSC101质粒载体示意图。是第一个真核基因克隆载体。缺点：它是一种严紧型复制控制的低拷贝质粒，从带有该质粒的寄主细胞中提取pSC101DNA，产量很低。2、ColE1质粒载体松弛型复制控制的多拷贝质粒。一般情况下，当培养基中氨基酸被耗尽，或是在细胞培养物中加入氯霉素以抑制蛋白质的合成，寄主染色体DNA的复制便被抑制，细胞的生长也随之停止。而松弛型质粒DNA却继续复制数小时，使每个寄主细胞中ColE1质粒的拷贝数达到1000~3000个，占细胞总DNA的50%左右。3、pBR322质粒载体由三个不同来源的部分组成的：第一部分来源于pSF2124质粒易位子Tn3的氨苄青霉素抗性基因（AmpR）；第二部分来源于pSC101质粒的四环素抗性基因（tetr）；第三部分则来源于ColE1的派生质粒pMB1的DNA复制起点（ori）。AmpR优点是具有较小的分子量，其长度为4363bp。不仅易于纯化，而且即使携带上一段6-8kb的外源DNA片段，操作起来仍较为便利。具有两种抗生素抗性基因以用作转化子的选择记号。有较高的拷贝数，若经过氯霉素扩增，每个细胞中可累积1000~3000个拷贝，为重组体DNA的制备提供了极大的方便。4、pUC质粒载体（包括四个部分）：(1)来自pBR322质粒的复制起点（ori）；(2)氨苄青霉素抗性基因（ampr）；(3)大肠杆菌β-半乳糖酶基因（lacZ）的启动子及其编码α-肽链的DNA序列，此结构特称为lacZ’基因；(4)位于lacZ’基因中的靠近5’-端的一段多克隆位点（MCS）区段，外源基因插入后破坏了lacZ’基因的功能。优点：更小的分子量和更高的拷贝数。在pBR322基础上构建pUC质粒载体时，仅保留下其中的氨苄青霉素抗性基因及复制起点，其分子小了许多，pUC8为2750bp，pUC18为2686bp。由于缺失rop基因，pUC质粒不经氯霉素扩增时，平均每个细胞即可达500~700个拷贝。可用组织化学方法检测重组体。pUC8质粒结构中具有来自大肠杆菌lac操纵子的lacZ‘基因，所编码的α-肽链可参与α-互补作用。因此，可用X-gal显色法实现对重组体转化子的鉴定。具有多克隆位点MCS区段，可以把具两种不同粘性末端（如EcoRI和BamHI）的外源DNA片段直接克隆到pUC8质粒载体上。5、pGEM-3Z质粒长度为2743bp，编码有一个氨苄青霉素抗性基因和一个lacZ'基因。含有两个噬菌体启动子（T7和SP6），为RNA聚合酶的附着作用提供了特异性的识别位点。加入T7或SP6RNA聚合酶，所克隆的外源基因便会转录出相应的mRNA。6、穿梭质粒载体（shuttleplasmidvector）指由人工构建的具有两种不同复制起点和选择记号，可在两种不同的寄主细胞中存活和复制的质粒载体。由于这类质粒载体可以保证外源DNA序列在不同物种的细胞之间得到扩增，能在原核和真核细胞之间往返穿梭，具有广泛的用途。7、pBluescript噬菌粒载体pBluescript是指由Stratagene公司发展的一类从pUC载体派生而来的噬菌粒载体，简称为pBS（+/-），如今则更多地叫作pBluescriptKS（+/-）或pBluescriptSK（+/-）。SK表示多克隆位点区的取向，即lacZ基因是按照SacI→KpnI的方向转录；（+/-）表示单链噬菌体f1复制起点的两种相反的取向。f1（+）起点表示当pBluescript噬菌粒载体和辅助噬菌体共感染寄主细胞时，能够回收到lacZ基因的有意义链DNA；而f1（-）起点则表示当pBluesript噬菌粒载体与辅助噬菌体共感染寄主细胞时，可回收到lacZ基因的无意义链DNA。