第二次课第二章-DNA重组的克隆操作

2

DNA重组克隆的单元操作绝大多数分子克隆实验所使用的载体是DNA双链分子，其功能是：（1）为外源基因提供进入受体细胞的转移能力。（2）为外源基因提供在受体细胞中的复制能力或整合能力。（3）为外源基因提供在受体细胞中的扩增和表达能力。2.1DNA重组的载体基因工程载体必需具备的4个基本条件具有对受体细胞的可转移性或亲和性，以提高载体导入受体细胞的效率。具有与特定受体细胞相适应的复制位点或整合位点。具有多种单一限制性内切酶位点。具有合适的选择标记基因。2.1DNA重组的载体2.1DNA重组的载体2.1.1

质粒载体质粒（Plasmid）是一类存在于细菌和真菌细胞中能独立于染色体DNA而自主复制的共价、闭合、环状

DNA分子（CovalentlyClosedCircularDNA），也称为cccDNA，其大小通常在1-100kb范围内。2.1DNA重组的载体2.1.1质粒载体2.1.1.1质粒的基本特性1、自主复制性已知的绝大多数质粒都是双链闭合环状DNA分子。除了酵母的杀伤质粒是一种RNA分子外，其他已知的所有质粒无一例外地都是DNA分子。质粒DNA含有自己的复制起始位点（Origin，简称ori）以及控制复制频率的调控基因，有些质粒还携带特定的复制因子编码基因，形成一个独立的复制子结构（Replicon）。2、可扩增性3、不相容性严紧型质粒：在宿主细胞中的拷贝数较少，一般只有1～5个

松驰型质粒：其拷贝数较多，一般30～50个，多的可达200～300个。具有相同或相似复制子结构及调控模式的两种不同的质粒不能稳定地存在于同一受体细胞内，这种现象称为质粒的不相容性。在细胞增殖过程中，其中必有一种会被逐渐稀释、排斥掉。具有不同复制子结构的相容性质粒，尽管它们由于复制机制不同而造成各自的拷贝数有差异，但在细胞分裂时，每种质粒在两个子细胞中均可保持等同的拷贝数，因而它们可以稳定地存在于同一受体细胞中。

4、可转移性结合型质粒（conjugativeplasmid）又叫自我转移型质粒，其分子量一般都比较大，除携带自主复制所必需的遗传信息外，还带有一套控制细菌配对和质粒接合转移的基因，因此能从一个细胞自我转移到另一个细胞中。

非接合型质粒(nonconjugativeplasmid)又叫不能自我转移型质粒，其分子质量较小，虽然携带自主复制所必需的遗传信息，但不携带控制细菌配对和质粒接合转移的基因，因此不能从一个细胞自我转移到另一个细胞中。2.1.1.2质粒的改造与构建

