第7章 脂类代谢与控制

第七章脂类代谢与控制代谢控制发酵课程授课教师：张侠E-mail：zhangxia79@概述脂类，也称脂质或类脂，是一类低溶于水而高溶于非极性溶剂的生物有机分子。对大多数脂类而言，其化学本质是脂肪酸和醇所形成的酯类及其衍生物。参与脂类组成的脂肪酸多是4碳以上的长链一元羧酸，醇成分包括甘油（丙三醇）、鞘胺醇、高级一元醇和固醇。脂类元素组成主要是碳、氢、氧，有些含有氮、磷及硫等。第一节脂类的代谢与调节一、脂肪酸的分解（β-氧化作用）1904年，FranzKnoop将末端碳连有苯基的一些奇数碳和偶数碳脂肪酸衍生物喂狗，然后分离狗尿中的苯化合物。Knoop发现，当奇数碳脂肪酸衍生物被降解时，尿中检测出的是马尿酸（苯甲酸和甘氨酸的结合物）；如果是偶数碳，则尿中排出的是苯乙尿酸（苯乙酸和甘氨酸的结合物）。因此Knoop认为，脂肪酸的氧化发生在β-碳原子上，即每次从脂肪酸链上降解下来的是2碳单位，也就是后来所谓的脂肪酸β-氧化。

细胞内脂肪酸的降解过程可以分为3个阶段：⑴脂肪酸在细胞质中活化为脂酰CoA；⑵脂酰CoA通过转运系统进入线粒体基质；⑶以2碳单位降解——β-氧化。1、脂肪酸的活化

长链脂肪酸氧化前必须进行活化，活化在线粒体外进行（原核生物在细胞溶胶中进行），脂肪酸先与CoA形成硫酯键。胞液中的脂肪酸可以在脂酰CoA合成酶的催化下，与乙酰CoA酯化，生成脂酰CoA。细胞中有4种不同的脂酰CoA合成酶，它们分别对带有短的（<C6）、中等长度的（C6～12）、长的（>C12）和更长的（>C16）碳链的脂肪酸具有催化的特异性。

2、脂肪酸转入线粒体

——肉毒碱（carnitine）穿梭机制肉毒碱穿梭机制包括以下步骤：⑴在脂酰肉毒碱转移酶I（carnitineacyltransferaseI，CATI）催化下，脂酰CoA中的脂酰基转移到L-肉毒碱上，形成脂酰肉毒碱。⑵脂酰肉毒碱在肉毒碱：脂酰肉毒碱转运酶的作用下，与游离的肉毒碱交换后进入线粒体基质。⑶在线粒体基质中，脂酰肉毒碱在与膜结合的脂酰肉毒碱转移酶II（CATII是CATI的同功酶）的催化下，重新生成脂酰CoA和肉毒碱（CATI催化反应的逆反应）。

3、脂肪酸的β-氧化

脂肪酸的β-氧化发生于线粒体中，脂酰CoA氧化生成乙酰CoA涉及4个基本反应：第一次氧化反应（oxidation）；水化反应（hydration）；第二次氧化反应（oxidation）；硫解反应（cleavage）。

4、脂肪酸的其他氧化分解方式奇数碳链脂肪酸的分解氧化产生n-1个乙酰CoA和1个丙酰CoA，丙酰CoA与ATP、CO2反应，生成甲基丙二酸单酰CoA，经分子重排成琥珀酰CoA，进入TCA循环。脂肪酸的ω-氧化脂肪酸ω位的碳原子首先氧化，生成二羧酸，再通过β-氧化作用脱下二碳化合物。

