药物分析第十四章维生素类药物的分析

第十四章

维生素类药物的分析

概述

维生素维持正常生理功能所必需的、微量营养物质，人体不能合成维生素。必须从外界食物中摄取。维生素的发现是20世纪的伟大发现之一。1897年,C.艾克曼在爪哇发现只吃精磨的白米即可患脚气病，未经碾磨的糙米能治疗这种病。并发现可治脚气病的物质能用水或酒精提取,当时称这种物质为“水溶性B”。

ChristiaanEijkman1929诺贝尔生物医学奖TheDiscoveryofVitamin发现简史必需维生素13种维生素A，维生素B，维生素C，维生素D，维生素E，维生素K，维生素H（生物素），维生素P，维生素PP，维生素M，维生素T，维生素U，水溶性维生素。分类AB1CDEVitaminsContents维生素A的简介是鱼类肝脏中提取的一种不饱和脂肪醇，又称鱼肝油。目前主要采用人工合成。在体内以视黄醇的形式储存，缺乏会影响视色素的合成，导致夜盲症，视力减退。第一节维生素A的分析全反式第一节维生素A的分析结构共轭多烯醇侧链的环己烯黄色棱形，62-64℃淡黄色棱形，57-58℃无定型，28-29℃去氢维生素VitA2去水维生素VitA3易发生脱氢、脱水、聚合反应第一节维生素A的分析

溶解性:与三氯甲烷、乙醚、环已烷或石油醚能任意混合，在乙醇中微溶，在水中不溶。不稳定性：含有多个不饱和键，性质不稳定，易被空气中氧或氧化剂氧化，易被紫外光裂解，特别是在加热和金属离子存在时更易氧化变质从而失活。第一节维生素A的分析性质紫外吸收：共轭多烯醇侧链结构，在325-328nm之间有最大吸收，可用于鉴别。第一节维生素A的分析

λmax

相对生物效价顺反异构维生素A325.5100%全反式新维生素Aa32875%2－顺新维生素Ab320.524%4－顺新维生素Ac310.515%2，4－顺异维生素Aa32321%6－顺异维生素Ab32424%2，6－顺第一节维生素A的分析天然维生素A主要是反式CHCl3可用于鉴别和含量测定

与三氯化锑呈色:三氯甲烷+三氯化锑=不稳定的蓝色与三氯化锑呈色反应第一节维生素A的分析鉴别实验VitASbCl3CHCl3(无水无醇)蓝色紫红色（一）Carr-Price反应蓝色紫红第一节维生素A的分析条件：无水、无醇SbCl3水SbOCl乙醇可使碳正离子的正电荷消失第一节维生素A的分析要求仪器和试剂必须干燥无水，三氯甲烷必须无醇第一节维生素A的分析λmax为326nm一个吸收峰λmax为350～390nm三个吸收峰五个共轭双键六个共轭双键最大吸收峰红移（二）UV法第一节维生素A的分析第一节维生素A的分析维生素A在无水乙醇溶液中溶解,立即进行UV扫描,在360nm处有一最大吸收峰.当盐酸水浴加热30s,迅速冷却,此过程发生脱水反应,扫描时出现三个吸收峰USP显色剂磷钼酸规定斑点颜色和Rf值BP