(i)在多克隆位点区（MCS）的两侧，存在一对T3和T7噬菌体的启动子，用以定向指导插入在多克隆位点上的外源基因的转录活动；(ii)具有单链噬菌体M13或f1的复制起点和一个来自ColE1质粒的复制起点，保证pBluescript噬菌粒载体在有或无辅助噬菌体共感染的不同情况下，按照不同的复制形式分别合成出单链或双链DNA；(iii）编码有一个氨苄青霉素抗性基因，作为转化子克隆的选择标记；(iv)含有一个lacZ基因，可以按照X-gal-IPTG组织化学显色法筛选噬菌粒载体的重组子。P160/172图5-5重组DNA操作过程示意图获得了用外源DNA片段和载体分子重组而成的杂种DNA分子后，还必须通过一个被称为细菌转化的过程将其重新导入到寄主细胞中，才能保证重组DNA分子的增殖（图5-5）。P171

重组DNA（基因工程/分子克隆）的主要步骤包括以下四个基本步骤(1)目的基因的获得；(2)目的基因与载体分子在体外进行连接反应，形成重组体；(3)将人工重组的DNA分子导入能进行正常复制的寄主细胞，从而得到复制；(4)重组体分子的转化子克隆的选择和筛选图5-5重组DNA操作过程示意图

(a)5.2DNA操作技术5.2.1核酸凝胶电泳P173自从琼脂糖（agarose）和聚丙烯酰胺（polyacrylamide）凝胶被引入核酸研究以来，按分子量大小分离DNA的凝胶电泳技术，已经发展成为一种分析鉴定重组DNA分子及蛋白质与核酸相互作用的重要实验手段。一种分子被放置到电场中，它就会以一定的速度移向适当的电极。我们把这种电泳分子在电场作用下的迁移速度，叫做电泳的迁移率，它与电场强度和电泳分子本身所携带的净电荷数成正比，与片段大小成反比。P173生理条件下，核酸分子中的磷酸基团呈离子化状态，所以，DNA和RNA又被称为多聚阴离子（polyanions），在电场中向正电极的方向迁移。由于糖-磷酸骨架在结构上的重复性质，相同数量的双链DNA几乎具有等量的净电荷，因此它们能以同样的速度向正电极方向迁移。琼脂糖凝胶分辨DNA片段的范围为0.2~50kb之间。聚丙烯酰胺凝胶的分辨范围为1到1000个碱基对之间。凝胶浓度的高低影响凝胶介质孔隙的大小，浓度越高，孔隙越小，其分辨能力就越强。表5-2琼脂糖及聚丙烯酰胺凝胶分辨DNA片段的能力P174凝胶类型及浓度分离DNA的大小范围（bp）0.3%琼脂糖50000~10000.7%琼脂糖20000~10001.4%琼脂糖6000~3004.0%聚丙烯酰胺1000~10010.0%聚丙烯酰胺500~2520.0%聚丙烯酰胺50~1图5-4溴化乙锭染料的化学结构及其对DNA分子的插入作用。由于插入了溴化乙锭分子，在紫外光照射下，琼脂糖凝胶电泳中DNA的条带便呈现出橘黄色荧光，易于鉴定。图5-6DNA脉冲电场凝胶电泳示意图P1745.2.2细菌转化与目标DNA分子的增殖P175细菌转化（transformation），是指一种细菌菌株由于捕获了来自供体菌株的DNA而导致性状特征发生遗传改变的过程。提供转化DNA的菌株叫作供体菌株，接受转化DNA的细菌菌株则被称为受体菌株。