5、能量代谢脂肪酸代谢的能量产生分为三个阶段：长链脂肪酸经β-氧化降解为乙酰基（乙酰CoA）。乙酰基经柠檬酸循环氧化为CO2。前面两个阶段产生的NADH和FADH2经呼吸链氧化，合成ATP。二、脂肪酸的生物合成对微生物、动植物细胞合成脂肪酸的研究证明，脂肪酸的合成并不是脂肪酸β-氧化的逆反应，而是通过另外的途径合成。在脂肪酸β氧化途径中，中间产物都是辅酶A（CoASH）的衍生物；在脂肪酸的生物合成途径中，则都是酰基载体蛋白（ACP）的衍生物。这是两者之间的根本性区别。ACP：不同生物体中的ACP十分相似，E.coli中的ACP是一个由77个aa组成的热稳定蛋白质，在第36位Ser的侧链上，连有辅基4‘-磷酸泛酰巯基乙胺。脂肪酸的生物合成是在细胞液中进行，需要CO2和柠檬酸参加；而氧化降解是在线粒体中进行的。真核生物中脂肪酸的生物合成包括三个过程：⑴乙酰CoA的转运（柠檬酸转运系统）。⑵丙二酸单酰CoA的生成。⑶脂肪酸的合成。1、乙酰CoA的转运（柠檬酸转运系统）由糖代谢产生的乙酰CoA可以通过柠檬酸转运系统，从线粒体转运到胞质中，供给脂肪酸的合成。首先在柠檬酸合成酶催化下，线粒体中的乙酰CoA和草酰乙酸缩合形成柠檬酸。生成的柠檬酸经柠檬酸——二羧酸载体转运出线粒体。进入到胞液内的柠檬酸经柠檬酸裂解酶催化，裂解生成乙酰CoA和草酰乙酸，裂解反应需要CoA-SH和消耗ATP。柠檬酸裂解生成的草酰乙酸在细胞质中的苹果酸脱氢酶催化下还原为苹果酸，同时NADH氧化为NAD＋。苹果酸在苹果酸酶催化下脱羧生成丙酮酸，NADP＋还原为NADPH。2、丙二酸单酰CoA的生成

细胞质中的乙酰CoA在乙酰CoA羧化酶催化下羧化，形成丙二酸单酰CoA。乙酰CoA羧化酶的辅基是生物素，其反应机理类似丙酮酸羧化酶。3、脂肪酸的合成脂肪酸的合成是在脂肪酸合成酶复合体的作用下完成的。E.coli的脂肪酸合成酶复合体包含7种酶，而哺乳动物的脂肪酸合成酶只有一条肽链，但具有多种催化活性。另外，脂肪酸的合成还需要酰基载体蛋白（ACP：acylcarrierprotein）来转移酰基基团。

包括5个反应步骤：前体负载，前体缩合，还原，脱水和进一步还原。⑴负载乙酰CoA在乙酰CoA-ACP转酰基酶的催化下，将其乙酰基转移到ACP上，形成乙酰-ACP。丙二酸单酰CoA在丙二酸单酰-ACP转酰基酶的催化下，将丙二酸单酰基转移到ACP上，形成丙二酸单酰-ACP。E.Coli中脂肪酸的合成⑵缩合酮酰基-ACP合成酶接受乙酰-ACP的乙酰基，释放HS-ACP。酮酰基-ACP合成酶催化乙酰基转移到丙二酸单酰-ACP上，形成乙酰乙酰-ACP，并释放一分子CO2。⑶还原在酮酰基－ACP还原酶催化下，乙酰乙酰-ACP中的b-酮基被NADPH＋H＋还原为醇，形成D-b-羟丁酰-ACP。⑷脱水在b-羟酰基-ACP脱水酶的催化下，D-b-羟丁酰-ACP脱水，生成带有双键的反式丁烯酰-ACP。⑸还原烯酰基-ACP还原酶催化反式丁烯酰-ACP还原为丁酰-ACP，NADPH为辅酶。4、脂肪酸β-氧化和合成的主要区别从上述脂肪酸合成途径可以看出，脂肪酸合成和降解是通过完全不同的两条途径进行的。下表归纳了软脂酸β-氧化和合成的主要区别。为增加脂肪酸生物合成，可从以下几方面考虑：⑴选育乙酰-CoA羧化酶活力强的菌株，设法解除终产物（脂酰CoA及脂肪酸）的反馈抑制。选育抗代谢产物结构类似物突变株（抗脂肪酸结构类似物），即抗反馈调节突变株。选育营养缺陷型的回复突变株或选育条件突变株，解除微生物细胞正常的自我调节，使脂肪酸得以积累。三、脂肪酸生物合成的代谢控制育种⑵选育易生成并大量积累柠檬酸的菌株或有利于柠檬酸合成而不利于柠檬酸降解的突变株。⑶选育丧失或只具有微弱柠檬酸脱氢酶活力的突变株。如异柠檬酸脱氢酶的渗漏突变株等。第二节多不饱和脂肪酸发酵

