固相萃取技术

固相萃取（一）概述（二）SPE基本原理（三）SPE法的优点（四）SPE装置与操作（五）吸附剂类型（六）固相萃取条件选择（一）概述SPE：SolidPhaseExtraction是一种液相色谱分离，利用固体吸附剂将液体样品中的目标化合物与干扰化合物分离，达到分离和富集目标化合物的目的。采用高效、高选择性的固定相进行萃取的样品预处理技术。

SPE技术自上世纪70年代后期问世以来，发展迅速，广泛应用于环境、制药、临床医学、食品等领域。概述——固相萃取目的借助SPE所要达到的目的是：（1）从试样中除去对以后的分析有干扰物质；（2）富集痕量组分，提高分析灵敏度；（3）变换试样溶剂，使之与分析方法想匹配；（4）原位衍生；（5）试样脱盐。使用SPE方法，要尽可能避免柱因超载而被穿透，从而影响分析结果的准确性。概述——样品类型

SPE可以用于所有类型样品的处理，但是液体样品是最容易处理的。Surveyresponse%（二）SPE基本原理

SPE是一种吸附剂萃取，样品通过填充吸附剂的一次性萃取柱，分析物和杂质被保留在柱上，然后分别用选择性溶剂去除杂质，洗脱出分析物，从而达到分离的目的。

SPE的分离模式主要取决于填充剂的类型和溶剂的性质。SPE基本原理SPE也是一个柱色谱分离过程，分离机理、固定相和溶剂的选择等方面与高效液相色谱（HPLC）有许多相似之处。但是SPE柱的填料粒径（>40µm）要比HPLC填料（3~10µm）大。由于短的柱床和大的粒径，SPE柱效比HPLC色谱柱低得多。因此，用SPE只能分开保留性质有很大差别的化合物。与HPLC的另一个差别是SPE柱是一次性使用。

（三）SPE法的优点(1)简单、快速和简化了样品预处理操作步骤,缩短了预处理时间。(2)处理过的样品易于贮藏、运输,便于实验室间进行质控。(3)可选择不同类型的吸附剂和有机溶剂用以处理各种不同类的有机污染物。(4)不出现乳化现象,提高了分离效率。(5)仅用少量的有机溶剂,降低了成本。(6)易于与其他仪器联用,实现自动化在线分析。（四）SPE装置与操作举例：反相萃取柱C18,C8,Phenyl,CN,NH2活化：甲醇、乙腈等，1倍柱管体积或3倍柱床体积3~5mL/min平衡：水，1倍柱管体积或3倍柱床体积,3~5mL/min上样：水溶液（缓冲剂稀释）生物流体等,1mL/min淋洗：含5~50%极性有机溶剂的缓冲水溶液，1~2倍柱管体积或5~10倍柱床体积，1~2mL/min洗脱：极性或非极性有机溶剂，可选加水、缓冲剂、酸、碱等调节剂；2~4倍柱床体积，上样：流出与吸附剂作用最弱的杂质；极性最强淋洗：流出与吸附剂作用比目标物弱的杂质；极性比目标物强淋脱：流出目标物活化：洗脱与吸附剂作用比目标物强的杂质；极性比目标物弱SPE操作步骤

(1)柱预处理-Condition柱预处理有两个目的:一个目的是除去填料中可能存在的杂质；另一个目的是使填料溶剂化，提高固相萃取的重现性。填料未经预处理或者未被溶剂湿润，能引起溶质过早穿透，影响回收率。对于非极性相和离子交换SPE柱使用的柱预处理溶剂为易溶于水的甲醇、乙腈、四氢呋喃和丙酮。通常还要用水或缓冲液洗去残留在柱上的有机溶剂。对于极性的SPE柱，非极性溶剂适合用于预处理过程。通常很少有人用极性溶剂去处理极性的SPE柱，因为极性溶剂会与键合相发生作用，减少吸附剂的与样品作用的表面积。

柱预处理–WhyCondition？ConditionedsorbentUnconditionedsorbentGoodtransportbetweensampleandsorbent(2)上样或吸附(loadingoradsorption)

