第十二章 胚胎工程

第12章胚胎工程提要胚胎工程的理论基础：胚胎发育胚胎工程的主要操作对象：生殖细胞、受精卵、早期胚胎细胞。胚胎工程的研究内容：体外受精、胚胎移植、胚胎分割、胚胎体外培养、胚胎冷冻保存、动物性别控制。一、胚胎发育（一）、发育

个体发育（ontogeny）：自受精卵开始到形成成熟个体所经历的一段过程。发育

系统发育（phylogeny）：同一起源的生物群的形成历史。（二）、胚胎发育的基本过程受精卵裂囊胚的形成原肠腔的形成中胚层及体腔形成胚层分化1、受精1.1精子和卵子的产生第一次减数分裂前期青春期后第二次减数分裂中期卵子的成熟原始卵泡次级卵泡初级卵泡成熟卵泡次级卵泡1.2精子和卵子的结构精子的结构卵子的结构图1.3受精即：精子与卵子融合成受精卵的过程。主要包括以下几个过程：精子的获能（capacitation）、顶体反应（acrosomereaction）、皮层反应（corticalreaction）、原核形成和融合受精的早期事件引自JaniceP.Evans2002

精子的获能刚排出的精子虽有运动能力，但不能穿过卵子的放射冠和透明带，只有接受雌性生殖道的分泌物（获能因子），才具有受精能力，这种作用称为精子获能。在体外条件下，血清白蛋白（serumalbumin）、高密脂蛋白（high-densitylipoproteins）、氨基聚糖（glycosaminoglycans）、孕酮、钙离子载体（A23187）、ZP3、CO2等均可促进精子获能。顶体酶原转化为有活性的顶体酶。顶体反应获能的精子首先借助头后部（顶体后区）透明质酸酶活性穿过卵母细胞外卵丘细胞层（放射冠），到达透明带，然后精子通过头前部（顶体区）质膜表面的ZP结合蛋白与卵母细胞透明带发生识别，完成结合过程，诱发顶体反应，即：顶体以外排的方式释放出水解酶，将卵子的透明带和卵黄膜溶解，形成精子穿过的通道

皮层反应精子进入卵子后，在精子接触点上，磷脂酰肌醇信号途径启动，产生DAG和IP3。IP3导致内质网中的钙离子释放钙信号进而引起皮层反应，即：卵细胞膜下的皮层颗粒（内含酶类的囊泡），以外排的方式，进入卵黄膜和卵膜之间的腔隙，酶类引起透明带“硬化”，形成受精膜。多精受精阻断受精后通过两种机制阻止多精进入，一是膜瞬间去极化；二是通过皮层反应，破坏精子受体和形成受精膜。

多精进入会形成多余的分裂极和纺锤体，导致细胞异常分裂而使胚胎发育终止。原核形成精子的刺激使处于休眠状态的卵子被激活，重新回到减数分裂阶段，迅速完成第二次分裂，释放极体。此时精子和卵子的细胞核分别称为雄原核（malepronucleus）和雌原核（female

pronucleus）。融合两个原核逐渐在细胞中部靠拢，核膜随即消失，染色体混合，形成二倍体的受精卵（fertilizedovum）又称合子（zygote）。2、卵裂卵裂（cleavage）是指受精卵经过分裂，将卵质分配到子细胞的过程，分裂产生的细胞叫做分裂球(blastomere)。哺乳动物的卵裂较慢，受精1天后才开始卵裂，8细胞之前，分裂球之间结合比较松散，8细胞之后突然紧密化（compaction），在64细胞以前为实心体，称为桑椹胚。3、囊胚的形成在128细胞阶段，细胞团内部空隙扩大，成为充满液体的囊胚腔（blastocoel），此时的胚胎称为囊胚，或是胚泡。3、原肠胚蛙；外包法+内移法；海胆文昌鱼5、胚层分化