的代谢控制育种多不饱和脂肪酸（polyunsaturatedfattyacids,PUFAs）是指含2个或2个以上双键且碳原子数为16～22的直链脂肪酸，包括γ-亚麻酸、花生四烯酸、二十碳五烯酸（EPA）、二十二碳六烯酸（DHA）等。由于多不饱和脂肪酸可广泛用于医药、食品、化妆品、饲料等领域，因此世界各国开展了多饱和脂肪酸的微生物育种、发酵提取工艺以及发酵动力学等方面的研究。多不饱和脂肪酸的自然来源主要是动植物，但含量最丰富的是微生物，特别是藻类、真菌、细菌等，且主要以储存油和膜脂的形式存在，尤其是ω-3多不饱和脂肪酸。藻类、真菌、细菌拥有重新合成多种ω-3多不饱和脂肪酸所需的系列脱饱和酶和连接酶，它们是自然界中这些化合物的初始生产者，而高等植物和动物则很少含有ω-3多不饱和脂肪酸。目前商业上ω-3多不饱和脂肪酸主要是从深海鱼油中提取，工艺复杂、成本高、稳定性差，还受气候条件和资源的限制。微生物具有适应性强、生长繁殖迅速、生长周期短、易培养、不受原料产地限制等特点，所以利用微生物生产多不饱和脂肪酸是一条重要途径。目前，日本、英国等国家已先后问世了γ-亚麻酸、双高γ-亚麻酸、花生四烯酸等发酵产品，而EPA、DHA等仍处于研究阶段。一、γ-亚麻酸发酵的代谢控制育种1919年德国的药理学家Hei-duschKa博士从月见草中发现与亚油酸相似的高级多不饱和脂肪酸，被命名为γ-亚麻酸。γ-亚麻酸是人体内所必需的必需脂肪酸。如果人体一旦缺乏了必需脂肪酸，心脑血管、生殖、内分泌等系统就会出现异常，发生紊乱，从而引起高血脂，高血压，血栓病、动脉粥样硬化、糖尿病、加速衰老等一系列疾病，γ-亚麻酸特别对脑组织的生长发育至关重要。当γ-亚麻酸的生物活性含量达到15%以上，就能起到显著的药理治疗作用。由此可见，γ-亚麻酸是人类的生命之宝。从植物中提取γ-亚麻酸受到诸多因素的限制，植物生长周期长，种子采集较难，油含量不稳定，难以满足人们日益增长的需求。1948年，Bernhard和Alberch首次从布拉克须霉的菌体脂肪中鉴定出含有γ-亚麻酸，揭开了微生物发酵γ-亚麻酸的序幕，大量的研究随之展开。γ－亚麻酸（GLA）为全顺式6，9，12－十八碳三烯酸，非共轭立体构型，分子式为C18H30O2，由于其高度的不饱和性在空气中不稳定，在碱性条件下易发生双键位置及构型的异构化反应，形成共轭多烯酸。㈠发酵法生产γ－亚麻酸的菌种目前发现能积累γ－亚麻酸的微生物主要是一些真菌和微藻，其中真菌研究较多的有被孢霉属、毛霉属、枝酶属、根霉属等；藻类的研究主要集中在螺旋藻。藻类的培养受外界条件的影响较大，生产多不饱和脂肪酸有一定难度，真菌在自然界分别广且易培养，目前利用真菌发酵生产γ－亚麻酸已成为国内外研究热点。丝状真菌利用葡萄糖合成γ-亚麻酸的代谢途径如下图所示。从图中可以看出，γ-亚麻酸的生物合成机制比较复杂，从葡萄糖到γ-亚麻酸需涉及20多步酶促反应。关于其代谢调节机制，目前尚不清楚。㈡γ-亚麻酸的代谢途径分析脂肪酸合成的前体物质，一是乙酰CoA，为脂肪酸的合成提供碳骨架；二是NADPH，为脂肪酸的合成提供还原力。