蛋白质的分析

第九章蛋白质分离技术第五组成员周锡欢4-7页文艺8-28页申培培29-41页邹家奕42-52页第五组成员廖莹53-71页何容秀72-88页田景艳89-97页彭浩98-104页第九章蛋白质分离技术姓名：周锡欢学号：2014950001班级：2014级医检1班第一节蛋白质分离与纯化概述蛋白质的特点容易变性遇酸、碱发生水解变性后生物学活性丧失第九章蛋白质分离技术蛋白质的来源随着DNA重组技术的问世，蛋白质的表达和分离纯化技术得到了广泛的应用。第九章蛋白质分离技术蛋白质的分离纯化利用其相应的理化性质，采取盐析、透析、离心、电泳以及色谱等不破坏蛋白质空间构象的方法，获得高纯度的目的蛋白质。第九章蛋白质分离技术第九章蛋白质分离技术姓名：文艺学号：2014950007班级：2014级医检1班第一节蛋白质分离与纯化一、分离纯化策略常用的蛋白质分离纯化技术分离依据溶解度差别电荷不同生物分子特性分子大小第九章蛋白质分离技术常用的蛋白质分离纯化方法及原理1、透析2、超过滤3、凝胶过滤分子大小第九章蛋白质分离技术利用蛋白质分子不能透过半透膜的性质，使蛋白质和其他小分子物质如无机盐、单糖、水等分开。原理第九章蛋白质分离技术1、透析2、超过滤3、凝胶过滤分子大小常用的蛋白质分离纯化方法及原理第九章蛋白质分离技术加压蛋白质溶液半透膜支持膜的栅板超滤液利用压力和离心力，强行使其他小分子和水通过半透膜，而蛋白质留在膜上。原理第九章蛋白质分离技术1、透析2、超过滤3、凝胶过滤分子大小常用的蛋白质分离纯化方法及原理第九章蛋白质分离技术当不同分子大小的蛋白质混合物流进凝胶层析柱时，比凝胶网孔大的分子不能进入珠内网状结构，排阻在凝胶珠以外，在凝胶珠缝隙间隙中向下移动。而比孔小的分子不同程度地进入凝胶珠内，这样由于不同大小分子所经历的路径不同而到分离。原理第九章蛋白质分离技术常用的蛋白质分离纯化技术分离依据溶解度差别电荷不同生物分子特性分子大小第九章蛋白质分离技术等电点沉淀溶解度差别盐析不同蛋白质具有不同的等电点，当蛋白质混合物调到其中一种蛋白质的等电点时，这种蛋白质大部分或全部被沉淀下来。低浓度时，中性盐可以增加蛋白质溶解度这种现象称为盐溶。当离子强度增加，足够高时，例如饱和或半饱和程度，很多蛋白质可以从水中沉淀出来，这种现象称为盐析。第九章蛋白质分离技术常用的蛋白质分离纯化技术分离依据溶解度差别电荷不同生物分子特性分子大小第九章蛋白质分离技术

