基因工程制备胰岛素2

基因工程制备胰岛素一、 胰岛素的定义胰岛素是由胰岛B细胞受内源性或外源性物质如葡萄糖、乳糖、核糖、精氨酸等的刺激而分泌的一种蛋白质激素。二、 目前临床使用的胰岛素来源1、 动物胰岛素：从猪和牛的胰腺中提取，两者药效相同，但与人胰岛素相比，猪胰岛素中有1个氨基酸不同，牛胰岛素中有3个氨基酸不同，因而易产生抗体。2、 半合成人胰岛素：将猪胰岛素第30位丙氨酸，置换成与人胰岛素相同的苏氨酸，即为半合成人胰岛素。3、 重组人胰岛素(现阶段临床最常使用的胰岛素)：利用生物工程技术，获得的高纯度的生物合成人胰岛素，其氨基酸排列顺序及生物活性与人体本身的胰岛素完全相同。三、 目前，国际上生产医用重组人胰岛素(recombi—nanthumaninsulin,rhl)的方法。1、 用基因工程大肠杆菌escherichiacoli,E.CO—)分别发酵生产人胰岛素(humaninsulin,hi)的A、B链，然后经化学再氧化法，使两条链在一定条件下重新形成二硫键，得到hl。这一方法缺点较多，目前己较少使用；2、 用基因工程E.coli发酵生产人胰岛素原(hu—manpeoinsulin,hPI),后经加工形成h"E.coli系统表达量高，但缺点是不利于表达hl这样的小蛋白，产物易降解，故常采用融和蛋白形式将hPI连接在一个较大的蛋白质后，表达产物需经过一系列复杂的后加工才能形成有活性的hi；3、通过基因工程酵母菌发酵生产hPI,经后加工形成hlO酵母系统下游后加工比细菌表这系统简单，但缺点是生产慢，生产周期长，旦重组蛋白分泌量少(150mg/L),产量低。因此，虽然rhl投放市场巳久，但人们一直在努力寻求和探索更加有效的表达系统和高效的表达策略12J,尤其是对CO一尻表达系统的研究更是越来越深入，用E.coli系统表达hPI的策略也越来越多。另一方面，在胰岛素的基因工程生产中，下游处理非常复杂，复杂的卜,游处理极大地降低了胰岛素的最终收率。本研究围绕着提高重组目的蛋白表达量，简化卜游处理过程等方面进行探索，建立了一套经过优化的高效完整的基因工程E.coli发酵表达(His)6ArgArg一人胰岛素原[(His)6ArgArghumanproinsulinPPhPI],后加工成hl的制备工艺。四、基因工程制备胰岛素1、提取目的基因：既从人的DNA中提取胰岛素基因，可■使用限制性内切酶将目的基因从原DNA中分离。主要有如下4种方法：(1)鸟枪法：用一大堆限制性核酸内切酶对附近基因进行剪切，再提取所需要的。至于如何筛选，用DNA分子杂交，即DNA探针(2)人工合成法：根据转录蛋白或者mRNA推导出基因序列，然后人工合成，没有内含子。(3)从基因文库中提取：也就是事先已经提取完毕的拿来用(4)PCR扩增技术：用于大量生产该段基因片段，用于商业化运作2、提取质粒：使用细胞工程/培养大肠杆菌，从大肠杆菌的细胞质中提取质粒，质粒为环状。主要有如下2种方法：(1)碱裂解法：此方法适用于小量质粒DNA的提取，提取的质粒DNA可直接用于酶切、PCR扩增、银染序列分析。（2）煮沸法3、基因重组：取出目的基因与质粒，先利用同种限制性内切酶将质粒切开，再使用DNA连接酶将目的基因与质粒“缝合”,形成一个能表达出胰岛素的DNA质粒。4、将质粒送回大肠杆菌：再大肠杆菌的培养液中加入含有Ca+的物质，如CaCl2,这使细胞会吸收外源基因，此时将重组的质粒也放入培养液中，大肠杆菌便会将重组质粒吸收。将大肠杆菌用氯化钙处理，以增大大肠杆菌细胞壁的通透性，使含有目的基因的重组质粒能够进入受体细胞，此时的细胞处于感受态（理化方法诱导细胞，使其处于最适摄取和容纳外来DNA的生理状态）O5、胰岛素的产生：再大肠杆菌内，质粒通过表达转录与翻译后，便产生出胰岛素蛋白质。通过大肠杆菌的大量繁衍，便可大量生产出胰岛素。（注意：大肠杆菌产出的是多肽链，因为原核生物没有内质网、高尔基体等，不能进行多肽的折叠、修饰等，还需人为进行菌体外加工。）五、关于胰岛素制备的一些问题人体是这么产生胰岛素的？第11对染色体短臂上胰岛素基因区DNA向mRNA转录，mRNA从细胞核移向细胞浆的内质网，转译成由105个氨基酸残基构成的前胰岛素原。前胰岛素原经过蛋白水解作用除其前肽，生成86个氨基酸组成的长肽链胰岛素原(Proinsulin)O胰岛素原随细胞浆中的微泡进入高尔基体，连接上二硫键，经蛋白水解酶的作用，切去31、32、60三个精氨酸连接的链，断链生成没有作用的C肽，形成a链和链的胰岛素，分泌到B细胞外，进入血液循环中。