对照品法显色剂三氯化锑（三）TLC法第一节维生素A的分析展开剂：环己烷-乙醚（80：20）均显蓝色斑点，维生素醇（Rf=0.1）维生素醋酸酯（Rf=0.45）

维生素棕榈酸酯（Rf=0.7）

酸值

取乙醇与乙醚各15ml，置锥形瓶中，加酚酞指示剂5滴，滴加氢氧化钠滴定液（0.1mol/L）至显粉红色，再加本品2.0g，振摇使溶解，用氢氧化钠滴定液（0.1mol/L）滴定，酸值应不大于2.0（附录VIIH）杂质检查过氧化值取本品1.0g，加冰醋酸-三氯甲烷（6:4）30ml，振摇使溶解，加碘化钾的饱和溶液1ml，振摇1分钟，加水100ml与淀粉指示液1ml，用硫代硫酸钠滴定液（0.01mol/L）滴定至紫蓝色消失，并将滴定的结果用空白试验校正。消耗硫代硫酸钠滴定液（0.01mol/L）不得过1.5ml。杂质检查第一节维生素A的分析含量测定（一）UV法（三点校正法）第一节维生素A的分析维生素A在325~328nm的波长范围内有最大吸收，可用紫外法进行含量测定但维生素A原料常混有杂质如：第一节维生素A的分析

维生素A的氧化产物第一节维生素A的分析

维生素A在光照下产生的无活性的聚合物第一节维生素A的分析第一节维生素A的分析第一节维生素A的分析测定对象：VitA醋酸酯时，ChP2015规定第一法等波长差法第一节维生素A的分析第二法等吸收比法测定对象：VitA醇时，ChP2015规定第一节维生素A的分析合成的或天然的维生素A均为酯式维生素A，根据供试品中干扰杂质的多少，可采用：（1）直接测定法

（2）皂化法

第一节维生素A的分析求求效价（1）基本步骤4.测定方法A选择，A328测定或A328校正求标示百分含量（1）第一法（直接测定法，适用于纯度高的维生素A醋酸酯的测定）1）方法取样品适量，精密称定，加环己烷溶解在300、316、328、340、360nm测吸收度，以确定最大吸收波长（A328或A328校正）。第一节维生素A的分析b.判断法最大吸收波长在326-329nm之间，且5个波长下的绝对值差值均不超过0.02时，可直接用328nm波长处的测得的吸收度值求得吸收系数。

a.计算吸收度比值（Ai/A328）：与中国药典的吸收度比值相比较，判断每个差值的绝对值是否超过0.02。第一节维生素A的分析最大吸收波长在326-329nm之间，计算5个波长下的绝对差值，如果有一个或几个超过0.02，应按以下的方法进行判断：

A328校正=3.52（2A328–A316-A340）第一节维生素A的分析（1）第一法（直接测定法，适用于纯度高的维生素A醋酸酯的测定）1）方法取样品适量，精密称定，加环己烷溶解在300、316、328、340、360nm测吸收度，

确定A2）计算

a.吸光系数E1%1cm第一节维生素A的分析

b.求效价（IU/g）：效价指每g供试品所含维生素的A的国际单位数。

第一节维生素A的分析1IU=0.344μg全反式维生素A醋酸酯IU/g=

第一节维生素A的分析每克纯品相当多少个单位（IU）?1IU=0.344μg全反式维生素A醋酸酯第一节维生素A的分析第一节维生素A的分析c.求维生素A占标示量的百分含量A—A328或A328校正D——供试品的稀释倍数换算因子——维生素A醋酸酯在环己烷中1900；

维生素A醇在异丙醇中1830W为平均内容物重量；W为称取内容物重量（供试品取用量）L—比色池厚度标示量为处方中规定的每粒中所含的国际单位数第一节维生素A的分析

VitAD胶丸中VitA的含量测定

精密称取本品(规格10000VitAIU/丸)装量差异项下（平均装量0.08262g/丸）的内容物0.2399g至250ml量瓶中，用环己烷稀释至刻度，摇匀；精密量取2.0ml，置另一20ml量瓶中，用环己烷稀释至刻度，摇匀。以环己烷为空白，测定最大吸收波长为328nm，并在下列波长处测得吸收度为第一节维生素A的分析A300：0.354A316

：0.561A328：0.628A340：0.523A360：0.216A300/A328：0.555A316/A328：0.907A328/A328：1.000A340/A328：0.811A360/A328：0.299求本品中维生素A的含量？第一节维生素A的分析A300/A328：0.564A316/A328：0.893A328/A328：1.000A340/A328：0.833A360/A328：0.344