外胚层形成神经系统、表皮、皮肤腺、毛发、指甲、爪和牙齿等；

中胚层形成骨骼、肌肉、泌尿生殖系统、淋巴组织、结缔组织、血液；

内胚层形成呼吸系统、消化道、肝、胰。二、体外受精（一）、体外受精概述

体外受精(InVitroFertilization)是指哺乳动物的精子和卵子在体外人工控制的环境中完成受精过程的技术，英文简称为IVF。由于它与胚胎移植技术(ET)密不可分，又简称为IVF-ET。在生物学中，把体外受精胚胎移植到母体后获得的动物称试管动物(test-tubeanimal)。（二）、体外受精技术的发展简史1878年，德国人Scnenk就以家兔和豚鼠为材料，开始探索哺乳动物的体外受精技术。1951年，美籍华人张明觉和澳大利亚人Austin同时发现了哺乳动物的精子获能现象，这一领域的研究才获得突破性进展。

1959年，张明觉以家兔为实验材料，从一只交配后12h的母兔子宫中冲取精子(即体内获能的精子)，从另外两只超数排卵处理母兔的输卵管中收集卵子，精子和卵子在体外人工配制的溶液中完成受精过程，然后，正常卵裂的36枚胚胎被移植到6只受体的输卵管中，其中4只妊娠，并产下15只健康仔兔，这是世界上首批试管动物，它们的正常发育标志着体外受精技术的建立。试管小鼠(Whit-tingham，1968)大鼠(Toyoda和Chang，1974)、婴儿(Steptoe和Edwards，1978)、牛(Brackett等，1982)、山羊(Hamda，1985)、绵羊(Hanada，1985)猪(Chang等，1986)等相继出生。目前，采用IVF-ET技术，充分利用良种母牛的遗传资源，不仅应用于畜牧生产，也成为研究其他胚胎生物技术，如克隆、转基因、胚胎干细胞分离培养和性别控制等的重要辅助手段。

试管婴儿人类第一例试管婴儿子1978年7月23日诞生在英国，婴儿名叫路易斯布朗。她的母亲由于输卵管堵塞不能生育。中国第一个试管婴儿于1985年4月在台湾诞生；我国大陆的第一位的试管婴儿于1988年3月在北京医科大学附属第三医院诞生。爱德华兹——试管婴儿之父、剑桥大学名誉教授、英国皇家学会会员、2001年拉斯克临床医学奖得主。他将独享1000万瑞典克朗(约146万美元)的奖金——主要是因为另一名重要的合作者，妇科医生帕特里克·斯特普托(PatrickSteptoe)早在1988年便撒手人寰。

1、试管婴儿技术包括哪些技术？体外受精、胚胎体外培养和胚胎移植技术。2.试管婴儿和母亲正常怀孕，生产的过程有何异同？相同之处：都通过有性生殖产生，在母体子宫内发育形成胎儿。不同之处：受精作用在体外，并在体外发育成早期胚胎进行胚胎移植。（三）、体外受精技术的研究意义体外受精技术对动物生殖机理研究、畜牧生产、医学和濒危动物保护等具有重要意义。在家畜品种改良中，体外受精技术为胚胎生产提供了廉价而高效的手段，对充分利用优良品种资源，缩短家畜繁殖周期，加快品种改良速度等有重要价值。在人类，IVF-ET技术是治疗某些不孕症的重要措施之一。国产奶牛：年均产奶量3000公斤左右国际良种奶牛：年均产奶量10000公斤左右引进一头良种成年奶牛需要3万－5万元；牛的生育率低，一头牛1胎只生1只，一生只能生育4~5次。牛的生育率虽然很低，但是牛的卵母细胞却相当的多，其卵巢中卵母细胞数目要比一生中排卵数多1000倍左右；公牛产生的精子数目就更多了。胚胎移植采集良种母牛的卵母细胞卵母细胞的体外培养采集良种公牛精子精子体外获能体外受精良种牛体外受精胚胎受体牛良种犊牛成熟期牛屠宰加工厂市场采集卵巢中的卵母细胞“试管牛”工厂化生产的技术流程图（四）、体外受精技术的基本操作程序1、卵母细胞的采集和成熟培养1.1卵母细胞的采集：采集方法通常有三种。

