Western blotting实验所需的试剂器材和操作流程

三、Westernblotting所需：1、 lxSDSLysisbuffer：Tris-HCl(pH=6.8) 0.757gSDS 2g甘油 10ml加去离子水定容至100ml。2、 RIPALysisbuffer:储备(1000ul)50mMTris/HCL(PH8.0)150mMNaCL1%Nonidet-P401%Sodiumdeoxycholate0.1%SDS0.1mMDTT(二硫苏糖醇)0.05mMPMSF1xCocktail(PMSF:Phenylmethanesulfonylfluoride,中文名为苯甲基磺酰氟。现用现配，配好后应在30分钟内使用。)3、 5xSDS电泳缓冲液储存液：甘氨酸 72.05gTris碱 15.15g加入去离子水定容至1000ml。4、 5xSDS上样缓冲液Tris-HCl(PH6.8) 250mMDTT 500mMSDS 10.0%溴酚蓝 1.0%甘油 50%加去离子水定容至100ml分装至1.5mlEP管中，4°C保存。5、 30%丙烯酰胺Solution1：Acrylamide(丙烯酰胺) 29.0gBis-Acrylamide 1.0g加去离子水定容至100ml。6、 pH8.8Solution2：(分离)1.5MTris-HCl(PH8.8) 18.15g调PH至8.8,加去离子水定容至100ml,4C保存。7、 pH6.8Solution3：(积层)0.5MTris-HCl(PH6.8) 3.0g调PH至6.8，加去离子水定容至50ml,4°C保存。8、 10%过硫酸胺(APS)：称取0.1g过硫酸铵(APS)，加入lml去离子水溶解。9、 10%SDS溶液：称取1OgSDS，加入去离子水定容至100ml，室温保存。10、 Blockingbuffer(封闭液)：TOC\o"1-5"\h\z脱脂牛奶 2.5g加去离子水定容至50ml。11、10xTBS：\o"CurrentDocument"Tris-HCl(PH7.6) 200mMNaCl 1500mM加去离子水定容至1000ml。12、 洗脱抗体缓冲液：(TBST)\o"CurrentDocument"Tris-HCl (PH7.6) 20mMNaCl 150mMTween20 0.05%加去离子水定容至1000ml。13、 1MTris-HClTris 121.1g定容至1000ml，用HCl调定PH值。14、 考马斯亮蓝R-250染色液TOC\o"1-5"\h\z考马斯亮蓝R-250 1.0g异丙醇 250ml冰醋酸 100ml加去离子水定容至1000ml。15、 考马斯亮蓝R-250脱色液冰醋酸 100ml乙醇 50ml加去离子水定容至1000ml。六、Westernblotting实验流程1、蛋白提取．培养细胞。.弃培养基，用预冷的1XPBS漂洗细胞3次，去尽残留培养基。.加入1XSDS样品缓冲液(6-wellplate,100pl/w或75cm2plate,500-1000pl/瓶)，刮落细胞，转移到Ep管。注意：冰上操作。.离心12000g,15min，取上清。.95°C加热煮沸样品5minutes。2、 蛋白含量测定(BCA法).工作溶液(WorkingReagent,WR)配制：将50体积试剂BCAReagent与1体积CuReagent混合后即为标准工作试剂，呈嫩绿色。此WR工作溶液在室温稳定，1周内使用不明显影响测定精度。.标准蛋白溶液配制：用双蒸水、0.9%生理盐水、PBS、或用待蛋白样品之缓冲液进行倍比稀释：100卩14000卩g/mlBSA+100卩1稀释溶液(H2O/PBS/0.9%NaCl)=200卩1(BSA=2000卩g/ml)取100卩1连续倍比稀释7次，得到BSA标准溶液2000、1000、500、250、125、62.5、31.25、15.625卩g/ml。.