猪卵透明带3α重组乳杆菌疫苗的研发制造,免疫学论文

猪卵透明带3α重组乳杆菌疫苗的研发制造,免疫学论文免疫避孕是一种生育期妇女节育的重要措施。常见的免疫避孕抗原有卵细胞外表抗原、精子外表抗原、人绒毛膜促性腺激素和生殖激素等，这些抗原可能干扰生育期妇女的生殖系统或免疫系统，诱发生殖功能紊乱、免疫失调、本身免疫性疾病等疾病，因而尚需研究新型疫苗。乳杆菌〔Lactobacillus〕是一种革兰阳性的无芽胞需氧菌，一般呈细长的杆状，大小为〔0.5~1〕m〔2~10〕m.常成双或短链状排列。常见菌株有干酪乳杆菌〔L.casei〕、嗜酸乳杆菌〔L.acidophilus〕、植物乳杆菌〔L.plantarum〕和约氏乳杆菌〔L.johnsonii〕等，常用于食品和饲料加工业，在功能食品、医疗保健和微生态制剂等方面具有广阔的应用前景，是一种极具开发价值的疫苗载体[1~3],本研究拟就乳杆菌介导的猪卵透明带3抗原和人绒毛膜促性腺激素疫苗的构建及其作用机制等方面的研制现在状况进行综述。1大肠埃希菌-乳杆菌穿梭载体的构建乳杆菌的细胞壁厚而且复杂，摄取外源DNA较为困难，Kim等[4]用电穿孔方式方法进行外源DNA转化乳杆菌的试验，并探索出了较好的转化条件，这为构建重组乳杆菌疫苗提供了有利条件。为了将外源DNA有效引入乳杆菌，需构建大肠埃希菌-乳杆菌穿梭表示出载体，乳杆菌的穿梭表示出载体通常有组成型和诱导型两种类型。Guchte等[5]构建的pMG36e是一种常见的组成型表示出载体。它含有p32启动子及其下游部分的开放阅读框、来自pUC18的多克隆位点和来自PrtP基因的转录终止子、pWV01的复制子和氯霉素抗性基因等。尽管该载体可表示出高水平的外源蛋白，但外源蛋白在细胞内的富集和聚合却可导致蛋白在胞质中被降解，通常对细胞具有毒害作用。诱导型表示出载体可利用诱导剂对外源蛋白进行可控性表示出，因此应用较为广泛。Ruyter等[6]开发了乳菌肽控制的表示出系统〔nisin-controlledexpressionsystem,NICE〕.该系统含有3个组分：携带nisR和nisK基因的宿主菌、充当诱导分子的乳菌肽〔Nisin〕以及含有nisA启动子的质粒。诱导剂Nisin诱导ni-sA启动子，nisA启动子由nisR和nisK组成的双组分调节系统进行调节。nisK是Nisin的膜结合感应蛋白，nisR是膜内反响调节子。nisK接受外源nisin肽信号后，本身磷酸化激活胞浆内nisR,随后nisR激活nisA启动子，启动下游基因的转录和表示出。宿主菌NZ3900含有nisK和nisR基因，质粒pNZ8149含有nisA启动子，其起始密码子ATG处有NCOI酶切位点，这样使插入的目的基因与nisA启动子的核糖体结合位点区域构成翻译融合，较转录融合具有更高层次的表示出活性。通常将含有nisA启动子的质粒导入携带nisR和nisK蛋白的宿主菌时，外源基因的表示出较弱，当在对数生长期参加nisin进行诱导后，外源基因的表示出水平在一定范围内与nisin的剂量成正比，诱导效率能够到达1000倍以上[7].乳杆菌的表示出载体既能够利用胸苷酸合成酶〔thymidylatesynthase,Thy〕或丙氨酸消旋酶〔alanineracemase,Alr〕的营养缺陷型作为选择标记，可以以利用乳糖或木糖作为选择标记。这些标记均可食用，对于口服疫苗的开发极具价值。人们发现thyA基因编码的Thy在DNA合成中起关键作用，缺失thyA基因的菌株在普通培养基上不能生长，alr基因编码的Alr是很多细菌生长的必需成分。Fu等[8]以干酪乳杆菌来源的thyA基因作为选择标记，构建了食品级载体pFXL103,Bron等[9]将含异源alr基因的质粒pGIPO11转化到乳酸乳球菌alr-菌株后，alr-菌株恢复了野生型表型。