细胞化学染色

细胞化学染色

(cytochemicalstain)

检验科邹伟丽概述

细胞化学(组织化学，组化)染色以形态学为基础并结合化学或生物化学技术，对细胞内各种化学成分、代谢产物作定位、定性和半定量检查的一门科学。可弥补单纯细胞形态学检查识别的不足。细胞化学染色临床意义:1.明确或辅助判断急性白血病的细胞类型。因为不同细胞系列，其所含的化学物质成分、分布及含量各有不同。因此根据细胞化学染色结果不同，可推断所属的细胞系列。2.某些疾病的诊断和鉴别诊断。因为血细胞在病理情况下，其化学物质成分及含量会发生改变，所以仅从细胞形态学观察白血病的诊断正确率约50～70%，如果结合细胞化学染色则可提到90%以上。一、过氧化物酶染色（POX）

【原理】粒细胞和单核细胞的胞浆中含有髓过氧化物酶（myeloperoxidase,MPO）,能将底物H2O2分解，产生新生态氧，它能够将四甲基联苯胺氧化为联苯胺蓝。联苯胺蓝自我脱氢氧化，则显棕色四甲基苯醌二胺。若加入亚硝基铁氰化钠与联苯胺蓝结合，可形成稳定的蓝黑色颗粒，定位于细胞浆酶所在部位。【标本要求】一般用新鲜的骨髓涂片做POX染色；如果外周血中白血病细胞多而骨髓涂片不够的情况下，可选择新鲜的血涂片来做。为了保证酶的活性，片子一般应在固定后一周内完成染色。【染色方法】一、试剂：甲液：联苯胺（0.3g）；95%乙醇（99ml）；亚硝基氰化钠饱和溶液（1ml）乙液：3%过氧化氢（0.3ml）；蒸馏水（2ml）注：乙液必须现配现用（5mlH2O+1滴H2O2）二、染色：1.滴加甲液在干的涂片上。2.待30秒后滴加乙液。（比例为2:1）3.过3-4分钟后用自来水冲洗3-4分钟。4.复染15分钟。【正常血细胞的染色结果】细胞中如有蓝黑色即为阳性细胞。根据阳性颗粒的有无及多少，将染色结果分为（-）、（+）、（++）、（+++）、（++++）。阳性反应细胞阳性强度阳性特征阴性反应细胞部分原粒细胞+~++颗粒细小，分布稀疏早幼粒细胞++~++++颗粒状或弥散状中性成熟粒细胞++~+++同上嗜酸性粒细胞++~++++粗颗粒状，密集少数单系细胞+~++细小，弥散，较少

部分原粒细胞嗜碱性粒细胞大部分单系细胞淋巴细胞浆细胞红系细胞POX染色临床意义

由于POX在淋系细胞中不显示，而在粒系和单系中显示，使其区分急性淋巴细胞白血病(ALL)和急性髓细胞白血病(AML)的分型中具有重要意义。（阳性率>3%即诊断为AML*M0除外）。阴性的结果见于多种急性白血病（但可能最大的是淋巴细胞白血病）。其次观察成熟中性粒细胞的POX活性有助于其他疾病的诊断，如有些骨髓异常综合征、放射病可使中性成熟粒细胞此酶活性下降。二、过碘酸－雪夫反应(PAS)【原理】