蛋白测定微板测定用96孔板，反应终体积250pl，用酶标仪测定。微板测定：将25pl标准品或待测样本与200plWR工作溶液混合。反应条件：37°C30min。将反应板温度冷却至室温。测定562nm光密度(OD)值，绘制标准曲线并计算蛋白浓度。3、 SDS电泳.制胶组装胶架将洁净、无水的玻片对齐，形成空腔，插入塑料框的凹槽中，注意箭头向上，并确保下端平齐。放于制胶架上夹紧，下端紧贴密封条。分离胶的配置(配置前要用热水将所用试剂进行预热)a.10%分离胶配方如下表：10%胶蒸馏水30%Acr-Bis(29:1)1.5MTris-HclPH&810%SDS10%AP(过硫酸铵)TEMED15ml6.0ml4.95ml3.75ml0.015ml0.015ml0.006mlC.灌胶混匀后用移液枪将凝胶溶液小心注入到长、短玻璃板间的狭缝内(胶高度距样品模板梳齿下缘约1cm)。液封在凝胶表面沿玻板轻轻加一层无水乙醇以隔绝空气(注意加乙醇时要慢些顺着瓶沿加)，使胶面平整。静置约30min观察胶面变化，当看到水与凝固的胶面有折射率不同的界限时，表明胶已完全凝固，倒掉上层无水乙醇，并用滤纸吸干残留的液体。E.浓缩胶的配置a.5%浓缩胶配方下表：5%胶蒸馏水30%Acr-Bis(29:1)0.5MTris-HclPH6.810%SDS10%AP(过硫酸铵)TEMED7ml4.8ml1.04ml2ml0.080ml0.080ml0.010mlb.插入制胶梳混匀后用移液枪将凝胶溶液注入到长、短玻璃板间的狭缝内(分离胶上方)，轻轻加入样品模板梳，小心避免气泡的出现。约30分钟，聚合完全。.电泳A.安装电泳槽将制备好的凝胶板取下，小心拔下梳子。两块10%的凝胶板分别插到U形橡胶框的两边凹形槽中，可往上提起使凝胶板紧贴橡胶。将装好玻璃板的胶模框平放在仰放的贮槽框上，其下缘与贮槽框下缘对齐，放入电泳槽内。倒入lXtris-gly电泳缓冲液。B.样品处理对于蛋白样品直接取相应体积的样品，依次加上适量的5xbuffer(加了B-巯基乙醇)，混匀。95°C加热煮5-10min。加样用移液枪取处理过的样品溶液，小心地依次加入到各凝胶凹形样品槽内，marker加入到其中一个槽内，为区别两块板，marker可加在不同的孔槽中。电泳将电泳槽放置电泳仪上，接通电源，正负极对好。积层胶用60V电压，分离胶用120v电压，待溴酚蓝标记移动到凝胶底部时，关电源，把电泳缓冲液倒回瓶中。剥离胶把电泳槽取出，两块板拿下来，用刮片从长短玻片中间翘起，再把浓缩胶刮掉，取下。留待转膜。4、转膜.依据胶的大小剪取膜和滤纸6片，放入转移缓冲液中平衡10min。如用PVDF膜需用纯甲醇浸泡饱和3-5秒钟。.装配转移三明治：海绵-3层滤纸-胶-膜-3层滤纸-海绵，每层放好后，赶去夹层中的气泡切记：一定要将三明治的顺序弄对。检查电源正负极连接是否正确。.将转移槽置于冰浴中，放入三明治(黑色面对黑色面)，加转移缓冲液，插上电极，250mA,lh-2h(具体时间因情况而定)。注意：应再次检查三明治和电极是否装配正确，电源是否接通。.转膜结束后，切断电源，取出杂交膜。PVDU-・■才.■才■■才4=・■U-・■才.■才■■才4=・■广.J-・■点.J■4■丿4-匸二海三明治示意图5、 封闭配置5%的脱脂牛奶，室温封闭lh,摇床上缓慢匀速摇晃。6、 免疫反应.一抗孵育配置适宜浓度的一抗，依据Marker用剪刀将相应的条带剪出，在15ml或50ml离心管中孵育，4°C,过夜。.荧光二抗或酶标二抗的孵育荧光二抗的浓度1:5000，酶标二抗浓度1:5000(可以依据自己的实验适当调整二抗的浓度)。室温孵育1-2h。7、 化学发光显影定影.配置EC1发光液，两种液体按照1:1的比例配置。.携带物品：剪刀、镊子、曝光夹、吸水纸、定影液、显影液、胶片。.将胶片裁剪成需要的大小，放置一旁备用。⑷•将PVDF膜放置于曝光夹中，在膜上均匀滴加ECL发光液，查看发光