（1）删除不必要的DNA区域，尽量缩小质粒的分子量，以提高外源DNA片段的装载量。大于20Kb的质粒很难导入受体细胞，而且极不稳定；（2）灭活某些质粒的编码基因，如促进质粒在细菌种间转移的mob基因，杜绝重组质粒扩散污染环境，保证DNA重组实验的安全，同时灭活那些对质粒复制产生负调控效应的基因，提高质粒的拷贝数；（3）加入易于识别的选择标记基因，最好是双重或多重标记，便于检测含有重组质粒的受体细胞；（4）在选择性标记基因内引入具有多种限制性内切酶识别及切割位点的DNA序列，即多克隆接头（Polylinker），便于多种外源基因的重组，同时删除重复的酶切位点，使其单一化，以便环状质粒分子经酶处理后，只在一处断裂，保证外源基因的准确插入；（5）根据外源基因克隆的不同要求，分别加装特殊的基因表达调控元件。理想质粒载体的必备条件1、具有较小的分子量和较高的拷贝数。2、具有若干限制性内切酶的单一酶切位点。3、具有两种以上的选择标记基因。4、缺失mob基因。5、插入外源基因的重组质粒较易导入宿主细胞并复制和表达。2.1.1.3常用的质粒载体（一）克隆质粒用于克隆和扩增外源基因。具有更小的分子量（2686bp）具有多克隆位点1、pBR322质粒及其派生质粒2、pUC系列质粒载体具有更高的拷贝数。可用组化方法筛选重组体，更方便、更省时。（二）测序质粒这类质粒通常高拷贝复制，并含有多酶切口的接头片段，便于各种DNA片段的克隆与扩增，在多酶切口接头片段的两端邻近区域，设有两个不同的引物序列，使得重组质粒经碱变性后，即可进行DNA测序反应，如pUC18/19系列；另一种测序质粒是M13噬菌体DNA与质粒DNA的杂合分子，如M13mp系列，它们在受体细胞中复制后，可以特定的单链DNA形式分泌到细胞外，克隆在这种质粒上的外源基因无需变性即可直接用于测序反应。（三）整合质粒含有整合酶编码基因以及整合特异性的位点序列，克隆在这种质粒上的外源基因进入受体细胞后，能准确地重组整合在受体细胞染色体DNA的特定位点上。（四）穿梭质粒这类质粒分子上含有两个亲缘关系不同的复制子结构以及相应的选择性标记基因，因此能在两种不同种属的受体细胞中复制并检测，如大肠杆菌链霉菌穿梭质粒、大肠杆菌酵母菌穿梭质粒等。克隆在此类质粒上的外源基因可以不用更换载体直接从一种受体菌转入另一种受体菌中复制并且遗传。

常见的有：大肠杆菌-土壤农杆菌穿梭质粒载体、大肠杆菌-枯草芽孢杆菌穿梭质粒载体、大肠杆菌-酿酒酵母穿梭质粒载体等。（五）探针质粒这类载体被设计用来筛选克隆基因的表达调控元件，如启动子和终止子等。它通常装有一个可以定量检测其表达程度的报告基因（如抗生素的抗性基因），但缺少相应的启动子或终止子，因此载体分子本身不能表达报告基因，只有当含有启动子或终止子的外源DNA片段插入到载体合适的位点上，报告基因才能表达，而且其表达量的大小直接反映了被克隆的基因表达控制元件的强弱。（六）表达质粒表达载体应含有：（1）强启动子。（2）SD序列。（3）强终止子。表达载体可分为非分泌型表达载体分泌型表达载体原核细胞表达载体真核细胞表达载体或2.1.1.4质粒的分离与纯化

碱溶法：（1）将菌体悬浮在含有EDTA的缓冲液中；（2）加入溶菌酶裂解细菌细胞壁；（3）加入SDSNaOH混合液，去膜释放细胞内含物；（4）加入高浓度的醋酸钾缓冲液沉淀染色体，去除染色体DNA及大部分蛋白质；（5）离心取上清液，用苯酚氯仿溶液处理，去除灭活痕量的蛋白质和核酸酶；（6）用乙醇或异丙醇沉淀水相的质粒；（7）用不含有DNase的RNase降解残余的RNA小分子。

用此法制备的质粒DNA纯度较高，制备规模可大可小，但操作繁琐耗时，且质粒DNA中存在着一定比例的开环结构。沸水浴法：（1）用牙签将生长在同体培养基上的菌体划取少许，悬浮在含有EDTA、TritonX100和溶菌酶的缓冲液中；（2）沸水浴中保温30-40秒钟；（3）常温离心，用牙签挑去沉淀物；（4）乙醇或异丙醇沉淀质粒DNA。