在基因克隆中，通常要通过细菌转化方法将体外构建好的杂种DNA分子导入宿主细胞中。外源DNA通过自身载体上的复制起始点进行复制增殖，能在宿主细胞中长期保存下来，并能以完整的形式从细胞中被分离纯化出来。P175为提高效率，可对受体菌进行物理或化学处理，增加其获取DNA的能力。经过这种处理的细胞被称作感受态细胞（competentcells）。常用的方法：P175–CaCl2法–电击法基因工程中常用α-互补来筛选重组质粒(蓝白斑筛选重组子的分子机制)，请说明其原理。很多载体都携带一段细菌的lacZ基因，它编码β-半乳糖苷酶N-端的146个氨基酸，称为α-肽，载体转化的宿主细胞为lacZ基因型，它表达β-半乳糖苷酶的C-端肽链，当载体与宿主细胞同时表达两个片段时，宿主细胞才有β-半乳糖苷酶活性，使特异的底物X-gal变为蓝色化合物，这就是所谓的α-互补，而重组子由于基因插入使α-肽基因失活，不能形成α-互补，在含X-gal的平板上，含阳性重组子的细菌为无色菌落。P163/175最后一段P165/177图5.2.3P1775.2.3聚合酶链式反应（PCR）技术聚合酶链式反应是一种在体外快速扩增特定基因或DNA序列的方法，因此也称为基因的体外扩增法。它可以在试管中建立反应，经过数小时之后，就能将极微量的目的DNA或某一特定的DNA片段扩增十万乃到上千万倍，无需通过繁琐的基因克降测序，便可得到足够数量的精确的DNA拷贝，因此也被称为无细胞分子克隆。5.2.3聚合酶链式反应（PCR）技术PCR反应的模板DNA若是基因组上的某个片段，就称为genomicPCR，若是mRNA反转录产生的cDNA，就称为RT-PCR。（P165/177）P165/177图5-9聚合酶链式反应（PCR）技术原理示意图P177图5-10PCR指数扩增时循环次数与DNA产物数量的比较P17894℃加热，淬火降低反应温度（退火，约50℃），约1分钟，使寡核苷酸引物与两条单链模板DNA结合在靶DNA区段两端的互补序列位置上。50℃~60℃，退火引物与模板DNA相结合将反应混合物的温度上升到72℃左右保温1-数分钟，在DNA聚合酶的作用下，从引物的3'-端加入脱氧核苷三磷酸，并沿着模板分子按5'→3'方向延伸，合成新生DNA互补链。PCR扩增，72℃左右,按每分钟1000个碱基对设计循环往复其应用主要是以下几个方面：（1）基因克隆；DNA测序；分析突变；基因重组与融合；检测基因的修饰；鉴定与调控蛋白质结构的DNA序列；转座子插入位点的绘图；合成基因的构建；构建克隆或表达载体；检测某基因的内切酶多态性等。（2）临床诊断细菌、病毒、螺旋体、支原体、衣原体、立克次氏体、分枝杆菌等病原体的鉴定；人类遗传病的鉴定；诊断遗传疾患；监测临床标本中病原体的核酸序列；对法医学标本做遗传学鉴定；分析激活癌基因中的突变情况；生成克隆化双链DNA中的特异序列作为探针。PCR相关技术及应用问题：PCR与细胞内DNA复制有哪些主要的相同点和不同点相同点：反应的底物都是dNTP(dATP、dCTP、dTTP、dGTP)都需要DNA聚合酶的催化，而且链的延伸都只能是5`——3`方向；都需要模板，都按半保留复制机理进行；都需要引物；都需要Mg2+不同点：细胞内DNA的复制是半不连续复制，而PCR中，DNA是连续复制；细胞内DNA的复制时，不需要将双链完全解开形成单链，按半不连续方式进行DNA的复制。而PCR反应中，DNA双链必须完全解链，复制过程都是连续进行的。细胞内DNA的复制时，DNA的解链通过解链酶催化，而PCR反应中是通过高温使双链解离；细胞内DNA的复制时，引物是通过RNA聚合酶合成的RNA链，而PCR反应中所需的引物是人工合成的寡聚核苷酸；细胞内DNA的复制时，温度保持一致，而PCR反应中，温度在解链温度、退火、延伸3个温度之间变化。5.2.4实时定量PCRP178（realtimequantitativePCR，Q-PCR）由于PCR敏感性高，扩增产物总量变异系数大，定量不准确。