(1)超数排卵：雌性动物用促卵泡素和促黄体素处理，促使卵巢排出更多的卵子，从输卵管中冲取成熟卵子可直接与获能精子受精。实验动物如小鼠、兔，以及家畜猪、羊等大家畜中，由于操作程序复杂，成本较高，很少使用。(2)从活体卵巢中采集卵母细胞借助超声波探测仪、内窥镜或腹腔镜直接从活体动物的卵巢中吸取卵母细胞。按照目前的技术水平，一头健康母牛每周可获得5~10枚卵子。

(3)从屠宰后母畜卵巢上采集卵母细胞从刚屠宰母畜体内摘出卵巢，经洗涤、保温（30℃~37℃)后，快速运到实验室，在无菌条件下用注射器或真空泵抽吸卵巢表面一定直径卵泡中的卵母细胞（牛卵泡直径要求3-10mm）也可对卵巢进行切片，收集卵母细胞。1.2母细胞的选择：采集的COC要求卵母细胞形态规则，细胞质均匀，外围有多层卵丘细胞紧密包围。在家畜体外受精研究中，常把未成熟卵母细胞分为A、B、C和D四个等级。在体外受精实践中，一般只培养A级和B级卵母细胞。

1.3卵母细胞的成熟培养：家畜卵母细胞的成熟培养液目前普遍采用TCM199添加孕牛血清、促性腺激素、雌激素和抗生素成份。2、体外受精2.1精子的获能处理体内获能：直接从交配母畜的子宫内取精子体外受精：先洗涤筛选，然后用肝素和钙离子载体等药物诱发精子获能。2.2受精：（1）获能精子与成熟卵子的共培养，（2）显微注射受精

显微注射受精(microinsemination)又称辅助受精技术(Techniquesf.rassistedfertilizati.n)，克服在某些情况下精子不能穿过透明带和卵黄膜的缺陷。透明带下注射法方法卵细胞质内精子注射法应用价值在医学上已成为治疗某些男性不育症的主要措施之一；在基础生物学中，它对研究哺乳动物受精和发育机理有很重要的价值；对挽救濒危动物和充分利用优良种公畜等有重要意义3、早期胚胎体外培养受精卵需移入发育培养液中继续培养以检查受精状况和受精卵的发育潜力（一般要发育到桑椹胚或囊胚阶段），质量较好的胚胎可移入受体母畜的生殖道内继续发育成熟或进行冷冻保存。

发育阻滞（developmentalblock）体外受精的早期胚胎在体外发育过程中，常会停在某一阶段不再发育，此现象称发育阻滞。产生因素：受精卵早期发育受母源性基因的调控，到2细胞之后，自身基因启动时，母源性的mRNA失活，此期胚胎对环境超敏感；胚胎基因激活的细胞内[H2O2]的升高，体外培养条件不能及时清除，使得胚胎发育阻滞。克服阻滞现象的方法：改进培养液成分，改善培养条件，减少对胚胎发育不利的成分体细胞共培养(输卵管上皮细胞共培养），以提供发育所需的物质条件(（五）、体外受精技术存在的问题和发展方向

1、存在的问题

(1)囊胚发育率低，细胞数少。体外受精卵在培养过程中普遍存在发育阻断(developmentalblock)(2)产犊率低2、发展方向(1)深入研究卵母细胞成熟和胚胎发育的分子机理(2)提高取卵率、加强腔前卵泡培养的研究。(3)加强体外受精与其他生物技术的结合。