用此法制备的质粒DNA纯度不高，收率低且制备规模小，但速度快，一个工作日至少可处理200个克隆，而且抽出的质粒对酶切反应没有大的影响。特别适用于重组质粒的快速筛选与鉴定。上述两种方法分离得到的质粒DNA在琼脂糖凝胶电泳中均呈现多条带谱，这是由于质粒的空间结构不同所致。在正常的电泳条件下，各种结构的质粒DNA迁移率的相对大小顺序为：cccDNA＞L-DNA（线性）＞OC-DNA（单链断裂）＞D-DNA（二聚体）＞T-DNA（三聚体）。但经合适的限制性内切酶处理后，所有结构的质粒DNA都转化为直线型分子。从细菌中提取质粒的方法

从细菌中分离质粒DNA的方法都包括3个基本步骤：培养细菌使质粒扩增；收集和裂解细胞；分离和纯化质粒DNA。采用强碱液、加热可以破坏菌体细胞壁，十二烷基磺酸钠（SDS）和可使细胞膜裂解。经溶菌酶和SDS处理后，细菌染色体DNA会缠绕附着在细胞碎片上，同时由于细菌染色体DNA比质粒大得多，易受机械力和核酸酶等的作用而被切断成不同大小的线性片段。当用强热或酸、碱处理时，细菌的线性染色体DNA变性，而cccDNA的两条链不会相互分开，当外界条件恢复正常时，线状染色体DNA片段难以复性，而是与变性的蛋白质和细胞碎片缠绕在一起，而质粒DNA双链又恢复原状，重新形成天然的超螺旋分子，并以溶解状态存在于液相中。在细菌细胞内，共价闭环质粒以超螺旋形式存在。在提取质粒过程中，除了超螺旋DNA外，还会产生其它形式的质粒DNA。如果质粒DNA两条链中有一条链发生一处或多处断裂，分子就能旋转而消除链的张力，形成松弛型的环状分子，称开环DNA(OpencircularDNA，简称ocDNA）；如果质粒DNA的两条链在同一处断裂，则形成线状DNA(LinearDNA）。当提取的质粒DNA电泳时，同一质粒DNA其超螺旋形式的泳动速度要比开环和线状分子的泳动速度快。从细菌中分离质粒DNA的具体操作

材料、设备及试剂一、材料含PBS的E.coliDH5α或JM系列菌株，1.5ml塑料离心管（又称eppendorf管），离心管架。二、设备微量取液器（20μl，200μl，1000μl），台式高速离心机，恒温振荡摇床，高压蒸汽消毒（灭菌锅），涡旋振荡器，电泳仪，琼脂糖平板电泳装置和恒温水浴锅等。三、试剂

1、LB液体培养基（Luria-Bertani）：称取蛋白胨（Tryptone）10g，酵母提取物（Yeastextract）5g，NaCl10g，溶于800ml去离子水中，用NaOH调pH至7.5，加去离子水至总体积1升，高压下蒸气灭菌20分钟。

2、LB固体培养基：液体培养基中每升加12g琼脂粉，高压灭菌。

3、氨苄青霉素（Ampicillin，Amp）母液：配成50mg/ml水溶液，-20℃保存备用。

4、溶菌酶溶液：用10mmol/LTris·Cl（pH8.0）溶液配制成10mg/ml，并分装成小份（如1.5ml）保存于-20℃，每一小份一经使用后便予丢弃。

5、3mol/lNaAc（pH5.2）：50ml水中溶解40.81gNaAc·3H2O，用冰醋酸调pH至5.2，加水定容至100ml，分装后高压灭菌，储存于4℃冰箱。

6、溶液1:50mmol/L葡萄糖，25mmol/LTris.Cl（pH8.0），10mmol/LEDTA（pH8.0）。溶液Ⅰ可成批配制，每瓶100ml，高压灭菌15分钟，储存于4℃冰箱。

7、溶液Ⅱ：0.2mol/LNaOH（临用前用10mol/LNaOH母液稀释），1%SDS。

8、溶液Ⅲ：5mol/LKAc60ml，冰醋酸11.5ml，H2O28.5ml，定容至100ml，并高压灭菌。溶液终浓度为：K+3mol/L，Acˉ5mol/L。