0.5550.9071.0000.8110.299

+0.01－0.010+0.02+0.04

－－－－－=====第一节维生素A的分析第一节维生素A的分析适用于维生素A醇（等吸收比法）第一法无法消除杂质干扰时用此法[皂化法、6/7A法]（2）第二法第一节维生素A的分析水溶性脂溶性第一节维生素A的分析

判断max是否在323～327nm之间取未皂化样品采用色谱法纯化后再测定

计算是否第一节维生素A的分析

判断A300/A325是否大于0.73是否取未皂化样品采用色谱法纯化后再测定

计算A325(校正)03%－3%f第一节维生素A的分析高效液相色谱法流动相：正己烷－异丙醇（997︰3）检测波长：325nm系统适用性实验考察分离度——是否能将维生素A醋酸酯顺式和反式分开第一节维生素A的分析三氯化锑比色法λmax618nm～620nm标准曲线法第一节维生素A的分析缺点：呈色不稳定（5~10s内）水分干扰与标准曲线温差≤1℃专属性差三氯化锑有腐蚀性优点：简便快速第一节维生素A的分析小结维生素A—共轭多烯醇侧链的环乙烯性质：脂溶性；不稳定，可与三氯化锑呈色鉴别：三氯化锑反应；UV；TLC含量测定：

紫外-分光光度法（三点校正）

三氯化锑比色法AB1CDEVitaminsContents

维生素B1广泛分布于米糠、麦麸和酵母中，具有维持糖代谢及神经传导与消化的正常功能。主要用于治疗维生素B1缺乏症、多发性神经炎及胃肠疾病。第一节维生素B1的分析氨基嘧啶环噻唑环亚甲基氯化4-甲基-3[(2-甲基-4-氨基-5-嘧啶基)甲基]-5-（2-羟基乙基）噻唑鎓盐酸盐结构与性质维生素B1（盐酸硫胺）第二节维生素B1的分析结构与性质维生素B1为白色结晶或结晶性粉末易溶于水，微溶于乙醇，不溶于乙醚水溶液呈酸性1.溶解性性质噻唑环、嘧啶环共轭双键12.5μg/ml盐酸溶液（9→1000）λmax=246nm2.硫色素荧光反应3.UV杂原子的反应，能与某些生物碱沉淀试剂反应，生成组成恒定的沉淀，可用于鉴别和含量测定。4.与生物碱沉淀试剂反应5.氯化物的特性与NaOH共热，形成硫化钠，＋硝酸铅生成黑色沉淀；6.硫元素反应7.红外光谱特征二、鉴别试验（一）硫色素荧光反应——为维生素B1所特有NaOH－H2O环合[O]－2H硫色素Thiochtome溶于丁醇，显蓝色荧光维生素B1VitB1H+H+H+沉淀反应H+S元素反应Cl-反应硫元素反应和氯化物反应H+CompanyLogo三、含量测定高氯酸滴定液（0.1mol/L）的滴定度(T)为16.86mg/ml。喹那啶红－亚甲蓝(紫红→天蓝)非水溶液滴定法紫外分光光度法维生素B1分子中具有共轭双键，在紫外区有吸收1——0.1MHCl2——H203——H3PO4buffer4——alcohol246232255注意维生素B1片的测定片剂、注射剂=421（每片）相当于标示量的%=A=ECLChP11×

标示量%×

WEA

×%cm×

100D××

100平均片重（每ml）相当于标示量的×

标示量%×VEA×%cm×

100D×

100NaOH硫色素荧光法：维生素B1的专属性反应原理1、2.