90年代末期出现了Q-PCR，利用荧光检测PCR仪绘制DNA扩增过程中的累积速率动态变化图，基本消除在测定终端产物丰度时变异系数较大的问题。实时定量PCR反应在带透明盖的塑料小管中进行,激发光可以直接透过管盖,使其中的荧光探针被激发.荧光探针事先混合在PCR反应液中,只有与DNA结合后，才能够被激发出荧光。随着新合成DNA片段的增加，由于结合到DNA上的荧光探针增加，被激发产生的荧光相应增加。最简单的DNA结合的荧光探针是非序列特异性荧光染料SYBRGreenI,激发光波长520nm,这种荧光染料只能与双链DNA结合,并且只有在与DNA结合时,才能被激发产生荧光。SYBRGreenI作探针的实时定量PCR实验过程图示利用SYBRGreenI可以检测PCR反应中获得的全部双链DNA,但是不能区分不同的双链DNA.为确保荧光检测的确实是靶DNA，又设计了仅能与目的DNA特异结合的荧光探针,如TaqMan探针。TaqMan探针是一段与靶DNA序列中间部位结合的单链DNA，长50bp-150bp，该DNA的5’和3’端带有短波长和长波长两个不同荧光基团，由于彼此距离靠近，在荧光共振能量转移（FRET）作用下发生荧光淬灭，因而检测不到荧光。随着PCR反应的进行，TaqMan探针结合到目的DNA序列上，并且会被具有外切酶活性的TaqDNA聚合酶逐个切除而降解。切下来的荧光基团解除了荧光淬灭的束缚，会在激发光下发出荧光，因此，产生的荧光强度直接反映了所扩增靶DNA的总量。TaqMan探针具有三个要素：一端的短波长荧光基团（菱形）一段目的DNA特异的碱基序列另一端的长波长荧光基团（小圆形）P179图5-12TaqMan探针实时定量PCR技术Ct值是产物荧光强度首次超过设定阈值时，PCR反应所需的循环数。利用标准曲线，可以确定样品中待检测靶DNA的绝对含量。

图5-11用实时定量PCR法分析未知样品靶基因的绝对表达量。对于高等真核生物而言，基因组DNA十分庞大,基因可达数万个，且基因组成结构复杂，除编码序列，还有非编码序列及调控序列，基因间还存在大量的间隔序列和重复序列，因此，单个目的基因在整个基因组中所占的比例极其微小，除少数例外，绝大多数基因难以直接分离得到。5.2.5基因组DNA文库构建P183

为了解决这个难题，一种可行的方法就是将这个基因扩增，增加成功分离目的基因的可能性。但是由于要分离的目的基因往往是未知基因，因此无法对它进行特异性扩增，而只能对所有的基因进行扩增，也就是构建该生物材料的基因文库，然后再根据不同的方法将所需的克隆筛选出来，最后分离得到目的基因。5.2.5基因组DNA文库构建把某种生物的基因组DNA切成适当大小，分别与载体组合，导入微生物细胞，形成克隆。汇集包含基因组中所有DNA序列的克隆（理论上每个序列至少有一个代表），这样的克隆片段的总汇，称为基因组DNA文库。基因组DNA文库的用途：P183第二段用于分离特定的基因片段分析特定基因结构研究基因表达调控用于全基因组物理图谱的构建和全基因组序列测定等构建基因组DNA文库的步骤

P183最后一段（1）第一步是制备大小合适的随机DNA片段（2）在体外将这些DNA片段与适当的载体相连成重组子（3）转化到大肠杆菌或其他受体细胞中（4）从转化子克隆群中筛选取出含有靶基因的克隆为保证能从基因组文库中筛选到某个特定基因，基因组文库必须具有一定的代表性和随机性。也就是说文库中全部克隆所携带的DNA片段必须覆盖整个基因组。在文库构建中通常采用两种策略提高文库代表性：一是用机械切割法或限制性内切核酸酶切割法随机断裂DNA，以保证克隆的随机性。