电荷不同氨基酸分离常用阳离子交换树脂，树脂被处理成钠型，将混合氨基酸上柱，氨基酸主要以阳离子形式存在，在树脂上与钠离子发生交换，而被挂在树脂上。离子交换层析第九章蛋白质分离技术常用的蛋白质分离纯化技术分离依据溶解度差别电荷不同生物分子特性分子大小第九章蛋白质分离技术生物分子特性亲和疏水作用层析第九章蛋白质分离技术亲和层析是一种吸附层析，抗原(或抗体)和相应的抗体(或抗原)发生特异性结合，而这种结合在一定的条件下又是可逆的。所以将抗原(或抗体)固相化后，就可以使存在液相中的相应抗体(或抗原)选择性地结合在固相载体上，借以与液相中的其他蛋白质分开，达到分离提纯的目的。高效快速简便优点第九章蛋白质分离技术生物分子特性亲和疏水作用层析第九章蛋白质分离技术疏水作用层析是根据分子表面疏水性差别来分离蛋白质和多肽等生物大分子的一种较为常用的方法。蛋白质和多肽等生物大分子的表面常常暴露着一些疏水性基团，我们把这些疏水性基团称为疏水补丁，疏水补丁可以与疏水性层析介质发生疏水性相互作用而结合。不同的分子由于疏水性不同，它们与疏水性层析介质之间的疏水性作用力强弱不同，疏水作用层析就是依据这一原理分离纯化蛋白质和多肽等生物大分子的。疏水作用层析常用的蛋白质分离纯化技术类别方法分离依据特点用途沉淀法盐析破坏蛋白质水化膜操作简便，成本低廉，对蛋白质和酶有保护作用，重复性好蛋白质和酶的分级沉淀。粗制阶段有机溶剂沉淀破坏蛋白质水化膜操作简便，分辨力较强粗制阶段选择性沉淀等电点、热变性、酸碱变性等沉淀作用选择性较强，方法简便粗制阶段第九章蛋白质分离技术类别方法分离依据特点 用途膜技术超滤分子大小操作方便，可连续操作，但是分辨率低粗制阶段透析分子大小小样品处理，不能用于工业生产脱盐、更换流动相第九章蛋白质分离技术类别方法分离依据特点用途色谱法离子交换电荷处理量大，分辨力较高最适于早期纯化，即大体积样品且蛋白纯度较低时采用亲和生物亲和性分辨率极高，容量大，样品体积不限适于任何阶段，特别是样品浓度低，杂质含量高时采用凝胶过滤分子大小分级分离，分辨率适中；非常适合脱盐；分级分离时流速较慢，脱盐时流速较快缺点：样品体积受限大规模纯化的最后一步，用于去除微量杂质及聚合体。脱盐时可用于任何阶段，特别是步骤衔接时的缓冲液更换疏水作用疏水性分辨率较高，流速大，容量大，样品体积不受限适于任何阶段，特别适于样品离子强度较高时，如沉淀、离子交换和亲和层析后反相疏水性分辨率较高，流速大，容量大，样品体积不受限适于最后阶段，特别适于分子量较小的肽最为广泛第九章蛋白质分离技术原材料破碎、溶解离心↓提取液↓超滤除核酸↓粗制品↓↓亲和色谱凝胶色谱疏水色谱反相色谱结晶高纯度蛋白质↓↓↓↓↓↓↓↓↓前处理阶段盐析、有机溶剂沉淀、等电点沉淀离子交换色谱粗制阶段精制阶段蛋白质分离纯化过程第九章蛋白质分离技术姓名：申培培学号：2014950016班级：2014级医检1班第一节蛋白质分离与纯化二、样品的前处理第九章蛋白质分离技术为什么要进行样品前处理？一、样品的前处理重要性第九章蛋白质分离技术样品属于复合基质体系复杂的基质背景会对被分析的目标化合物的提取、分离、净化和测定等带来很大的麻烦而且对于分析结果的准确可靠和灵敏具有决定性作用。60%的工作和花费都用在样品的前处理上二、样品前处理的原则制备过程中避免组分发生化学变化；要防止和避免欲测定组分的玷污；尽可能减少无关化合物引入制备过程；尽可能简单易行。第九章蛋白质分离技术

含量高来源丰富成本低廉分离制备工艺简便生物材料第九章蛋白质分离技术三、材料的选择四、原材料的破碎第九章蛋白质分离技术原材料的破碎方法机械破碎法：利用匀浆器、组织分散器、细菌磨、超声仪或高压挤压设备破碎细胞。

多功能粉碎机第九章蛋白质分离技术第九章蛋白质分离技术第九章蛋白质分离技术五、样品的提取生物材料破碎之后，加入适当的裂解溶液，使细胞中的蛋白质释放到溶液中。第九章蛋白质分离技术样品提取的注意事项第九章蛋白质分离技术细胞破碎后，根据目的蛋白质是在上清液中还是在固相沉淀中分别处理。若蛋白质在提取液中，先通过离心方法出去不溶物，蛋白质上清液进行后续的纯化处理。在破碎、提取及后续纯化过程中，最好在4摄氏度条件下进行，防止温度过高引起蛋白质变性失活六、样品处理的过程第九章蛋白质分离技术第九章蛋白质分离技术第九章蛋白质分离技术姓名：邹家奕学号：2014150005班级：2014级医检1班第一节蛋白质分离与纯化三、低分辨率操作单元低分辨率操作单元盐析法有机溶剂沉淀法选择性沉淀第九章蛋白质分离技术盐析法