9、RNA酶A母液：将RNA酶A溶于10mmol/LTris·Cl（pH7.5），15mmol/LNaCl中，配成10mg/ml的溶液，于100℃加热15分钟，使混有的DNA酶失活。冷却后用1.5mleppendorf管分装成小份保存于-20℃。

10、饱和酚：市售酚中含有醌等氧化物，这些产物可引起磷酸二酯键的断裂及导致RNA和DNA的交联，应在160℃用冷凝管进行重蒸。重蒸酚加入0.1%的8-羟基喹啉（作为抗氧化剂），并用等体积的0.5mol/LTris·Cl（pH8.0）和0.1mol/LTris·Cl（pH8.0）缓冲液反复抽提使之饱和并使其pH值达到7.6以上，因为酸性条件下DNA会分配于有机相。

11、氯仿：按氯仿：异戊醇=24：1体积比加入异戊醇。氯仿可使蛋白变性并有助于液相与有机相的分开，异戊醇则可起消除抽提过程中出现的泡沫。按体积/体积=1：1混合上述饱和酚与氯仿即得酚/氯仿（1:1）。酚和氯仿均有很强的腐蚀性，操作时应戴手套。

12、TE缓冲液：10mmo/LTris·Cl（pH8.0），1mmol/LEDTA（pH8.0）。高压灭菌后储存于4℃冰箱中。

13、STET：0.1mol/LNaCl，10mmol/LTris·Cl（pH8.0），10mmol/LEDTA（pH8.0），5%TritonX-100。

14、STE：0.1mol/LNaCl，10mmol/LTris·Cl（pH8.0），1mmol/LEDTA（pH8.0）。

15、电泳所用试剂：⑴TBE缓冲液（5×）：称取Tris54g，硼酸27.5g，并加入0.5MEDTA（pH8.0）20ml，定溶至1000ml。⑵上样缓冲液（6×）：0.25%溴酚蓝，40%（w/v）蔗糖水溶液。操作步骤

一、细菌的培养和收集将含有质粒pBS的DH5α菌种接种在LB固体培养基（含50μg/mlAmp）中，37℃培养12-24小时。用无菌牙签挑取单菌落接种到5mlLB液体培养基（含50μg/mlAmp）中，37℃振荡培养约12小时至对数生长后期。二、质粒DNA少量快速提取质粒DNA小量提取法对于从大量转化子中制备少量部分纯化的质粒DNA十分有用。这些方法共同特点是简便、快速，能同时处理大量试样，所得DNA有一定纯度，可满足限制酶切割、电泳分析的需要。（一）、煮沸法

1、将1.5ml培养液倒入eppendorf管中，4℃下12000g离心30秒。

2、弃上清，将管倒置于卫生纸上几分钟，使液体流尽。

3、将菌体沉淀悬浮于120mlSTET溶液中，涡旋混匀。

4、加入10ml新配制的溶菌酶溶液（10mg/ml），涡旋振荡3秒钟。

5、将eppendorf管放入沸水浴中，50秒后立即取出。

6、用微量离心机4℃下12000g离心10分钟。

7、用无菌牙签从eppendorf管中去除细菌碎片。

8、取20ml进行电泳检查。

[注意]1.对大肠杆菌可从固体培养基上挑取单个菌落直接进行煮沸法提取质粒DNA。2.煮沸法中添加溶菌酶有一定限度，浓度高时，细菌裂解效果反而不好。有时不同溶菌酶也能溶菌。3.提取的质粒DNA中会含有RNA，但RNA并不干扰进一步实验，如限制性内切酶消化，亚克隆及连接反应等。（二）、碱法

1、取1.5ml培养液倒入1.5mleppendorf管中，4℃下12000g离心30秒。

2、弃上清，将管倒置于卫生纸上数分钟，使液