方法VitB1铁氰化钾NaOH硫色素异丁醇荧光λex-365nmλem-435nm+NaOH+铁氰化钾+异丁醇+NaOH+异丁醇对照液+NaOH+铁氰化钾+异丁醇+NaOH+异丁醇供试液SdAb特点3、小结维生素B1（盐酸硫胺）——氨基嘧啶环和噻唑环通过亚甲基连接而成季铵盐。性质：水溶性；硫色素反应；可与生物碱沉淀剂反应鉴别：硫色素反应；沉淀反应；Cl、S反应含量测定：非水滴定；紫外分光光度法；

硫色素荧光法AB1CDEVitaminsContents第三节维生素C的分析维生素C是胶原蛋白形成所必需的，有助于保持间质的完整，维生素C缺乏可导致齿龈肿胀，出血，皮下瘀点，关节及肌肉疼痛，毛囊角化，严重缺乏可引起坏血病。所以维生素C又称为抗坏血酸。L-抗坏血酸(有生物活性)L-二酮古罗糖酸L-去氢抗坏血酸无生物活性第三节维生素C的分析结构与性质C3－OH的pKa=4.17C2－OH的pKa=11.572.酸性一元酸性质1.溶解性易溶于水，水中呈酸性；略溶于乙醇，不溶于三氯甲烷或乙醚L(+)－抗坏血酸活性最强比旋度+20.5°~+21.5°手性C（C4、C5）3.旋光性**含有四个光学异构体有活性有活性无活性4.还原性二烯醇结构与碱反应5.水解反应弱碱中生成单钠盐，强碱中水解△糖类的显色反应50℃结构与糖类相似6.具糖的性质五碳糖维生素C7.UV特征维生素C具有共轭双键利用还原性：与氧化剂的反应鉴别试验（一）与AgNO3反应去氢抗坏血酸黑色（二）与2，6-二氯靛酚反应氧化型玫瑰红色（酸性）还原型蓝色(碱性)无色与碱性酒石酸铜反应与KMnO4反应（三）与其他氧化剂反应砖红色沉淀试剂褪色磷钼酸钼蓝与磷钼酸反应（四）薄层色谱法（五）糖类反应H2O-CO2戊糖-3H2O糠醛50℃蓝色维生素C可在三氯醋酸或盐酸存在下水解、脱羧、生成戊糖，再失水，转化为糠醛，加入吡咯，加热至50℃产生蓝色0.01mol/LHCl（五）紫外光谱法BP2010杂质检查（一）溶液的澄清度与颜色检查内酯环水解糠醛缩合呈色高于或低于pH.0-6.0空气、光线、温度维生素C脱羧控制有色杂质维生素C（二）铁、铜离子（三）草酸的检查草酸与金属离子作用形成沉淀；所以对Vc的原料，尤其是注射液，要进行草酸检查；加入CaCl2，比浊法；原子吸收分光光度法（二）铁、铜离子原子吸收分光光度法四、含量测定维生素C维生素C制剂碘量法二氯靛酚法紫外分光光度法高效液相色谱法指示剂淀粉指示液（一）碘量法原理：利用Vc强的还原性HAc

取本品约0.2g，精密称定，加新沸过的冷水100ml与稀醋酸10ml使溶解，加淀粉指示液1ml，立即用碘滴定液（0.05mol/L）滴定，至溶液显蓝色，在30秒内不褪。每1ml碘滴定液(0.05mol/L)相当于8.806mg的C6H8O6。2、方法原料药（2）酸性环境稀醋酸

（1）新沸冷H2O减慢VitC被O2氧化速度（3）立即滴定

赶走水中O2，减少O2的干扰3、注意事项（4）附加剂干扰的排除片剂——过滤注射剂

——抗氧剂

——丙酮甲醛Na2SO3NaHSO3

Na2S2O3Na2S2O5（二）2，6-二氯靛酚滴定法快速滴定，专属性强，用于含VitC的制剂与食品分析自身指示终点1.原理2.方法（2）快速滴定2min内

（1）酸性环境HPO3-HAc

稳定VitC防止其他还原性物质干扰（3）亦可剩余比色测定

（定量过量）（测剩余染料）3.注意事项（4）二氯靛酚不稳定，须临用前配制并标定专属性强，多用于含Vc的制剂和食品的分析配制方法：NaHCO342mg+水→50ml，加二氯靛酚钠二水合物0.5g+水→200ml,过滤，即得。标定方法：用干燥的维生素C对照品进行标定（三）高效液相色谱法人血浆中VitC浓度的HPLC法测定小结维生素C（L—抗坏血酸）——烯二醇结构性质：水溶性；酸性；旋光性；还原性；水解性