Platteeuw等[10]构建了食品级穿梭表示出载体pLP3537,它含有lacF选择标记、高拷贝内源性的乳酸乳球菌pSH71复制子、lacA启动子和PepN终止子，配套菌株为删除了lacF基因的乳酸乳球菌NZ3900株，能够利用乳糖作为选择标记。将pLP3537质粒转入LacF基因缺失的宿主菌NZ3900株后，可使原来不能利用乳糖的宿主菌NZ3900发酵乳糖并产酸，使pH降低，使挑选培养基中的溴甲酚紫由紫色变为黄色，这种利用乳糖为选择标记的表示出系统的元件都是食品级的，口服具有安全性。Gosalbes等[11]构建了乳糖调节的乳酸杆菌食品级表示出载体pILac.戊糖乳球菌的MD353染色体上含有木糖〔xylose,xy1〕编码基因，能够发酵木糖。Posno等[12]把xy1基因插入pLP3537,得到食品级表示出载体pLP3537-xyl,能够利用木糖作为选择标记，这些选择标记的成功开发为发展乳杆菌成为疫苗载体提供了有力的保障。2猪卵透明带3重组乳杆菌疫苗猪卵透明带3抗原〔porcinezonapellucid3，PZP3〕是一种分子量为73kDa的糖蛋白，包被于卵母细胞和着床前胚胎的外表，是一种精子特异性受体，在精卵结合和其后引发的精子顶体反响中起主要作用。Martinez等[13]将重组PZP3蛋白接种鼠猴获得了较好的避孕效果，提示它是一种有效的受精前免疫避孕靶抗原。熊亚明等[14]以pVAX1-PZP3为模板扩增900bp的PZP3编码基因，插入pILac-SP得pILac-PZP3；将其电穿孔转化干酪乳杆菌CECT5276株，培养48h,免疫印渍发现兔抗PZP3的血清辨别重组菌表示出的分子量为55kDa的PZP3蛋白，表示清楚该疫苗可表示出具有生物活性的PZP3蛋白。3人绒毛膜促性腺激素重组乳杆菌疫苗3.1人绒毛膜促性腺激素人绒毛膜促性腺激素〔humanchorionicgonadotropinbeta-subunit,hCG〕是人体滋养细胞分泌的妊娠特有激素，可维持并刺激妊娠黄体产生孕酮，促进蜕膜细胞发育成熟，是一种受精后免疫避孕的靶抗原。Talwar等[15]将hCG制剂接种受试妇女可诱导hCG抗体，一旦hCG抗体浓度到达50ng/mL的水平常即可诱导很好的避孕效果。Kahala等[16]发现短小乳杆菌的S-层蛋白A〔S-layerproteinA,SLPA〕是一种分子量为40kDa的信号蛋白，可有效引导外源蛋白在乳杆菌的分泌表示出。王红梅等[17,18]以pBS-hCG为模板扩增hCG编码基因，与SLPA的编码基因连接后，插入pILac得pILac-hCG；将其电穿孔转化干酪乳杆菌CECT5276株，0.5%乳糖诱导21h,SDS证实重组菌表示出分子量为22kDa的hCG蛋白；将108CFU疫苗经阴道接种BALB/c鼠1次，在初次免疫后2周发现免疫鼠的阴道冲洗液sIgA升高〔滴度1∶12800〕,提示该疫苗可诱导小鼠产生一个有效的黏膜免疫应答。姚晓英等[19~21]以短小乳杆菌的基因组DNA为模板扩增90bp的SLPA编码基因，以pBS-hCG为模板扩增495bp的hCG编码基因，将SLPA与hCG的编码基因连接后插入pILac得pILac-hCG；将其电穿孔转化干酪乳杆菌CECT5276株，培养8h,免疫印渍发现兔抗hCG的血清辨别重组菌表示出的分子量为22kDa的hCG蛋白；将109CFU疫苗经阴道注入BALB/c鼠，在初次免疫后3周加强1次，在初次免疫后5周发现阴道冲洗液sIgA升高，在初次免疫后6周发现免疫鼠的脾细胞明显增殖，并分泌高水平的IFN-和IL-4等细胞因子，放免试验证实阴道冲洗液hCG水平在初次免疫后24~35d升高，在初次免疫后28d达较高水平〔浓度15MIU/mL〕;同时将1010CFU疫苗经阴道接种和灌胃分别免疫BALB/c鼠和C57BL/6鼠，在初次免疫后3周加强1次，在初次免疫后4周发现免疫鼠的脾细胞明显增殖，在初次免疫后4~8周发现免疫鼠的子宫和阴道冲洗液均存在IgG分泌细胞以及IgA分泌细胞，提示该疫苗可诱导小鼠产生一个有效的黏膜和体液免疫应答。