二是增加文库重组克隆的数目，以提高覆盖基因组的倍数。P183最后一段预测一个完整基因组文库应包含的克隆数目，可用Clark和Carbon于1975年提出公式：N=ln(1-p)/ln(1-f)式中：N表示一个基因组文库所应该包含的重组克隆数目；p表示所期望的靶基因在文库中出现的概率；f表示重组克隆平均插入片段的长度与基因组DNA总长的比值。为获得整个基因簇或一个基因及其两翼延伸序列，基因组文库中的DNA片段常大于20kb。以人为例，其基因组大小为3×109bp若p=99%，平均插入片段大小为20kb，则N=6.7×105。P183构建基因组文库最常用的是λ噬菌体载体（克隆能力约15—20kb）和限制性内切酶部分消化法（P184第三段）。例如用识别4个核苷酸的核酸限制性内切酶Sau3A，与BamHI是一对同尾酶消化DNA，由Sau3A酶切产生的DNA片段可插入到经BamHI消化的λ噬菌体载体上。基本流程如P184图5-17图5-13用Sau3A限制性核酸内切酶消化真核生物基因组DNA并利用噬菌体载体构建基因组文库的过程图示。

λ噬菌体作为克隆载体噬菌体文库构建方法简单高效，所获得的文库易于用分子杂交法进行筛选，因此被广泛用于细菌、真菌等基因组较小物种的研究。P184最后一段此外，还有很多大容量克隆载体，如柯斯质粒、细菌人工染色体（BAC）、P1源人工染色体（PAC）、酵母人工染色体（YAC）等都可用于基因组文库的构建。它们的优点是可以插入更大片段DNA，但是稳定性一般较差，在大量复制的过程中容易出现缺失现象。操作也相对较困难。P185第一段建立一个基因文库后，如何鉴定一个携带目的基因的克隆（1）抗生素抗性基因插入失活法（2）β-半乳糖苷酶基因插入失活法（3）放射性标记核酸探针杂交法（通过与放射性标记的探针杂交后，进行放射自显影能够确定携带外源DNA的重组体）（1）抗生素抗性基因插入失活法很多质粒载体都带有一个或多个抗生素抗性基因标记，在这些抗药性基因内有酶的识别位点，当用某种限制酶消化并在该位点插入外源目的DNA后，抗药性基因不再被表达，称为基因插入失活，因此，当此插入外源DNA的重组质粒载体转化宿主菌并在药物选择平板上培养时，对该药物由抗性转为敏感，便可筛选出携带目的DNA的克隆。5.3RNA基本操作技术P185P189第一段细胞中的总RNA包括mRNA，rRNA，tRNA以及一些小RNA（sRNA）。一个典型的动物细胞约含10-5μgRNA，其中：80%-85%为rRNA15%-20%为tRNA及sRNAmRNA约占总RNA的1%-5%总RNA的提取P185这些RNA分子具有确定的大小和核苷酸序列，特别是rRNA电泳后的3条特征性条带28S、18S和5S是鉴定总RNA纯度和完整性的重要参数。由于mRNA呈单链，容易受核酸酶的攻击，对RNA的操作要求比DNA操作更严格，操作时必须设置专门的处理方法，以保证实验环境、所用器皿及溶液均没有RNA酶的污染。总RNA的抽提方法有多种，目前实验室常用的方法是用异硫氰酸胍-苯酚抽提法。见185第四段RNA的浓度和纯度可以通过测定其OD260和OD280来判断。OD260为1时相当于浓度为40μg/ml，而OD260/OD280的比值如果在1.8-2.0之间，表示所提取的RNA纯度较好，如果样品中有蛋白质或酚污染，则OD260/OD280的比值将明显低于1.8。mRNA的纯化P186真核细胞的mRNA分子最显著的结构特征是具有5`端帽子结构和3`端的polyA尾巴，这种polyA结构为真核生物mRNA的的提取提供极为方便的选择性标记志，实验中常用寡聚（dT）-纤维素柱色谱法获得高纯度mRNA.