糖类性质；紫外吸收特性鉴别：硝酸银反应；二氯靛酚钠反应；

氧化反应；TLC；糖类反应；紫外杂质检查：澄清度与颜色检查

铁、铜离子检查

草酸检查含量测定：碘量法；二氯靛酚滴定法；

高效液相色谱

AB1CDEVitaminsContentsSourcesSunlightFoodsFortifiedMilkFishOilsDeficiency佝偻病牙齿松动鸡胸骨质疏松脚成弓形Function促进钙、磷的吸收；促进骨骼和牙齿的正常生长；调节柠檬酸的代谢第四节维生素D的分析胆甾醇7-脱氢胆甾醇维生素D3(胆骨化醇)维生素D2(麦角骨化醇)麦角甾醇维生素D是一类抗佝偻病维生素的总称，目前有10多种，都是甾醇衍生物。

维生素D2

维生素D3第四节维生素D的分析维生素D2、D3无色针状结晶或白色结晶性粉末；无臭，无味；遇光或空气均易变质。

溶解性:维生素D2在三氯甲烷中极易溶解,在丙酮乙醇乙醚中易溶；维生素D3在乙醇、丙酮、三氯甲烷或乙醚极易溶解；二者均在植物油中略溶，在水中不溶。不稳定性:毒性增强.含有多个烯键，所以极不稳定，宜氧化变质，效价降低，毒性增强。第四节维生素D的分析旋光性:有五到六个手性碳原子,均具有旋光性.维生素D26个手性碳原子

维生素D35个手性碳原子

第四节维生素D的分析显色反应甾类化合物氯仿溶液黄色红色紫色绿色紫外吸收特性无水乙醇265nm

维生素D2

为460－490

维生素D3

为465－495醋酐硫酸E1cm1%E1%1cm二、鉴别试验

（一）显色反应1．与醋酐-浓硫酸反应

氯仿溶液黄色

红色

紫色

绿色醋酐硫酸2．与三氯化锑反应本品1,2-二氯乙烷

三氯化锑试液

橙红色

粉红色

3．其它显色反应

维生素D

三氯化铁

橙黄色

二氯丙醇乙酰氯绿色

（二）比旋度鉴别无水乙醇溶液

维生素D2

比旋度为＋102.5°至＋107.5°维生素D3

比旋度为＋105°至＋112°（三）其它鉴别方法薄层色谱法、HPLC法制备衍生物测熔点紫外、红外吸收光谱

（四）维生素D2、D3的区别反应维生素D2

维生素D3

96%乙醇

10ml取0.1ml

乙醇1ml和85%硫酸5ml

红色λmax570nm

黄色

λmax495nm

三、杂质检查（一）麦角甾醇的检查维生素D290%乙醇溶液

洋地黄皂苷溶液不得发生浑浊或沉淀（二）前维生素D的光照产物（三）有关物质检查Ch.P2010——NP-HPLC含量测定USP34-NF29化学法色谱法微生物法BP2010化学法色谱法光谱法四、含量测定正相高效液相色谱法（一）维生素D测定法

含量以单位表示每单位相当于维生素D0.025μg注意：计算的是维生素D及前维生素D经折算成维生素D的总量

固定相：硅胶

流动相：正己烷－正戊醇（997：3）

检测波长：254nm第一法：用于无维生素A醇及其他干扰的供试品第二法：(1)皂化提取;(2)净化用色谱柱系统分离收集维生素D，得供试品溶液B;(3)按第一法进行测定。第三法：当样品经皂化提取及净化用色谱系统分离收集后，前维生素D峰仍受干扰时，采用此法。小结维生素D—抗佝偻病维生素的总称性质：脂溶性；不稳定；旋光性；