过碘酸是强氧化剂，它作用于细胞内含有乙二醇基的多糖类物质（如糖原、粘多糖、糖蛋白及糖酯等），使之氧化，形成双醛基。醛基与雪夫试剂中的无色品红结合，使无色的品红变成红色或紫红色化合物，定位于含有多糖类的细胞中。【标本要求】一般用骨髓片做PAS染色，如外周血中白血病细胞多的患者也可用血涂片来做。但如果观察的是幼红细胞，只能用骨髓涂片来做，因为一般情况下血涂片中幼红细胞不多。由于PAS染色是对于多糖类物质进行的一种半定量分析，所以也可用陈旧的未染色片子。【染色方法】1.新鲜血片或骨髓片用0.95%乙醇固定10分钟。2.10g/L过碘酸氧化20分钟。3.水洗3-5分钟，冲洗掉多余的过碘酸，晾干。4.经无色品红液室温中染色30-60分钟。5.SO2液中漂洗3次。6.流水冲5分钟，再用蒸馏水洗。7.用甲基绿复染2-10分钟。8.流水冲洗，干后镜检。【正常血细胞的染色结果】细胞中有红色即为阳性细胞。再根据阳性颗粒的有无及多少，可分为（-）、（+）、（++）、（+++）、（++++）。（-）：胞质无颗粒（+）：胞质内有颗粒（++）：有较粗红色颗粒（+++）：有粗大红色颗粒（++++）：颗粒粗大并有红色块状PAS染色临床意义1.红血病、红白血病及贫血类型的鉴别：红血病、红白血病、重型地贫及缺铁贫以及MDS时幼红细胞呈强阳性，但极少数红白血病可呈阴性；溶贫时幼红细胞呈阴性或弱阳性；再障、巨幼贫时幼红细胞呈阴性。2.白血病类型的鉴别：急粒时原粒呈阴性或弱阳性，以弥漫性为主；急淋时原、幼淋多呈块状阳性反应，少数呈阴性反应；急单时原、幼单核细胞呈阳性反应，其颗粒细小，弥散分布。三、酯酶染色不同血细胞中所含酯酶的成分不同。根据酯酶特异性高低分为特异性酯酶（SE）和非特异性酯酶（NSE）。特异性酯酶就是指氯乙酸AS-D萘酚酯酶染色；非特异性酯酶的种类有多种，根据pH值不同分为酸性、中性和碱性酯酶，包括了酸性非特异性酯酶（即酸性α-醋酸萘酚酯酶）、碱性非特异性酯酶（即α-丁酸萘酚酯酶）和中性非特异性酯酶，后者包括α-醋酸萘酚酯酶、醋酸AS-D萘酚酯酶等。目前显示血细胞中酯酶的方法均采用偶氮偶联法。

酸性α-醋酸萘酚酯酶（α­NAE）

【原理】

血细胞内的α-NAE在pH中性条件下，水解基质液中的α-醋酸萘酚并释放出α-萘酚，进而与基质液中的重氮盐偶联形成不溶性有色沉淀，定位于细胞质内酶所在的部位。本试验常用的重氮盐为坚牢蓝B，形成的有色沉淀为棕黑色或灰黑色。单核细胞系统的阳性可被氟化钠抑制，所以做α-NAE染色时，通常同时做氟化钠抑制试验。

【标本要求】一般用新鲜的骨髓涂片来做该染色。如外周血中白血病细胞多而骨髓涂片不够的情况下，可选择新鲜的血涂片来做。做此染色时，通常要同时做氟化钠抑制试验，所以至少需要两张片子。为了保证酶的活性，片子一般在固定后一周内完成染色。【染色方法】1.取新鲜骨髓涂片置浓福尔马林中蒸3分钟。（2滴）2.放入作用液37℃温箱30分钟。作用液配制：取固兰40mg，1%α-萘酚（以50%丙酮做溶剂）0.8ml，0.05mol/L磷酸盐缓冲液（PH7.4）40ml混合，过滤后使用。3.用自来水冲洗，晾干。4.用1%沙黄复染45秒。5.水洗，晾干后镜检。注：该染色同时要做氟化钠抑制试验，主要步骤如下：将上述作用液分成两份，其中一份再加入60mgNaF，然后分别将已固定的片子放入其中作用30分钟，最后复染，镜检，比较两张染色结果，判断NaF抑制情况。【正常血细胞的染色结果】1.单核系

