第六章 花药和花粉培养

第六章花药和花粉培养花药培养（antherculture）：指用无菌操作技术，将发育到一定阶段的花药接种到人工培养基上，诱导花粉单性发育和分化形成植株的过程。花粉培养（pollenculture）：指将花粉粒从花药中分离出来，以单个花粉粒作为外植体，进行离直接离体体培养使花粉粒脱分化，发育成植株的过程。花药在哪里呀花药花粉植株离体培养的主要目的获得单倍体植株，进行植物育种什么是单倍体植株，为什么要单倍体育种（单倍体育种的意义）一、单倍体育种单倍体：指具有配子染色体数目（n）的个体。一倍体：体细胞含一个染色体组的个体。绝大多数生物为二倍体生物，其单倍体的体细胞中含一个染色体组有的单倍体生物的体细胞中不只含有一个染色体组。如果原物种本身为多倍体，那么它的单倍体的体细胞中含有的染色体组数一定多于一个。如四倍体水稻的单倍含两个染色体组，六倍体小麦的单倍体含三个染色体组。单倍体育种：指将具有单倍染色体的植株，经人工染色体加倍，使其成为纯合二倍体，从中筛选出优良个体，直接繁育出新品种，或选出单一优良性状的个体，作为杂交育种的原始材料。二、单倍体植物在生产实践中的价值筛选到纯合二倍体，后代性状不分离。提高常规育种的选择效率，缩短育种年限，提高育种效率。单倍体植株中由隐性基因控制的性状，虽经染色体加倍,但由于没有显性基因的掩盖而容易显现转基因技术中单倍体植株用作受体，可获得稳定的转基因植株有单倍体获得的纯合二倍体可用于遗传变异规律的研究，基因定位，性状分子标记等三、单倍体植株的产生方法花药培养花粉培养未受精的子房、胚珠的培养诱导孤雌生殖法（远源花粉诱导，受过辐射的花粉诱导）染色体消除法（一些植物种杂交后，核型不稳定，随着发育父本的染色体会被消除掉而只剩下母本的染色体。大麦、小麦等单倍体产生中应用）

四、植物花药/花粉植株培养历史Guha和Maheshwari

（1964）曼陀罗花药培养Nitsch

和Norreel(1973)烟草花粉培养（游离小孢子培养）Chu（1973）小麦花粉培养（早期花药培养主要依靠小孢子的自然胚胎发生产生单倍体，能自发形成胚胎发生的基因频率较低，效率极低）80年代后期到90年代期间，花培技术迅速发展。许多作物小孢子培养已经成功。十字花科、麦类、水稻、玉米等。90年代，一些先前被认为是不易进行小孢子培养的基因型也相续成功Konzak(1999)。花的结构1、花药、花粉粒花丝：将花药托展在空间，以利传粉，同时把营养输送到花药雄蕊部分，供其发育时用（小孢子叶）花药壁：由纤维层、中层、绒毡层构成，二倍体，位于外部花药：

花粉粒：位于内部，性细胞，单倍体

花药发生的一般程序2、花粉粒的发育花粉成熟的各个时期：四分体期：四个小孢子未分离时期单核期：游离的小孢子时期

单核早期：从四分体分离出来时细胞壁薄

单核中期：核位于中央且变大单核晚期：单核靠边区，核被挤到细胞一侧雄配子体阶段双核期：核分裂，产生营养细胞与生殖细胞三核期：有些植物生殖细胞分裂产生2个精子花粉植株的形态发生愈伤组织型：番茄、水稻发生方式类胚胎型：烟草混合型：（一）、花药培养（antherculture）1花药培养的一般程序采花蕾或幼穗预处理取花药进行表面消毒接种在培养基上培养待愈伤组织或类胚体发育到适当阶段移入再生培养基花粉植株染色体加倍移苗2、影响花药培养成功率的因素供体的基因型供体植株的生理状况

开花早期、长势好、长期氮饥饿、高海拔、高纬度情况下花粉的培养成功率高，花粉的发育时期多数植物单核中、晚期花粉最易诱导不同物种诱导胚胎发生的最佳小孢子发育时期发育时期物种减数分裂期草莓、番茄四分孢子期葡萄单核早中期石刁柏、油菜、大麦、天仙子、马铃薯单核晚期荔枝、茄子、青椒、小麦单核早期至晚期烟草单核早期至双核期梨、水稻、甘蓝四分孢子期至双核期玉米对不同发育阶段的花药进行培养测试确定最佳小孢子发育时期的形态特征注意形态特征会因品种、发育状态、环境条件的变化而发生变化处于不同发育阶段的烟草花芽

花粉发育时期的确定材料的预处理和预培养低温预处理（Nitsch和Norreel1973）

可能机理：细胞均等分裂保持花粉活力离心预处理（Tanaka1973）乙烯利处理（Bennett，Hughes1972）高温处理（Chuong，Bersdorf1985）甘露醇处理（卫志明1986）射线处理预处理目的：是改变小孢子的发育方向，使尽可能多的小孢子从配子体发育途径转向孢子体发育途径（即成为具胚胎发生潜力的小孢子）。适当的预处理能使绿苗产量大量增加。