NADPH主要由胞质转氢酶循环产生，限速酶为苹果酸酶。当苹果酸酶的活性受到抑制或者表达上被削弱时，胞质中的NADPH将减少，脂肪酸的合成也将随之减少。因此，胞内NADPH与乙酰CoA的水平对微生物合成GLA至关重要。㈢γ-亚麻酸产生菌的育种思路可归纳如下：根据上述育种思路，要选育γ-亚麻酸高产菌株，可以从以下几方面着手：1、出发菌株的选择γ-亚麻酸产生菌多采用被孢霉（Mortierella）、毛霉（Mucor）、红酵母（Rhodotorula）、小克银汉霉（Cunninghamella）等产油脂较高的真菌作为出发菌株。诱变育种及其筛选方法目前，用于产GLA微生物诱变的方法主要有物理诱变和化学诱变，物理诱变包括：紫外诱变、激光诱变、低能Ｎ＋离子注入等；常用的化学诱变方法有：硫酸二乙酯、亚硝基胍、氯化锂和亚硝酸盐诱变等。然而，产生正突变的概率通常较小，因此需要一种简单易行的筛选方法不仅可以减轻工作量，还可以提高筛选效率，减小盲目性。苏丹黑染色法筛选：其原理是菌体用苏丹黑染色后，油脂被染成蓝黑色，原生质为淡红色，在显微镜下观察菌体的颜色，蓝黑色深者说明菌体内的油脂含量较多。于爱群等利用苏丹黑染色法筛选获得１株GLA产生菌EM10，通过摇瓶培养，其生物量达11.882g\L，菌丝体油脂含量达18.86％，进一步鉴定该菌株，表明该菌为毛霉属。刘阳等通过紫外-硫酸二乙酯复合诱变深黄被孢霉AS3.3410，用苏丹黑染色初筛，得到突变株H3.3410-5，其GLA含量较原始菌株提高了14.4％。2、切断或减弱支路代谢通过切断或减弱非γ-亚麻酸生物合成的支路代谢，使更多的磷酸烯醇式丙酮酸、乙酰CoA、亚油酸生成γ-亚油酸，从而提高γ-亚油酸的产量。据报道，采用α-亚油酸缺陷型、花生四烯酸缺陷型、二十碳五烯酸缺陷型，均有助于γ-亚油酸产量的提高。另外，选育花生四烯酸渗漏、二十碳五烯酸渗漏突变株，也可使γ-亚麻酸的产量得到提高。3、解除反馈调节选育脂肪酸结构类似物抗性突变株（如LTBr）、耐高浓度γ-亚麻酸突变株，均能不同程度地解除γ-亚麻酸的反馈调节机制，使得代谢更加流畅，从而提高γ-亚麻酸的产量。4、强化能量代谢提高菌体细胞内ATP的水平，有利于脂肪酸的合成。因此，选育呼吸抑制剂（丙二酸、氰化钾、亚砷酸等）抗性突变株、ADP磷酸化抑制剂（羟胺、2,4-二硝基酚等）抗性突变株、抑制能量代谢的抗生素（寡霉素、缬氨霉素等）抗性突变株，均有助于γ-亚麻酸产量的提高。5、增加前体物的合成菌体生物合成γ-亚麻酸与HMP、EMP途径直接相关。增加HMP途径，NADPH的数量增多，有利于γ-亚麻酸产量的提高。选育异柠檬酸脱氢酶渗漏突变株，也有利于γ-亚麻酸产量的提高。6、选育Δ6-脱氢酶活力强的突变株Δ6-脱氢酶是生物合成γ-亚麻酸的关键酶之一，其活性的高低直接与γ-亚麻酸含量的高低密切相关，可采用TTC酶活测定法来反映Δ6-脱氢酶的活性。