显色反应；紫外鉴别：显色反应；比旋度；VD2、VD3区别杂质检查：麦角甾醇；

前维生素D光照产物；有关物质含量测定：三法AB1CDEVitaminsContents主要讲解第五节维生素E的分析维生素E早在20世纪20年代就被人们发现，Evans和他的同事在研究生殖过程中发现，酸败的猪油可以引起大鼠的不孕症。是与生育有关的维生素的总称1936年分离出结晶体1938年被瑞士化学家人工合成维生素E的显微照片维生素E胶囊维生素E类结构与相对活性名称R1R2烃链相对活性α-生育酚CH3CH3C16H331.0β-生育酚CH3HC16H330.5γ-生育酚HCH3C16H330.2δ-生育酚HHC16H330.1ε-生育酚CH3HC16H270.5维生素E的结构[2R*(4R*,8R*)]-3,4-二氢-2,5,7,8-四甲基-2-(4,8,12-三甲基十三烷基)-2H-苯并吡喃-6-醇醋酸酯α-生育酚醋酸酯生物效价右旋体：消旋体=1.4：10（天然品）（合成品）维生素E的性质性状:黄色或金黄色粘稠状透明液体脂溶性:溶于丙酮、乙醇、乙醚或植物油等有机溶剂中水溶性:不溶于水稳定性:无氧时对热、酸稳定，对碱不稳定，

对氧敏感，遇光可被氧化，色渐变深，UV：乙醇溶液中λmax284nm（一）硝酸反应二、鉴别试验生育酚HNO3（橙红色）生育红维生素E在硝酸酸性条件下，水解生成生育酚水解三氯化铁－联吡啶反应△[O]（二）生育酚对-生育醌红色Fe3+[O]λmax=284nmλmin=254nm0.01%无水乙醇中UV法（三）薄层板硅胶G展开剂环己烷-乙醚（4：1）显色剂硫酸（105℃5′）

TLC法（四）VitERf

=0.7-生育酚Rf

=0.5-生育醌Rf

=0.9维生素E合成过程2,3,5-三甲基对二苯酚植醇+α-生育酚α-生育酚醋酸酯

三、杂质检查

三、杂质检查

（一）酸度游离醋酸（二）生育酚

硫酸铈滴定液（0.01mol/L）二苯胺（亮黄→灰紫）

利用游离生育酚的还原性，将硫酸铈还原成硫酸亚铈

三、杂质检查

1.原理2.试剂问药典中规定的维生素E中所含的游离生育酚的限量是多少？计算每ml硫酸铈滴定液（0.01mol/L）相当于0.002154g的游离生育酚≤2.15％限量

(三)有关物质的检查

(四)残留溶剂：环己烷的检查四、含量测定GC法（一）GC特点1、选择性好灵敏度高速度快分离效能好挥发性低、不稳定、极性强→衍生化。易受样品蒸气压限制载气→N2固定液→硅酮（OV-17）担体→硅藻土或高分子多孔小球柱温→265℃检测器→氢火焰离子化检测器(FID)内标→正三十二烷

n≥500R≥2内标法加校正因子定量2、VitE测定的色谱条件内标法供试液（样品+内标）内标物对照液（对照+内标）是样品中不存在的物质与被测组分峰靠近能与各组分完全分离与被测组分的量接近样品→dl－α－生育酚固定相→十八烷基硅烷键合硅胶流动相→甲醇-水（49：1）检测波长→292nmR＞2.6RSD≤0.8%（二）HPLC法（外标法）（三）荧光分光光度法对照品→dl－α－生育酚在220~400nm波长范围内，以发射、激发波长间隔Δλ为40nm扫描同步荧光光谱，测定同步荧光峰的荧光强度信号值。VE=F样品-F空白F标准-F空白4.0（mg/L)第六节复方制剂中多种维生素的分析一、离子对HPLC法测定多种维生素以樟脑磺酸作为离子对试剂，以二