样品倒入活化后的固相萃取小柱，然后利用抽真空，加压或抽真空的方法使样品进入吸附剂。在该步骤，分析物被保留在吸附剂上。为了保证获得高的回收率，防止分析物的流失。首先，要用合适强度、pH的溶剂稀释试样，即将样品溶液的溶剂强度调节到合适的范围。当以反相机理进行萃取时，以水或缓冲溶液作为溶剂，其中有机溶剂量不超过10%（V/V）最为适合。再次，要适当减少试样体积或适当增加固相萃取柱中的填料。加到萃取柱上的试样量取决于萃取柱的尺寸（填料量）和类型，在试样溶剂中试样组分的保留性质和试样中分析物及基质组分的浓度等因素有关。最后，加样萃取流速应该适当。还应该指出的是，整个加样萃取过程中，应尽量避免柱子流干进入气泡。(3)淋洗(Washing)-除去干扰杂质淋洗：在样品进入吸附剂，目标化合物被吸附后，可先用较弱的溶剂将弱保留干扰化合物洗掉。洗涤的目的是为了去除吸附在柱子上的少量基体干扰组分。一般的洗涤液是合适的中等强度的溶剂。对反相萃取柱，清洗溶剂是含适当浓度有机溶剂的水或缓冲溶液。通过调节清洗溶剂的强度和体积，尽可能多地除去能被洗脱的杂质。为了决定最佳清洗溶剂的浓度和体积，加试样SPE柱上，用5-10倍SPE柱床体积的溶剂清洗，依次收集和分析流出液，得到清洗溶剂对分析物洗脱廓形。依次增加清洗溶剂的强度，根据不同强度下分析物的洗脱轮廓图，决定清洗溶剂合适的强度和体积。(4)洗脱(Elution)-分析物的洗脱和收集洗脱：用较强的溶剂将目标化合物洗脱下来，加以收集。目的：是将分析物完全洗脱并收集在最小体积的洗脱剂中，同时使比分析物更强的保留的杂质尽可能多地保留在SPE柱上。较强的溶剂能够使分析物洗脱并富集到一个很小的体积，但有较多的强保留杂质同时被洗脱下来；当用较弱的溶剂洗脱，富集的体积较大，但含较少的杂质。为了提高分析物的浓度或为以后的分析调整溶剂性质，如可以把收集到的分析物用氮气吹干，再溶于小体积适当的溶剂中。为了选择合适的洗脱剂强度和体积，可通过条件实验确定，如加试样于SPE柱上后，改变洗脱剂的强度和洗脱液的体积分别洗脱，测定分析物的回收率，在保持有较高回收率的前题下确定最佳洗脱剂的组成和最佳洗脱体积。（五）吸附剂类型

根据官能团的特性，固相吸附剂被分类为6大种类。正相吸附剂（活性碳、石墨碳等）非极性相（SDB、C18等）极性相（硅胶、FL等）离子交换相（SAX、SCX等）混合、积层相（SAX／PSA等）特殊结合相（PA等）要让固相萃取得以成功，必须根据目的物质的特性（有无疏水性构造、有无-OH、-COOH、N等极性官能团、离子性官能团等）以及基体的特性来选择相应合适的固相。另外，对于一般常用的无极性相，不同固相下其选择性也会有所不同，因此必须选择其中最为合适的固相。（五）吸附剂类型1、正相固定相2、反相固定相3、离子交换剂4、混合模式固定相5、商品柱举例吸附剂类型非极性相C18OctadecylC2EthylCHCyclohexylPHPhenyl极性固定相CNCyanopropyl2OHDiolNH2AminopropylSISilica离子交换固定相SCXStrongcationexchangerCBAWeakcationexchangerSAXStronganionexchangerNH2Weakanionexchanger特殊固定相PBA柱键合苯硼酸CERTIFY柱C8和苯磺酸（SCX）ENVIRELUT柱ACCUCAT柱SCX/SAX混合Increasingpolarity键合型填料常用的键合硅胶固定相固定相简称极性应用辛烷基C8非极性反相十八烷基C18(ODS)非极性反相乙基C2弱极性反相环己基CH弱极性反相苯基PH弱极性反相氰丙基CN极性正相二醇基Diol(2OH)极性正相硅胶Si（OH）极性正相氨丙基NH2极性弱阴离子交换三甲基胺丙基SAX极性强阴离子交换乙基羧酸CBA极性弱阳离子交换丙基苯基磺酸SCX极性强阳离子交换1、正相固定相