该方法利用mRNA3`端含有PolyA+的特点，当RNA流经寡聚dT纤维素柱时，在高盐缓冲液的作用下，mRNA被特异地结合在柱上，再用低盐溶液或蒸馏水洗脱mRNA。经过两寡聚dT纤维柱后可和到较高纯度的mRNA.P173:图5-14cDNA文库的载体选择要根据该文库的用途来确定基因文库的筛选是指通过某种特殊方法从基因文库中鉴定出含有所需重组DNA分子的特定克隆的过程。筛选的方法有很多种，如核酸杂交法，PCR筛选法和免疫筛选法等。基因文库的筛选P1891、核酸杂交法：核酸杂交法以其广泛的适用性和快速性成为基因文库筛选中最常用的一种方法，用放射性标记的特异DNA探针适用于高密度的菌落杂交筛选。将待筛选菌落转移到硝酸纤维素膜上，适当温育。同时保留原来的菌落平板作对照。取出已经长有菌落的膜，用碱液处理，使菌落发生裂解，DNA随之变性。用蛋白酶K处理硝酸纤维素膜去除蛋白质，形成菌落DNA的印迹。80℃烘烤滤膜，将DNA固定在膜上。将滤膜与放射性标记的DNA或RNA探针杂交，通过放射性自显影显示杂交结果。通过对应于平板上的位置找到相应克隆。图5-17通过核酸杂交筛选目的克隆流程图2、PCR筛选法将整个文库（以质粒的形式或者细菌的形式均可）保存在多孔培养板上，用设计好的目的基因探针对每个孔进行PCR筛选，鉴定出阳性的孔，把每个阳性孔中的克隆再稀释到次级多孔板中进行PCR筛选。重复以上程序，直到鉴定出与目的基因对应的单个克隆为止。3、免疫筛选法该法仅适用于对表达文库的筛选。若实验中靶基因的序列完全未知但是有针对该基因产物的特异性抗体，就可以采用免疫筛选法。图5-18噬菌体表达文库的免疫化学筛选法示意图

P192：---4基因组DNA文库和cDNA文库在构建原理和用途上的主要区别是什么？cDNA文库与基因组文库的差别cDNA是指以mRNA为模板，在逆转录酶的作用下形成的互补DNA。以细胞的全部mRNA逆转录合成的cDNA组成的重组克隆群体称为cDNA文库。基因组文库指的是将某种生物的基因组DNA切割成一定大小的片段的集合，它包含了该生物的所有基因。cDNA文库与基因组文库的差别差别基因组文中包含了所有的基因，而cDNA文库只包含表达的基因，缺乏内含子和调节序列，因此在研究基因结构时没有多大用处。cDNA文库代表了mRNA的来源，其中一些特定的转录本丰富而另一些很少，所以存在丰度的差别；而基因组文库在理论上均等地代表了所有基因序列。从不同细胞类型制备的cDNA文库包含一些共同序列和独特序列，可用于分离差别表达的基因；基因组文库中不能。基因组文库由于含有不表达序列，因此比cDNA文库大。mRNA在不同的组织之间存在丰度的差异，因此cDNA文库的构建对于mRNA含量较少的就比较困难，而基因组文库不存在这样的问题。5.5基因克隆（clone）技术5.5.1cDNA文库差示筛选法，这是一种直接分离组织或发育特异表达基因的方法，例如对于两种不同的组织细胞，先提取它们的poly(A)+mRNA，分别构建这两种组织的cDNA文库，然后以这些mRNA为模板，合成放射性标记的cDNA探针，再用这两种探针分别与一类cDNA文库的两套重复考贝杂交，跟两种探针都杂交的克隆是两种组织细胞中都表达的基因，而仅与一种探针杂交的克隆则是在一种组织细胞中特异表达的mRNA,再对这样的克隆进行测序比较和鉴定，就可分离到这种组织特异表达的基因。5.5.2cDNA差示分析法(RDA,RepresentationDifferenceAnalysis)