三、胚胎移植胚胎移植又称受精卵移植，就是将1头母畜(供体)的受精卵移植到另一头母畜(受体)的子宫内，使之正常发育成为新个体的技术，俗称“借腹怀胎”。胚胎移植实际上就是产生胚胎的供体和养育胚胎的受体分工合作共同繁殖后代。（一）、胚胎移植的研究历史1、1890年，剑桥大学的Heape以兔为材料，首次获得胚胎移植的成功，奠定了胚胎移植的生理学基础和原则。2、20世纪30～70年代成为生物科学的主要研究方向之一，在多种家畜上移植成功。3、1971年世界上出现了第一个胚胎移植公司4、1974年国际胚胎移植协会(IETS)成立

5、目前，胚胎移植已成为畜牧业中最活跃的产业。在商业化应用上，牛的胚胎移植开始最早，商业化生产应用较为成熟，占的比例也最大羊的胚胎移植应用最先开始于澳大利亚，20世纪70年代，澳大利亚每年要进口300万美元的马海毛（安哥拉山羊毛），从而使安哥拉山羊处于一种不切实际的高价地位，为胚胎移植提供了市场条件，促进了澳大利亚安哥拉山羊胚胎移植的发展和应用。我国牛、羊胚胎移植的发展过程分为三个阶段：试验研究阶段（20世纪70年代初至80年代中）发展提高阶段（20世纪80年代中至90年代中）推广应用阶段（20世纪90年代中至现在）奶牛、肉牛、安哥拉山羊、波尔山羊和良种绵羊的胚胎移植开始在畜牧生产中应用2000年全国奶牛胚胎移植数量达到5000头2002起，农业部在北京、新疆、黑龙江、内蒙古、宁夏、陕西、山西、河北和山东等9省（区）实施“万枚高产奶牛胚胎移植富民工程”，极大地促进了奶牛胚胎移植的产业化进程，使我国奶牛胚胎移植数量突破10000头2003年我国共生产奶、肉牛胚胎30000枚以上(二)胚胎移植的意义1、充分发挥优良母畜的繁殖潜力，大大加速了良种母畜的建立和扩大。2、诱发肉畜产双胎，提高生产效率。对发情的母畜配种后再移植一个胚胎到排卵对侧子宫角内。据报道，这样处理后的受胎率可高达70%以上，双胎率可达40-60%。另有报道，当向每一侧子宫角移植一个胚胎时，有72%的母牛受胎，其中双胎率可达到73%。3、缩短世代间隔，增加选择强度，也可以减少种畜的引进和保存品种资源等。加速了良种母畜的建立和扩大

(三)、胚胎移植的生理基础1、母牛发情后生殖器官的孕向发育在发情后的最初一段时期，不论是否已受精，母牛生殖系统均处于受精后的生理状态，在生理现象上，妊娠与未孕并无区别。2、早期胚胎的游离状态胚胎在发育早期有相当一段时间(附植之前)是独立存在的，它的发育基本上靠本身贮存的养分，还未和子宫建立实质性联系。3、在同一物种之内，并没有免疫排斥现象。4、移植的胚胎，在一定时期会和受体子宫内膜建立生理上和组织上的联系，保证了以后的正常发育。此外，受体并不会对胚胎产生遗传上的影响。

(四)、胚胎移植的操作原则1、胚胎移植前后所处环境的一致性2、胚胎收集期限牛一般受精后3-8天采集3、在全部操作过程中，胚胎不应受到任何不良因素(物理的、化学的、微生物的)的影响而危及生命力。4、移植的胚胎必须经鉴定并认为是发育正常者。