中性盐（固体粉末或饱和溶液）缓慢加入蛋白质溶液，使蛋白质水化膜被破坏，形成沉淀。优点：操作简单、成本低、使用范围广、不易造成蛋白质失活缺点：分辨率较差（通常作为初步的分离纯化）eg：血清中的白蛋白和球蛋白分离第九章蛋白质分离技术水化膜蛋白质属高分子化合物，其颗粒大小已达到胶粒范围（1~100nm），由蛋白质形成的溶液是一种稳定的亲水胶体溶液。蛋白质胶体溶液的稳定因素为蛋白质表面的水化膜和同种电荷。蛋白质表面极性基团形成的水化膜将蛋白质颗粒彼此隔开，加之蛋白质在非等电状态时，带同种电荷互相排斥也不致聚集而沉淀。第九章蛋白质分离技术盐的加入方式•1.加入固体盐法,用于要求饱和度较高而不增大溶液体积的情况；固体研细后缓慢加入,防泡沫,要平衡.•2.加入饱和溶液法,用于要求饱和度不高而原来溶液体积不大的情况；使用饱和盐溶液，要求盐析范围小于50%饱和度•3.

透析盐析.属于透析平衡法,先将盐析的Pr溶液样品装于透析袋中，然后放入一定浓度的盐溶液中,或浸入饱和硫酸铵中进行透析，由于渗透压的作用,透析袋内硫酸铵饱和度逐渐提高，达到设定浓度后，目的蛋白析出，停止透析。第九章蛋白质分离技术盐析注意事项1.盐析的成败决定于溶液的pH值与离子强度，溶液pH值越接近蛋白的等电点，蛋白质越容易沉淀。2.盐析一般用的硫酸铵，平铺放入烤箱内60摄氏度烘干后再称量，这样更准确。3.在加入盐时应该缓慢均匀，搅拌也要缓慢，越到后来速度应该更注意缓慢，如果出现一些未溶解的盐，应该等其完全溶解后再加盐。4.盐析后最好搅拌40分钟到一个小时而且再在冰浴中放置一段时间。5.盐析后的蛋白质最好尽快脱盐处理，以免变性。6.一般粗提物蛋白完全沉淀是在硫酸铵浓度在70%左右。第九章蛋白质分离技术有机溶剂沉淀法（必须在低温下进行）

有机溶剂通过剥夺蛋白质表面的水化膜使蛋白质沉淀优点：分辨率比盐析法高缺点：容易使蛋白质失活eg:血液制品低温乙醇工艺第九章蛋白质分离技术有机溶液沉淀法的影响因素1、有机溶剂的选择在实际生产中，常用的有机溶剂如乙醇、丙酮、异丙酮、氯仿等。丙酮的介电常数小，沉淀能力强；而乙醇无毒，广泛应用于药品生产中。2、温度的控制有机溶剂沉淀时，温度是重要的控制指标。根据沉淀对象的不同，采用的温度不同，为防止蛋白质在较高温度时发生变性，一般要求在低温下进行。第九章蛋白质分离技术有机溶液沉淀法的影响因素3、PH值等电点时，蛋白质的溶解度最低。在有机溶剂沉淀时，应选择ph值在等电点附近。4、离子强度在有机溶剂和水的混合液中，盐在一定的浓度范围内能增加蛋白质在有机溶剂中的溶解度，使有机溶液沉淀率降低。第九章蛋白质分离技术选择性沉淀根据蛋白质的理化性质可以有选择的使某些蛋白质发生沉淀优点：不经过色谱纯化，粗提得到的热稳定蛋白质接近纯净缺点：只对某些特定蛋白有效eg:大肠杆菌表达的外源性耐热蛋白纯化第九章蛋白质分离技术第九章蛋白质分离技术姓名：廖莹学号：2014150064班级：2014级医检1班第一节蛋白质分离与纯化四、高分辨率操作单元（一）离子交换色谱分离原理蛋白质色谱技术技术种类高分辨率操作单元第九章蛋白质分离技术蛋白质色谱技术概念：

分离原理：

利用蛋白质颗粒大小、电荷多少、疏水作用力的强弱以及亲和力等物理化学特性不同，理化性质相差不大的蛋白质混合物组分经过与填料成千上百次的结合—解离而得到分离。流动相在柱中往下流动时，已被结合在柱顶端颗粒上的A和B部分被重新结合在颗粒上，就这样随着流动相的不断加入，在色谱中就不断发生结合、解离、再结合、在解离。第九章蛋白质分离技术