3.2hCG-C3d3Dempsey等[22]以为补体片段C3d可增加靶抗原的免疫原性，C3d3是3个拷贝的C3d,与抗原共价结合后可选择性加强宿主的体液免疫应答。姚晓英等[23,24]以phCMV1-hCG-C3d3为模板扩增hCG-C3d3的编码基因，插入pILac得pI-Lac-hCG-C3d3;将其电穿孔转化干酪乳杆菌CECT5276株，0.5%乳糖诱导24h,SDS证实重组菌表示出分子量为220kDa的hCG-C3d3融合蛋白；将1010CFU疫苗经阴道分别接种BALB/c鼠和C57BL/6鼠，在初次免疫后3周加强1次，在初次免疫后2~8周发现免疫鼠的血清和阴道冲洗液IgG和IgA升高，脾、子宫和阴道的淋巴细胞增殖，阴道和子宫的抗体分泌细胞的数目显着增加，提示该疫苗同样可诱导小鼠产生一个有效的黏膜和体液免疫应答。El-Hefnawy等[25]发现MLTC-1细胞株是小鼠睾丸间质肿瘤细胞系，可表示出hCG受体，在hCG刺激下可分泌孕酮。Wice等[26]证实Bewo细胞株是人绒癌细胞系，具有自发融合的生物学作用，可在体外模拟体内滋养细胞的分化融合经过。王健理等[27]将1010FU重组菌LL〔pILac-hCG-C3d3〕滴鼻免疫BALB/c鼠，在初次免疫后3周加强1次，在初次免疫后6周发现免疫鼠的血清可抑制hCG刺激的MLTC-1细胞株分泌孕酮，抑制Bewo细胞株分泌hCG以及Bewo细胞株融合，提示该疫苗可诱导小鼠产生具有生物活性的hCG抗体。4结语乳杆菌具有下述优点：它是一种发酵工业长期使用的食品级益生菌，是一种公以为安全〔generallyregardedassafe,GRAS〕的微生物，易培养，基因操作简便可靠，转化效率高，重复性好；乳杆菌是一种革兰阳性菌，不分泌内毒素，表示出的外源蛋白不需纯化，可连同菌体直接服用；乳杆菌通常不产生细胞外蛋白酶，不会在细胞外对分泌的外源蛋白进行降解；乳杆菌通常较少分泌本身蛋白，减少了载体本身蛋白对分泌的外源蛋白的干扰；外源蛋白既可在细胞内表示出，可以在细胞壁进行表示出，还能够分泌到细胞外进行表示出；乳杆菌通常具有免疫佐剂、固有免疫原性和对胆汁酸的抵抗力，可在胃肠道定植，在胃肠道的微生态平衡中具有重要作用。乳杆菌与微颗粒疫苗的大小类似，可将抗原递呈给肠黏膜组织的M细胞，诱导免疫应答；口服或滴鼻接种乳杆菌可诱导宿主产生较强的黏膜免疫应答和系统性免疫应答。乳杆菌具有下述缺点：当前大部分乳杆菌表示出载体常含有非食品级的基因片段，这会给乳杆菌作为活菌微生态制剂带来安全隐患；尚未说明乳杆菌疫苗诱导小肠产生黏膜免疫应答的机制；尚未说明乳杆菌疫苗的表示出调控机制；长期口服乳杆菌疫苗并不能在宿主体内表示出足量的抗原；长期低剂量口服乳杆菌疫苗有可能诱导免疫耐受；乳杆菌疫苗的效果评价仅限于体外试验和动物试验阶段。随着分子生物学和分子免疫学技术的发展，进一步挑选高表示出能力的菌株可提高外源蛋白的表示出水平；针对不同的蛋白表示出方式采用不同的免疫途径可提高重组乳杆菌诱导的免疫应答；深切进入研究乳杆菌分泌外源蛋白的调控机制；构建安全高效的食品级表示出载体；准确定位外源蛋白在乳杆菌中的表示出位置，使重组抗原与黏膜的免疫系统充分接触；实时定量检测重组乳杆菌在宿主胃肠道表示出的目的蛋白；合理控制重组乳杆菌在胃肠道的存活时间，避免免疫耐受；开发适宜的免疫佐剂加强重组乳杆菌诱导的免疫应答。相信随着这些问题的说明，将乳杆菌介导的免疫避孕疫苗用于生育期妇女的节育指日可待。以下为参考文献[1]XUYi-gang,CUILi-chun.ProgressonLacticacidbacteriaasgeneengeneeringbacteria[J].ChinJMicrobiol,2007,19〔1〕:118-120.〔inChinese〕徐义刚，崔丽春。乳酸菌作为基因工程受体菌的研究瞻望[J]中