原理：保留取决于分析物的极性官能团与吸附剂表面的极性官能团之间的相互作用。

条件：用比样品本身更极性的溶剂洗脱吸附的分析物质。流动相：非极性、中等极性；固定相：极性；分析物质：极性、中等极性、非极性极性官能团键合硅胶：LC-CN，LC-NH2，LC-Diol极性吸附物质：硅胶,Florisil，ENVI-Florisil，Alumina硅胶性质特点

在SPE法中最常用的吸附剂是硅胶或键合相的硅胶即在硅胶表面的硅醇基团上键合不同的有机基团，如烷基链或其它官能团，如-OH、-C6H5、-NH2、-CN等。实际上吸附剂角色是由这些新接上的含官能基碳链来完成。

以硅胶为基质的吸附剂主要有以下优点：粒径（e.g.40µm)、孔径（e.g.60A）、表面积（600m2/g)、键合量易控制；机械强度高；化学性质稳定；适应性广；可使用的溶剂种类多。硅胶表面的官能团SiSiOH

OHFreesilanolAdsorbedwaterSiloxanebridge(dehydratedsilanol)GeminalsilanolSiOH2OOOHSiOHBoundandreactivesilanolsSiSiOSiOHH2、反相固定相LC-18、LC-8：标准的单键合硅胶ENVI-18、ENVI-8：聚合键合类填料ENVI-ChromP：苯乙烯：疏水ENVI-Carb：含碳SPE分离方式称为反相BPC。最适用于极性基质中萃取非极性化合物。当样品溶液通过萃取柱时，杂质不被保留，直接通过柱子除去，只有分析物保留在柱上，只要选用一种合适的洗脱溶剂既可将其从柱上洗下。3、硅胶键合离子交换剂填充剂为硅胶基质的离子交换官能团有：季胺、氨基、二氨基、苯磺酸基、羧基等。此外常用的还有聚合物，如苯乙烯-而乙烯苯共聚物XAD-2及PRP-1等。相对于键合相填料，聚合物可适用于全部pH范围，因而应用广泛。对于酸性化合物，如有机酸、无机阴离子、酸性蛋白等，一般采用阴离子交换SPE柱；对于碱性化合物，如有机胺、金属离子、儿茶酚胺和碱性蛋白等，采用阳离子交换SPE柱。

目的物质TnertSep构造对象化合物弱离子强离子酸性物质阴离子交换MA-13级胺-CH2-N(R)○○MA-22级胺-CH2-N(R)○×NH2胺丙基-CH2CH2CH2NH2×○PSA1级､2级胺-CH2CH2CH2NHCH2CH2NH2×○SAX三甲胺丙基-CH2CH2CH2N+(CH3)3Cl-○×碱性物质阳离子交换MC-1磺酸-CH2-SO3H○○MC-2羧酸-CH2-COOH○×CBA乙基羧酸-CH2CH2COOH×○PRS丙基磺酸-CH2CH2CH2SO3-Na+○×SCX苯磺酸-CH2CH2C6H4SO3-H+○×SCXPRSCBASAXPSANH2StronganionStronganion,pKa<1Weakanion,pKa4.8StrongcationWeakcation,pKa10.9,10.1Weakcation,pKa9.8NHCH2CH2NH20.7meq/g0.3meq/gpH-sensitive0.8meq/gpH-sensitivepH-sensitiveSO3-SO3-NH2N+Me3CO2H硅胶键合离子交换剂

WeakorStrongAcids/Bases4、混合模式固定相5、固定相与分析物作用（1）极性固定相与分析物作用（2）非极性固定相与分析物作用（3）离子交换剂与分析物作用（4）基质对分离机制的影响NH3+NH2NH2CompoundSuggestedmechanismNon-polarPolarIonexchangeMatrixtypeSalinesolutionOliveoilDrinkingwater6、商品柱举例

BondElutPBA固相萃取柱生产商：VarianInc.