选择供体母牛受体母牛……同期发情处理……超数排卵供体公牛配种冲卵质量检查、培养胚胎移植妊娠检查分娩（胚胎移植的犊牛）(五).胚胎移植的基本程序1、供体、受体的选择供体是要加速繁殖的、有生产应用价值的、健康的优良畜种。受体是繁殖力强的健康本地种。3、同步发情处理即：利用某些激素制剂人为的控制和调整一群母畜的发情周期，使之在预定时间内发情。同期发情技术就是以卵巢和垂体分泌的某些激素在母畜发情周期中的作用作为理论依据用激素制剂和类似物，有意识地干预某些母畜的发情过程，暂时打乱它们的自然发情周期的规律，继而将发情周期的进程调整到统一的步调之内，人为地造成发情同期化。

添加孕酮等孕激素延长抑制卵泡发育，延长黄体期；添加前列腺素类

溶解黄体使得发情期提前到来，有时为了使同期发情同期排卵更有效，以便提高受胎率，而采取的配套的促性腺激素，如孕马血激素、

绒毛膜激素、促卵泡素，促黄体素及促性腺激素释放激素，它可促进

内源促性腺激素的释放。

母牛的发情周期

黄体期卵泡期周期第18至第21天周期第1至第17天4、采卵即：胚胎回收

手术法：按外科剖腹术的要求进行术前准备收集胚胎的方法非手术法：采卵一般在输精后5-7天进行。可采用二路导管的冲卵器5、胚胎检查

(1)检卵将收集的冲卵液于37℃温箱内静置10-15min。胚胎沉底后，移去上层液。取底部少量液体移至平皿内，静置后，镜检。低倍(10-20倍)下检查胚胎数量，高倍(50-100倍)下观察胚胎质量。(2)吸卵可用1毫升的注射器装上特别的吸头进行吸卵。要求目标准确，速度快，带液量少，无丢失。目的是移取、清洗、处理胚胎，(3)胚胎质量鉴定正常发育的胚胎，细胞(卵裂球)外形整齐，大小一致，分布均匀，外膜完整。无卵裂现象(未受精)和异常卵(外膜破裂、卵裂球破裂等)都不能用于移植。不同动物胚胎移植时间不同牛、羊：桑椹胚或囊胚阶段小鼠、家兔：卵裂期或囊胚阶段试管婴儿：8个或16个细胞阶段

6.胚胎培养发育到适宜阶段时，可将其取出向受体移植或冷冻保存。对供体和受体于术后要注意观察是否发情。供体发情时即可正常配种，或经过40-80天再重复作为供体。胚胎移植的成功率，即受体妊娠率，鲜胚移植达60-70%，冻胚也达到45-50%，半胚移植达55.6%。超数排卵与胚胎移植技术在畜牧业生产应用中到底有多大的意义呢？超数排卵与胚胎移植技术发展到现在，仍然有几个基础问题需要进行深入研究：研究控制卵泡发育动态的原理和方法，进一步缩小超数排卵的个体差异、提高超排稳定性，提高胚胎移植在家畜品种改良和育种中的应用效率在胚胎移植工作中，后代数量远远少于预期数。这里面肯定存在着从卵泡生长发育、卵母细胞生长成熟及早期胚胎发育的内在原因，但到底是什么原因，这是我们需要进一步探索清楚的问题。供体母畜各个体之间所获得的胚胎移植效果存在着较大的差异(P<0.05)，

四、胚胎分割技术胚胎分割技术就是将一枚胚胎用显微手术方法分割成二分、四分、八分胚，经体内或体外培养，然后移植入受体中，得到同卵双生或多生后代的技术。是胚胎克隆的一种方法。胚胎分割技术研究的理论根据是动物早期胚胎细胞具有全能性。1979年，英国一位科学家利用绵羊的幼胎进行试验，当绵羊的受精卵从1个分裂为8个细胞时，他把这8个细胞分成4份，每份2个细胞，然后将分割的细胞重新送到母羊子宫里孕育。结果，母羊产下了4头活泼健康的小羊羔。1986年我国科学家曾用绵羊作试验，把一高产绵羊的胚胎分成5份，分别移植在4头普通的发情母羊子宫内培育，结果得到5头小羊羔。