分化差的原单呈阴性，分化好的原单呈阳性（常较强），幼单及单核也呈阳性，阳性反应能被氟化钠抑制。所谓抑制是指氟化钠试验的抑制率大于50%。2.粒系

阴性或阳性，但阳性反应不能被氟化钠抑制。3.淋系

多数阴性，少数弱阳性，不能被氟化钠抑制。4.其他细胞

巨核细胞和血小板呈阳性，阳性反应不能被氟化钠抑制；少数有核红细胞呈弱阳性，阳性反应不能被氟化钠抑制；浆细胞呈阴性。

抑制率的计算公式：抑制率%=（抑制前阳性率-抑制后阳性率）×100抑制前阳性率

α­NAE临床意义1.急性单核细胞白血病单核细胞多数阳性较强，且能被NaF抑制。2.急性早幼粒细胞白血病早幼粒呈强阳性，阳性但不能被NaF抑制。3.急性粒细胞白血病和急性淋巴细胞白血病原粒细胞、淋巴母细胞、幼淋巴细胞呈阴性或阳性，阳性不能被NaF抑制。4.急性粒单核细胞白血病原粒细胞呈阴性至阳性，但不被NaF抑制；原幼单呈阳性，能被NaF抑制，所以总的说，该白血病NaF抑制试验是部分抑制。四、铁染色【原理】正常人骨髓中的贮存铁主要存在于骨髓小粒和幼红细胞中。骨髓中的铁在酸性环境下与亚铁氰化钾作用，形成普鲁士蓝色的亚铁氰化铁沉淀，定位于含铁的部位。

铁染色（ferricstain）化学反应过程如下：

酸性4Fe3++3K4[Fe（CN）6]4[Fe（CN）6]3

+12K+（含铁物质）（亚铁氰化钾）（亚铁氰化铁）【标本要求】要求用新鲜的、含有骨髓小粒的骨髓涂片进行染色。陈旧的骨髓涂片铁污染明显而容易造成假阳性；如果骨髓涂片中无骨髓小粒，细胞外铁就无法观察；如果片中幼红细胞很少或无，细胞内铁就无法观察。【染色方法】一、试剂：2%低铁氰化钾液（10g亚铁氰化钾+500ml蒸馏水）和1%盐酸（5mlHCL+495H2O),用时等量混合。二、染色：1.用新鲜配制的酸性亚铁氰化钾液染Z在37℃温箱中作用30分钟。2.用自来水冲洗，晾干。3.0.1%沙黄复染1分钟。4.用自来水冲洗，晾干，镜检。【染色结果】幼红细胞核呈鲜红色，浆呈淡黄红色，铁粒呈蓝绿色。细胞外铁用低倍镜观察涂片，特别是涂片尾部和髓粒附近，注意翠蓝色颗粒的存在，可分五级标准。（-）：无颗粒。（+）：有少数铁颗粒或偶见铁小珠(颗粒体积大于嗜酸性粒细胞的颗粒者称为铁珠)。（++）：有较多的铁颗粒和小珠。（+++）：有很多的铁颗粒、小珠和少数小块状。（++++）：有极多铁颗粒、小珠，有很多的小块，密集成堆。

细胞内铁用油镜计数100个中、晚幼红细胞，记录胞浆中含有蓝色铁粒的红细胞(铁粒幼红细胞)的百分率。根据细胞内铁颗粒的数目、大小、染色深浅和颗粒分布的情况，将铁粒幼红细胞分为四型。Ⅰ型（+）：幼红细胞内含铁粒1～2个。Ⅱ型（++）：幼红细胞内含铁粒3～5个。Ⅲ型（+++)：幼红细胞内含铁粒6～10个。Ⅳ型(++++)：幼红细胞内含铁粒11个以上。环形铁粒幼红细胞

环形铁粒幼红细胞的标准为含铁粒在6个以上，围绕核周1／2以上者。有时成熟红细胞中也出现铁颗粒称为铁粒红细胞。铁染色的临床意义

1、鉴别缺铁性贫血、铁粒幼细胞性贫血及某些溶血性贫血

缺铁性贫血时骨髓细胞外铁和内铁显著减少或消失，经铁剂治疗后细胞外铁及内铁可迅速增多，此检查是诊断缺铁性贫血及指导铁剂治疗的一种辅助方法；非缺铁性贫血，如溶血性贫血、巨幼红细胞性贫血等病人的细胞外铁可以增高，因此有助于鉴别缺铁性贫