技术分类根据填料根据色谱柱大小根据原理常压色谱中压色谱高压色谱分析型色谱柱制备色谱柱工业制备柱离子交换色谱亲和色谱凝胶过滤色谱等第九章蛋白质分离技术高效液相色谱仪的原理高效液相色谱仪第九章蛋白质分离技术什么是离子交换色谱？

是利用蛋白质等电点的差异，所带电荷性质和电荷量不同，因此与具有相反离子交换材料的结合强度不同，被流动相洗脱保留时间不同，从而达到分离目的的一种层析技术

基于

第九章蛋白质分离技术分子之间电荷的差异电荷量的影响因素可解离基团的性质、数量以及溶液PH的影响第九章蛋白质分离技术离子交换填料的组成第九章蛋白质分离技术定义：固体支持物，赋予填料形状，一般为球形。选择条件：1.尽可能小的非特异性吸附；2.表面高度亲水；3.具有相当量的化学基团可供活化；4.具有较好的物理化学稳定性；5.具有良好机械强度的多孔网状结构。

分类：树脂、纤维素、葡聚糖凝胶、琼脂糖凝胶、聚丙烯酰胺等基质第九章蛋白质分离技术电荷基团对阴、阳离子交换填料的选择对强、弱离子交换填料的选择强酸或强碱型离子交换填料适用的PH范围较广，常用于制备去离子水和分离一些小分子物质或在极端PH下物质的分离。由于弱酸或弱碱型离子交换填料不易使蛋白质失活，因此蛋白质等大分子物质的分离一般采用弱酸或弱碱型离子交换填料取决于被分离物质在其稳定的PH下所带电荷正电荷阳离子交换填料负电荷阴离子交换填料第九章蛋白质分离技术离子交换填料相关指标这些指标有什么意义？分析速度！第九章蛋白质分离技术缓冲液的选择第九章蛋白质分离技术缓冲液的选择第九章蛋白质分离技术离子交换过程离子交换层析第九章蛋白质分离技术离子交换色谱操作流程为什么要荷压装柱？为了避免颗粒大小不等的交换剂在自然沉降时分层，同时使柱床压紧，减少死体积，有利于分辨率的提高。基线？第九章蛋白质分离技术第九章蛋白质分离技术洗脱等浓度洗脱分段洗脱梯度洗脱第九章蛋白质分离技术色谱柱的选择宜采用短柱，减少扩散。如果要增加柱床体积，宜增加柱子直径阶段洗脱时尤其要注意使用短柱，以避免梯度的急剧变化，降低分辨率连续梯度洗脱时，适当的增加柱长可增加分辨率第九章蛋白质分离技术小结几乎所有生物大分子都是极性的，都可使其带电，因此离子交换法已广泛的应用于生物大分子的分离纯化第九章蛋白质分离技术姓名：何容秀学号：2014150026班级：2014级医检1班第九章蛋白质分离技术第一节蛋白质分离与纯化四、高分辨率操作单元（二）亲和色谱原理将一对能可逆结合和解离生物分子的一方作为配基（也称为配体），与具有大孔径、亲水性的固相载体相偶联、制成专一的亲和吸附剂，再用此亲和吸附剂填充色谱柱，当含有被分离物质的混合物随着流动相流经色谱柱时，亲和吸附剂上的配基就有选择地吸附能与其结合的物质，而其他的蛋白质及杂质不被吸附，从色谱柱中流出，使用适当的缓冲液使被分离物质与配基解吸附，即可获得纯化的目的产物。第九章蛋白质分离技术亲和色谱填料第九章蛋白质分离技术基质间隔臂配体基质的定义基质是一种刚性、内部为多孔结构，表面有大量反应基团的颗粒物质，用于支撑间隔臂和配体。第九章蛋白质分离技术基质基质的选择理想的基质应符合下面的要求极低的非特异性吸附。高度的亲水性较好的理化稳定性大量的化学基因能被有效地活化，而且容易和配体结合。适当的多空性