大肠杆菌没有高尔基体等细胞器，基因工程如何利用大肠杆菌合成胰岛素？《微生物学教程》(周德庆)1978年美国的2个实验室合作，通过基因工程使E.coli合成了人胰岛素。在实验室中将人胰岛素基因A、B链的人工合成基因分别组合到E.coli的不同质粒上，然后再移至菌体内，着种重组质粒在E.coli细胞内进行正常的复制和表达，从而使带有A、B链基因的工程菌株分别产生人胰岛素A、B链，然后再用人工的方法，在体外通过二硫键使这2条链连接成有活性的人胰岛素。所以大肠杆菌产生的胰岛素，需要用人工的方法，在体外通过二硫键使这2条链连接成有活性的人胰岛素。大肠杆菌是原核生物，细胞器只有线粒体，但它有相关的酶在细胞质内。和蓝藻进行光合作用一样，蓝藻也没有叶绿体，但它可以合成相关的酶。因此，只需要细胞质就可以了！1、合成胰岛素需要高尔基体和线粒体是对人或真核生物而言2、原核生物的生长和发育也需要蛋白质，从哪里来的呢？当然是自身合成，这说明原核生物合成蛋白质只需要线粒体和一些酶，当然还有能量人体产生胰岛素首先是一个基因转录成一个mRNA,再翻译为一条肽链，这条肽链再加工，就形成了由二硫键连接的2条肽链。通过基因工程在E.coli产生胰岛素是先分别形成A、B链的2个基因，转录形成2个mRNA,翻译成2条肽链，在E.coli外通过二硫键使这2条链连接成有活性的人胰岛素。六、胰岛素的研究历史胰岛素的发现是20世纪生物医学界最为重大的成就之一。同时胰岛素的问世也引起了许多科学家的兴趣。他们对胰岛素的生产、生物合成、化学合成、结构、功能、作用机制等进行了一系列的研究并获得了多个里程碑式的成果。动物胰岛素的生产起始于加拿大的ConnaughtLaboratories，大量生产主要在美国的礼来(EliLilly)公司。1923年末商品胰岛素己广泛应用于临床。我国动物胰岛素的生产起步也不晚。解放前，上海的杨氏药厂己能生产结晶猪胰岛素。解放后，国内的生产厂家主要是上海生化药厂和徐州生化药厂。为了使胰岛素能就地取材，就地生产，最好不用减压蒸发去乙醇。为此，南京和上海分别试用了离子交换法和锌沉淀法。1978年美国的2个实验室合作，通过基因工程使E.coli合成了人胰岛素。在实验室中将人胰岛素基因A、B链的人工合成基因分别组合到E.coli的不同质粒上，然后再移至菌体内，着种重组质粒在E.coli细胞内进行正常的复制和表达，从而使带有A、B链基因的工程菌株分别产生人胰岛素A、B链，然后再用人工的方法，在体外通过二硫键使这2条链连接成有活性的人胰岛素。随着科学技术的发展，现在科学家己经改为用酵母菌、昆虫培养细胞、或哺乳动物培养细胞等真核细胞作为表达载体，而少用大肠杆菌。重组DNA技术的出现为利用微生物生产人胰岛素铺平了道路。1979年，美国Genentech公司的Goedell等报道了化学合成的人胰岛素基因在大肠杆菌中的表达。1982年，美国礼来公司生产的重组人胰岛素Humulin上市。为改进重组人胰岛素的生产，丹麦的诺和诺德(NovoNordisk)公司用酿酒酵母真核细胞表达一种胰岛素单链前体，在前体中B1至B29通过甘甘赖三肽和A1至A21相连接。近年来，国产的重组人胰岛素相继问世。通化东宝公司于1998年获准生产人胰岛素注射液，商品名甘舒霖。深圳科兴公司的苏泌嘛和徐州万邦公司的万邦林也于2002年和2003年获得生产批文。虽然重组人胰岛素己在临床上广泛应用，但是由于胰岛素分子容易聚合，在浓度较高的胰岛素注射液中主要以二体和六体的形式存在。为了解决这个问题，通过蛋白质工程开发出的单体速效胰岛素也应运而生。首先，美国的礼来公司开发了单体胰岛素Humalog其中B28位的脯氨酸和B29位的赖氨酸互换。随后，丹麦的诺和诺德公司也开发了单体胰岛素Novorapid其中B28位的脯氨酸突变成天冬氨酸。1972年，前苏联的生物化学杂志上报道了胰岛素用胃蛋白酶水解去除B26至B30的肽段后可以得到保留胰岛素活性的去五肽胰岛素。由于胰岛素对治疗糖尿病的重要作用，关于胰岛素的品种、剂型、生产方法等的报道口新月异、层出不穷。七、胰岛素的展望胰岛素是由胰产生的一种蛋白。它在人体新陈代谢中起着重要作用，如果体内不足就会引发糖尿病，因此胰岛素是治疗糖尿病的特效药。这种病发病率很高，困扰着上千万人。过去从猪、