硅胶基质：40μm或120μm不规则形状，酸洗处理，平均孔径60埃;键合相：苯硼酸;端基未封闭；典型载碳量：7.9％；主要保留机理：通过二醇基与分析物之间的共价作用力；应用样品类型：水样，生物体液样品PBA是一种独特的吸附剂，它由苯硼酸在硅胶表面形成共价键，由于共价键的作用力与其它作用机理的作用力相比要高10－100倍，化合物可以更紧密的结合在吸附剂表面，从而得到彻底地净化。硼基对于包含二醇基团的化合物例如儿茶酚、核酸、小分子量蛋白和糖类等具有很强的特异性。当分析物的官能团共面时，通常会被很强地保留。BondElutCertifySPE柱生产商：VarianInc.硅胶基体：40μm或者120um不规则形，酸洗处理，60埃平均孔径键合相：混合模式，辛基（C8）和苯磺酸（SCX）

端基封闭：否典型载碳量：9.0%主要保留机理：双重模式，非极性和强阳离子交换应用样品类型：尿，生物体液样品EnvirElut产品名称：EnvirElut杀虫剂,除草剂和多环芳烃分析SPE柱型号规格：1g/3ml，50只/包生产商：VarianInc.产品简介：高纯度和大容量的EnvirElut吸附剂，使其特别适用于从大体积水样基质中提取多种性质的有机化合物。EnvirElut在售出之前，都将严格地测试其从水质样品中对所提取的环境污染物的保留能力。EnvirElut吸附相被直接填充到BondElut直筒柱中，专门用于环境分析，EnvirElut除草剂、多环芳烃、杀虫剂,和苯酚SPE柱，可以用在常规的VacElut固相萃取真空装置中（六）固相萃取条件选择1、SPE柱子类型的选择2、溶剂的选择3、柱子尺寸与容量选择3、样品pH对吸附性影响4、样品体积对吸附性能影响1、SPE柱子类型的选择固相萃取吸附剂的选择原则不同SPE吸附剂与分析物之间的相互作用力反相SPE萃取剂包括键合硅胶萃取剂（C18，C8，C2，苯基，环己基）和PS-DVB的聚合大孔树脂萃取剂通过范德华力与分析物作用，非离子型的水溶性化合物可以保留在反相SPE萃取剂上，但甲醇溶液中此类化合物不能被吸附。正相萃取剂像氰基，硅胶，氧化铝，Florisil是通过偶极力-偶极力作用力吸附分析物，二醇基、氨基则是通过氢键作用力使分析物保留于吸附剂上。溶于正己烷的极性分析物能很好的被正相SPE萃取剂保留。离子交换SPE萃取剂是通过静电作用保留分析物的。石墨炭黑SPE萃取剂则存在多种作用力包括范德华力、静电作用力等。不同SPE吸附剂与分析物之间的相互作用力2、柱子尺寸与容量选择固相的填充剂量与保持容量（capacity）必须选择与基体及目的物质负载量相适合的填充剂量及尺寸。一般来说，小柱类型的总保留量（包括夹杂物在内）应该控制在固相填充量的最大5%以下。应选择合适的尺寸，以确保不至于超过规定量。分离机制典型的弱溶剂（保留条件）典型的强溶剂（洗脱条件）反相SPE缓冲液或低浓度的甲醇或乙腈乙腈、甲醇或溶剂与水的混合物正相SPE正己烷、甲苯等二氯甲烷、甲醇等阳离子交换SPE低离子强度缓冲液(<0.1mol/L)高离子强度缓冲液（＞0.1mol/L)低反离子强度高反离子强度阴性离子交换SPE低离子强度缓冲液（<0.1mol/L)高离子强度缓冲液(>0.1mol/L)3.溶剂的选择Monomethyl(MMP),Monoethyl(MEP),Mono-n-propyl(MPRP),Mono-n-butyl(MBP),Mono-n-pentyl(MPEP),Mono-n-octyl(MOP)Phthalates（邻苯二甲酸盐酯）4、样品pH对吸附性影响Ifacompoundisionizable,theextractionwillbepHdependent.5、离子强度对吸附特性的影响Effectofthesolutionionicstrengthontheadsorption.(initialLOMconcentration=2mmolL-1;pH=6;temperature=25oC).Breakthroughvolumeasthepointatwhich1%ofthesampleconcentrationattheentranceofthesorbentbedisdetectedattheoutletofthesorbentbed.Thetypeandquantityofsorbent,hydrophobicityandionizabilityoftheanalytes,andsamplevolumeandpHinteractivelydeterminethebreakthroughvolume.Thebreakthroughvolumeforaspecificmassofsorbentcanbeestablishedbyeitherloadingvariable-volumesamplesofconstantconcentrationorvariable-volumesamplesofvariableconcentration,inwhichcasethelattercomprisesaconstantmolaramountloaded。Alternatively,methodsexistforpredictingthebreakthroughvolume.6、样品体积对吸附性能影响提高SPE重现性的方法从SPE的操作步骤可以看出，SPE的重现性受多个因素的影响，除了优化实验条件外，提高重现性的方法还可以（1）使用替代物，加入适当的替代物做参比；（2）加入样品量适当，不超出穿透量和穿透体积；（3）选择合适的洗涤液和洗脱液，确保分析物在操作中不流失。（七）高选择性固相萃取技术钥匙分子与锁体物质混合除去分子钥匙，形成含有钥匙分子结合位点和孔穴的印迹聚合物，可以重新识别印迹分子建立含钥匙的聚合物，相互作用分子印迹技术（MolecularImprintingTechnique,MIT）就是仿照抗体的形成机理，在模板分子周围形成一个高度交联的刚性高分子，除去模板分子后在聚合物的网络结构中留下具有结合能力的反应基团，对模板客体分子表现高度的选择性识别性能。1、分子印迹固相萃取技术什么是分子印迹？预定性(predetermination)