胚胎分割、移植技术对提高动物繁殖率的效果是极其显著的。如在正常情况下，一头良种奶牛一生产仔只是10头左右，如采用胚胎分割、移植技术，这奶牛就能得到几百头良种奶牛。受精卵分割半胚徒手切割

五、胚胎的保存

（一）、胚胎保存原因对特定的供体而言，能够获得的胚胎数是不可预测的室温或体温条件下，在特定培养液中胚胎只能存活10-20小时(牛羊移植用的鲜胚要在4-8小时进行）。（二）、胚胎保存的意义

1、可以免去移植时要求的同期发情处理。2、可以不受时间、地点和选定受体母牛的限制，随时随地可以进行胚胎移植。

（三）、胚胎的保存方法1972年Whittinghan等发现了在-196℃下保存2～8细胞期小鼠胚胎的冷冻技术。常规速冷冻法冷冻保存方法一步冷冻法玻璃化法常采用多种抗冻保护剂。六、动物性别控制（一）、动物性别控制（sexcontrol）指通过人为的手段进行干预，使动物按人们的意愿繁殖出特定性别后代的技术。

动物的性别由什么决定呢？在二倍体动物的体细胞中,都有一对与性别决定有明显而直接关系的染色体叫性染色体。1902年Mcclung研究蝗虫时，在历史上首次提出了性别决定的染色体理论。（二）理论基础

动物的性染色体分为两类：XY型雄性中是一对大小、形态、结构不同的性染色体，大的一条叫X染色体,小的一条叫Y染色体，即：XY型。雌性的体细胞中是一对X染色体，即：XX型。称为雄异配型。大部分动物属于此类型。ZW型是雌异配型，主要是鸟类和极少数昆虫。在XY型染色体中，精子有两种类型，一是含有X染色体的精子，另一个是含有Y染色体的精子。在哺乳动物中，含X染色体精子受精后生产出雌体，含Y染色体精子受精后生产出雄体。

（三）、性别控制的方法与技术1、X、Y精子分离法(受精之前干预）

2、早期胚胎性别鉴定(受精之后干预）

3、激素和环境

1、X、Y精子分离法1.1理论依据：X、Y精子的差别Y精子有F小体即Y染色体长臂末端有比其他部分强的荧光亮点精子的重量X染色体的DNA含量比Y染色体的多，所以在液体中运动力和沉降速度不同。？精子的运动Y精子的运动活力比较强，运动速度快精子的耐酸碱性Y精子喜碱性，X精子喜酸性精子表面抗原Y精子表面有H-Y抗原（雄性特异性次要组织相容性抗原）1.2分离方法（1）沉降法

利用一定的密度、粘度、pH值、渗透压并且在有营养的液体中对精液沉降分离，用层次沉淀达到分离目的。上层主要为Y精子，下层主要为x精子（2）离心法

这种方法主要是依据精子的比重关系来分离精子。以上两种方法有一定效果其结果都不稳定（3）电泳法

利用X，Y精子所带生物点不同，采用电泳法对精子进行分离，分别收集向阳极和阴极移动的精子。大量实验表明，阳极方向多为X精子，阴极方向多为Y精子（4）流式细胞分离法

主要依据是X、Y精子DNA的含量不同。

(5)免疫学方法目前国内外对H—Y克隆抗体都有广泛的研究，可以期望未来免疫学方法能在控制性别上得到应用（6）改变调控受精环境（牛的性控常用方法）调节生殖道PH值

有人在人工授精时用化学试剂改变阴道里pH值（精氨酸，苏打水等冲洗），从而控制动物后代性别比例。控制输精时间该方法应用关键是如何准确判断发情和确定何时排卵。先排卵再输精，产雄性的几率高，反之，则雌性的几率高。冷冻精液（奶牛生产常用方法）Y精子由于活动力强，存活时间短，冷冻后在复苏活力大减，