培养基新研制的N6，H等培养基用于花粉培养条件培养基：组织分泌物进入培养基使之条件化。即：用预先培养过花药的液体培养基作为培养基来提高花粉的诱导率。培养方式花药培养常用的培养方式：液体培养：常需加入ficoll增加培养基的密度和浮力，以防组织下沉双层培养：下层为1～1.5ml的琼脂，上层为0.5ml的液体。优点：通气性好，花粉胚长大后不下沉，又能吸收到营养。分步培养：先在液体上漂浮培养，当花粉裂开后，用吸管转移至琼脂培养基。培养条件主要是温度和光照，大部分先在30℃以上高温培养一段时间，再转移至常温培养花粉植株的移栽（二）、花粉或小孢子培养即小孢子培养或游离小孢子培养，将小孢子从花药中分离出来，进行人工培养的技术。优点：排除了花药壁的影响。花药内包含成千上万个单个小孢子或花粉小孢子培养的最佳时期：单核晚期至双核早期1小孢子的分离方法挤压法操作关键：挤压力均匀、滤网孔径合适、分离液的渗透压在烟草、油菜等成功使用过无菌花蕾或花药放入研钵或烧杯玻璃棒或注射器内管挤压滤网过滤后低速离心沉淀用分离液清洗2~3次，再用培养液清洗1次加入分离液制成悬液进行培养散落法

液体悬浮培养时，花粉自动裂开，吸取花粉培养操作关键：选用合适渗透压的液体培养基器械法用小型搅拌器或超速旋切机

小孢子的成活率高、发育期整齐。小孢子分离需达到的标准小孢子的数量无菌、无杂质

2花粉培养方式1、平板培养

花粉置琼脂固化培养基上培养。2、液体培养花粉悬浮在液体培养基中培养，需震荡，以利通气。3、双层培养花粉置固体-液体双层培养基上培养。培养基制作方法：先铺一层琼脂固体培养基，凝固后，在表面加入少量液体培养基。

4、看护培养利用花药或花药愈伤组织释放出的活性物质促进花粉小孢子发育。5、微室培养利用小的盖玻片和凹穴载玻片形成微室进行花粉培养6、条件培养基培养利用培养过花药的液体培养基或含失活花药提取物的培养基上培养。花药条件培养基、子房条件培养等。花药培养和花粉培养两者的异同点培养目的相同，均获得小孢子植株（单倍体植株）。花药培养属于器官培养,产生的植株有单倍体也有二倍体，需要筛选；而花粉培养属于细胞培养，产生的植株为单倍体植株。花药培养相对于花粉培养操作技术简单。花粉培养虽没有药壁组织干扰；可计数小孢子产胚率；可观察雄核发育的全过程；单倍体产量高，但操作技术更复杂。（三）、倍性鉴定（为什么要进行倍性鉴定？）1、染色体直接计数法通常取根尖、茎尖等分生组织区进行制片，直接计数染色体数目。2、间接鉴定（1）扫描细胞光度仪鉴定（流式细胞仪）主要测定叶片单个细胞中DNA的含量确定细胞的倍性，材料的使用量可少到1cm2。（2）细胞形态学鉴定法 叶片保卫细胞大小、单位面积上的气孔数及保卫细胞中叶绿体的大小和数目与倍性具有高度的相关性。（3）植株形态学鉴定法 单倍体植株瘦弱，叶片窄小，花小柱头长，花粉粒小，不结实。（4）杂交鉴定法 自交或测交鉴定，看后代分离情况确定二倍体植株是来自小孢子还是体细胞。（5）分子标记鉴定 包括生化标记（如同工酶标记）和分子标记（如RFLP、RAPD、AFLP等）（四）、单倍体植株染色体加倍方法主要使用秋水仙素、对二氯苯等化学诱变剂1、小苗浸泡法再生苗取出，用秋水仙素直接浸泡，取出清洗后直接转移到新鲜培养基上培养。2、生长锥处理法(茎尖加倍法）将吸附有秋水仙素的棉球裹在植株的顶端分生组织或次生分生组织部位，诱导加倍。3、培养基加倍法直接将植株的外植体置于含有一定浓度秋水仙素的培养基中培养加倍。（五）、花粉植株的培养实例烟草花药培养取花萼与花冠等长的烟草花蕾剥去花萼放入70％酒精10s，0.1％的升汞10min，无菌水冲洗3次无菌条件下，剥去花冠，接种到含有IAA的H培养基，28℃光照培养。3周后，药室开裂，裂口处见浅黄色胚状体，见光后变绿小苗长至3～4片真叶时，用秋水仙素浸苗24～48小时，然后无菌水冲洗后，将苗移植到T培养基上培养苗的驯化、移栽。胚状体发育途径部分花药通过胚状体途径形成小植株烟草花药培养通过胚状体途径再生形成小植株烟草花药培养茄子的小孢子培养镜检，确定合适的小孢子的发育时期。取花蕾于5～8℃预处理48h剥去花萼放入70％酒精10s，0.1％的升汞10min，无菌水冲洗3次无菌条件下，剥开花