决定了人们可以根据不同的目的制备不同的MIPs，以满足各种不同的需要；识别性(recognition)

因为MIPs是根据模板分子量身定做的，它具有特殊的分子结构和官能团，能选择性地识别模板分子；实用性(practicability)

与天然的生物分子识别系统相比，具有抗恶劣环境、稳定性高、使用寿命长和制备过程简单等特点。分子印迹技术的特点分子印迹技术起源与发展40年代，Pauling试图用锁匙理论解释免疫体系。引出分子印迹技术。1949年，Dickey首先提出了“分子印迹”这一概念。1972年，Wulff小组报道了人工合成的有机分子印迹聚合物。1977年，德国的Wulff小组创立预组装方式。1984年，瑞典的Mosbach将模板与功能单体之间的非共价键引入MIPs，创立自组织方式（非共价印迹方法）。1995年，英国的Whitcombe等建立牺牲空间印迹方法。1997年，在瑞典的Lund大学成立了国际性的分子印迹学会(SocietyforMolecularImprinting,SMI)。分子印迹技术的基本理论和原理分子印迹聚合物（MIPs）的制备过程分子印迹方法与作用机理非共价键型和共价键型分子印迹聚合物的制备(1)具有适当的刚性,聚合物在脱去模板分子后仍能保持空穴原来的形状和大小。(2)具有一定的柔性,使底物与空穴的结合能快速达到平衡。柔性对于分子印迹聚合物模拟酶来说尤其具有重要意义。(3)具有一定的机械稳定性,这一点对于高效液相色谱(HPLC)尤为重要。(4)具有热稳定性,使其能在较高温度环境下使用,因为对于一般的反应来说,温度较高使动力学上更有利。理想的分子印迹吸附剂应具备的性质分子印迹吸附剂的制备方法制备分子印迹聚合物原材料：

模板分子：功能单体：交联剂（1:4:20）

溶剂或分散剂、引发剂交联剂聚合反应溶剂非共价型MIPs中,反应溶剂起着致孔剂的作用，对印迹分子等应具有较高的溶解性,能促进印迹分子与功能分子间的相互作用,至少不干扰这种效应。在极性溶剂中,印迹分子主要靠疏水作用与功能单体结合。在非极性溶剂中则主要靠氢键等作用与功能单体结合。尽可能采用介电常数低的溶剂,如甲苯、氯仿、二氯甲烷等。为避免溶胀发生,吸附中所用的溶剂最好与聚合反应溶剂一致引发剂偶氮二异丁腈(AIBN)或偶氮二(2,42二甲基)戊腈(ABDV)、2,2`-偶氮双(N,N`-二甲基-异丁基脒)在加热或UV照射下引发。分子印迹聚合物的制备方法：本体聚合

(BulkPolymerization)原位聚合(InSituPolymerization)悬浮聚合法

(suspensionpolymerization)多步溶胀聚合法

(multi-stepswelling