TTC为一种无色的氧化还原剂，能被Δ6-脱氢酶还原成红色的物质，红色越深，表明菌体细胞内的Δ6-脱氢酶活力越强，γ-亚麻酸的积累量也就越多。7、选育低温生长突变株细胞膜是重要的微生物细胞表面结构，由脂质和蛋白质组成。脂质分子中不饱和脂肪酸的含量越高，其在低温下细胞膜的流动性也就越大，即微生物细胞生长的温度就越低。据报道，选育在相对低温（15℃）条件下生长良好的突变株，其γ-亚麻酸的产量提高1.4倍。8、选育耐高糖的突变株在代谢控制发酵中，常采用耐高渗透压突变株。γ-亚麻酸发酵与培养基中糖浓度有密切关系，在一定范围内，γ-亚麻酸的产量随糖浓度的增加而增加，但糖浓度过高就会抑制菌体生长，降低产物的积累。因此，通过选育耐高糖的突变株，可使菌体高效率地利用葡萄糖，从而提高γ-亚麻酸的产量。9、基因工程育种通过基因工程手段改造γ-亚麻酸生产菌，能大幅度提高菌种的γ-亚麻酸合成能力。Huang等从高山被孢霉中克隆得到Δ12和Δ6去饱和酶编码基因的cDNA序列，并将它们分别克隆至啤酒酵母中。当表达Δ12去饱和酶时，以油酸为底物，发酵终点时其亚油酸的含量达到了25％，当表达Δ6去饱和酶时，以亚麻酸为底物，其发酵产物GLA含量为10％。当共同表达这两个酶，在不添加前体脂肪酸的条件下，GLA的含量也能达到8％。二、花生四烯酸发酵的代谢控制育种花生四烯酸(简称AA)属人体不可缺少的多不饱和脂肪酸，作为合成人体前列腺素、凝血噁烷以及白三烯的前体物质，具有广泛的生物活性，特别对婴幼儿的脑和神经发育有重要影响，对人体心血管系统和免疫系统具有重要的调节作用。动物组织中花生四烯酸的质量分数很低，约为0.2%，且来源非常有限；利用微生物发酵法是生产花生四烯酸的新途径。利用腐霉(Pythium)通过发酵法生产的花生四烯酸(美国Martek生物科学公司)在1995年已获得荷兰健康部法规办公室的安全认可，1996年获得英国毒理委员会的安全认可，对于食品工业的研究有重要价值，因此从腐霉属及近缘属中寻找有价值的菌株是一个十分有希望的方向。目前对腐霉的育种研究较少，花生四烯酸生产菌的诱变育种局限于被孢霉属的少数真菌。花生四烯酸又称全顺-5,8,11,14-二十碳四烯酸，其分子式为C20H32O2，结构式为：花生四烯酸的生物合成途径，即葡萄糖通过脂肪酸的生物合成途径，先合成硬脂酸，硬脂酸经脱氢酶作用生成油酸，油酸进一步脱氢生成亚油酸。由亚油酸分出2个分支，一方面通过去饱和作用生成α-亚麻酸，另一方面在Δ6-脱氢酶的作用下生成γ-亚麻酸。γ-亚麻酸通过延长碳链生成二高γ-亚麻酸，二高γ-亚麻酸再在Δ5-脱饱和酶作用下生成花生四烯酸。选育花生四烯酸高产菌，可从以下几方面着手。1、出发菌株的选择花生四烯酸产生菌多采用耳霉属（Conidiobolus）、被孢霉属（Mortierella）、毛霉属（Mucor）和根霉属（Rhizopus）等产油脂较多的真菌作为出发菌株。2、切断或减弱支路代谢选育α-亚麻酸缺陷型、二十碳五烯酸缺陷型、DHA缺陷型、前列腺素缺陷突变株，或者选育DHA渗漏、α-亚麻酸渗漏及前列腺素渗漏突变株，均有利于花生四烯酸的