一般亲和吸附剂采用的基质有纤维素、聚丙烯酰胺凝胶、交联葡萄糖、琼脂糖、交联琼脂糖，多空玻璃珠。第九章蛋白质分离技术第九章蛋白质分离技术配体的选择

1.配体与待分离的物质有适当的亲和离

2.配体与待分离的物质之间的亲和力要有较强的特异性

3.配体要能够与基质稳定的共价结合

4.配体自身具有较好的稳定性

配体的选择配体分离蛋白抗原抗体抗体抗原、病毒、细胞蛋白质A、蛋白质G免疫球蛋白蛋白酶抑制剂、底物蛋白酶三嗪染料脱氢酶、激酶、白蛋酶、干扰素凝聚剂多糖，糖蛋白、细胞表面因子受体、细胞核酸互补碱基序列、组蛋白、核酸结合蛋白激素、维生素受体，载体蛋白螯合金属离子含有组氨基，半光氨基、色氨基残基的蛋白质酶底物类似物、抑制剂辅助因子肝素脂蛋白、脂肪酶、甾体受体、限制性核酸内切酶、抗凝血酶第九章蛋白质分离技术配体的固相化接臂活化第九章蛋白质分离技术活化第九章蛋白质分离技术第九章蛋白质分离技术第九章蛋白质分离技术接臂第九章蛋白质分离技术大分子蛋白质或者其他带有氨基的大分子为配体，可直接偶联于琼脂上。小分子化合物为配体时，由于基质的空间位阻效应，影响陪体与蛋白质的结合，间隔分子第九章蛋白质分离技术第九章蛋白质分离技术亲和色谱操作技术样品制备第九章蛋白质分离技术第九章蛋白质分离技术基本特点第九章蛋白质分离技术优点纯化过程简单，迅速，且分离效率高。特别使用与分离纯化一些含量低、稳定性差的生物大分子。纯化倍数大，产物纯度高缺点价格相对较贵。必须针对某一分离对象制备专一的配备及寻求稳定的层析条件。在洗脱中，交联在层析介质上的配基可能脱落并进入产品中从而造成不良影响，如抗体，染料等配基。第九章蛋白质分离技术第九章蛋白质分离技术姓名：田景艳学号：2014150071班级：2014级医检1班第一节蛋白质分离与纯化四、高分辨率操作单元（三）凝胶色谱目的要求：1、熟练凝胶色谱分离的基本原理；2、掌握凝胶柱色谱填充的装柱、平衡、加样、洗脱等基本操作技术；3、掌握做好本实验的关键及注意事项；4、凝胶色谱分离有何特点和用途。第九章蛋白质分离技术1、凝胶色谱法分离原理：凝胶色谱是利用某些凝胶对于不同组分因分子大小不同而阻滞作用不同的差异而进行分离的技术。当溶液在色谱柱内流动时，各种物质分子在柱内同时进行向下的移动和不定向的分子扩散运动。体积大小分有三种情况，一是分子很小，能进入分子筛全部的内孔隙;二是分子很大，完全不能进入凝胶的任何内孔隙;三是分子大小适中，能进入凝胶的内孔隙中孔径大小相应的部分，因此，在流动过程中不断地进出于胶粒的微孔，这样就使小分子物质向下流动的速度落后于大分子物质，从而使溶液中的各组分按分子量从大到小顺序先后流出色谱柱，达到分离纯化的目的。2、凝胶色谱填料分类1）葡萄糖凝胶

SephadexG交联葡聚糖的商品名为Sephadex，不同规格型号的葡聚糖用英文字母G表示，G后面的阿拉伯数为凝胶得水值的10倍。SephadexLH-20，是─SephadexG-25的羧丙基衍生物，能溶于水及亲脂溶剂，用于分离不溶于水的物质。（2）聚丙烯酸胺是一种人工合成凝胶，是以丙烯酰胺为单位，由甲叉双丙烯酰胺交联成的，凝胶色谱法经干燥粉碎或加工成形制成粒状，控制交联剂的用量可制成各种型号的凝胶。交联剂越多，孔隙越小。（3）琼脂凝胶胺脂糖凝胶商品名很多，常见的有，Sepharose(瑞典，pharmacia)，凝胶色谱法Bio-Gel-A(美国Bio-Rad)等。琼脂糖凝胶是依靠糖链之间的次级链如氢键来维持网状结构，网状结构的疏密依靠琼脂糖的浓度。一般情况下，它的结构是稳定的，可以在许多条件下使用(如水，pH4-9范围内的盐溶液)。琼脂糖凝胶在40℃以上开始融化，也不能高压消毒，可用化学灭菌活处理。（4）复合凝胶凝胶色谱填料分类第九章蛋白质分离技术凝胶色谱条件：（1）凝胶调料的选择（2）流动相与洗脱模式（3）上样量（4）流速（5）柱直径和长度第九章蛋白质分离技术3、注意事