5.5.3Gateway大规模克隆技术后基因组时代的需要推动此技术的产生。Gateway基因大规模克隆法利用λ噬菌体进行位点特异性DNA片段重组，不需要传统的酶切连接过程，基因快速克隆和载体间平行转移，为大规模克隆基因组注释的开放读码框提供了有力的技术平台。Gateway大规模克隆策略主要包括TOPO反应和LR反应TOPO反应:将目的基因PCR产物连入Entry载体。载体上的CCCTT被拓扑异构酶所识别，通过与切口处的磷酸基团形成共价键，将该酶偶联在载体上。5’GTGG粘性末端攻击PCR产物的互补性末端并与接头序列CACC退火，使PCR产物以正确方向连入Entry载体。LR反应：将目的片段从Entry载体中重组入表达载体。Entry载体上基因两端具有attL1和attL2位点，目的载体上含有attR1和attR2位点，在重组蛋白的作用下发生定向重组，形成新的位点attB1和attB2，将目的基因转移到表达载体中。5.5.4基因的图位克隆法（Map-basedcloning）是分离未知性状目的基因的一种好方法。从理论上说，所有具有某种表现型的基因都可以通过该方法克隆得到。图5-26染色体步移法克隆基因示意图在RFLP作图中，连锁距离是根据重组率来计算的，1cM（厘摩）相当于1%的重组率。人类基因组中，1cM≈1000kb；拟南芥中，1cM≈290kb；小麦中，1cM≈3500kb。用图位克隆法获得水稻脆杆基因BCl

将BCl定位于水稻3号染色体（Chr3）分子标记C524a和RM16之间；B.覆盖BCl位点的BAC大片段。C.BCl位点的精细定位。BCl位点被定位于分子标记P2和P4之间与P3共分离。D.BCl基因结构。红色为编码区，白色为5’和3’非翻译区，黑色线段为内含子。bcl-1和bcl-2表示两个突变位点。

5.6蛋白质与蛋白质组学技术由于蛋白质分离（双向电泳和高效液相层析技术）和鉴定技术（现代质谱）的进步，以及基因组学和生物信息学的交叉渗透，蛋白质组学研究在已经获得了长足的发展。

5.6.1原理：蛋白质是两性分子，在不同pH缓冲液中表现出不同的带电性，因此，在两性电解质电泳体系中，不同等电点的蛋白质会聚集在介质上不同的区域（等电点）从而被分离。蛋白质的分子量决定了SDS-蛋白复合物在凝胶电泳中的迁移率，因为聚丙烯酰胺凝胶中的SDS带有大量的负电荷，与之相比，蛋白质所带电荷量可忽略不计。因此，蛋白质在SDS凝胶电场中的运动速度和距离完全取决于其分子量。5.6.2蛋白质印迹法（WesternBlotting）20世纪70年代末80年代初在蛋白质凝胶电泳和固相免疫测定基础上发展起来的蛋白质检测技术，为检测样品中是否存在蛋白抗原提供了一种可靠的方法。是分子生物学中最常用的蛋白质技术。原理根据被测蛋白能与特异抗体结合的特性和该蛋白质的相对分子质量。免疫印迹（WesternBlotting）示意图.5.6.3蛋白质的质谱分析技术意义：蛋白质组学的重要检测和鉴定技术。特点：是一种超灵敏的鉴定技术。错误率低于百万分之一。种类：基质辅助的激光解析电离-飞行时间质谱（Matrix-AssistedLaserDesorptionIonizationTime-Of-Flightspectrometry，MALDI-TOF）和电喷雾质谱（Electrosprayionisation，ESI-MS）。现行质谱仪主要有三个连续的组成部分，即离子源，离子分离区和检测器。图5-31MALDI–TOF分子质谱仪原理图对限制性内切酶的作用，下列哪个不正确——A.识别序列长度一般为4~6bpB.只能识别和切割原核生物DNA分子C.识别序列具有回文结构