《毒理实验》全册配套教学课件2

《毒理实验》全册配套教学课件2实验一小鼠经口急性毒性试验一、实验目的1.学习外源化学物急性毒性试验的设计原则，了解实验基本程序；2.掌握小鼠经口灌胃技术；3.掌握计算LD50的方法。二、急性毒性试验原理

动物一次或24h内多次接触外源化学物后，观察急性毒性反应及其程度，中毒死亡的原因及特征，了解受试动物毒性反应的剂量－反应关系，求出LD50。三、实验试剂和材料1.药物与试剂

盐酸二甲硝咪唑、苦味酸酒精饱和溶液和中性红溶液、记号笔2.设备与器械吸管、烧杯、灌胃器、电子天平（感量0.1g）、外科手术剪、5mL注射器、10mL注射器、干棉球3.实验动物

成年健康小鼠，18-22g，雌雄各半四、实验步骤1.剂量选择：查阅文献，估计预期毒性中值；预试验，求出受试化学物的0～100%或10～90%大致致死范围，设计正式试验的剂量和分组。

盐酸二甲硝咪唑绝对致死剂量2500mg/kg，最低中毒剂量为800mg/kg

2.实验动物的标记和分组

染色法，苦味酸酒精饱和溶液和中性红溶液分组，采用随机法3.受试物的配制（1）溶剂的选择：选择原则是不与受试物反应，最常用的溶剂为水。助悬剂：淀粉液、明胶液等；助溶剂：吐温80、吐温60、聚乙二醇等。（2）配制方法的选择：等浓度稀释法和等容量稀释法。等浓度稀释法：将受试化学物配制成一种浓度，不同剂量组实验动物单位体重所给受试化学物的体积不同，剂量越高，所用的体积越大；剂量越低，所用的体积越小。等容量稀释法将受试化学物配制成不同浓度，不同剂量组实验动物单位体重所给受试化学物的体积相同，剂量越大，受试化学物配制的浓度越高。为避免操作误差，等容量稀释的传统方法常用1︰K系列稀释法（K=各组剂量比值）。根据实验设计要求确定最高剂量组所需受试化学物的浓度和总体积，配制母液。（3）等容量稀释法配制6个剂量组的染毒溶液求母液浓度C1绝对致死剂量为2500mg/kg，最低中毒剂量为800mg/kg，每10g体重小鼠灌胃0.2mLC1=2500mg/kg×10g/0.2mL＝125mg/mL求公比r

√ba6-1√2500800=1.25r一般为1.2-1.5n为组数r==n-1式中，K：各组剂量的比值，K＝1/r。取母液mmL置一容器中，供最高剂量组染毒用；加入mmL溶剂，稀释后的浓度为C2，C1︰C2＝1︰K，取出mmL供第二组动物染毒用；再加入mmL溶剂，稀释后的浓度为C3，C2︰C3＝1︰K，取出mmL供第三组动物染毒用。依次类推，配制其它不同剂量组的试液。设：母液浓度为C1，各组所需要的量为mmL，母液应配制的总量M为：各组剂量比值K＝1/r＝0.8母液总量：M＝m/(1-K)＝10/(1-0.8)=50mL受试化学物的质量为：125mg/mL×50mL＝6.25g求母液应配制的总量称取盐酸二甲硝咪唑6.25g，用生理盐水或蒸馏水将药物溶解并稀释至50mL，即为母液(母液浓度为125mg/mL)；从母液中取10mL供第1组动物染毒；在剩下的母液中加入10mL溶剂，稀释后取10mL供第2组染毒；依次类推，配制其它不同剂量组的试液。药物溶液的配制4.灌胃给药（1）动物的禁食和复食：灌胃前禁食6～10h，使动物保持空腹状态，且不至因禁食时间过长影响肝脏，进而影响实验结果。灌胃后至少2～3h后才能复食，灌服油剂比水剂要求复食时间更长；（2）灌胃体积：小鼠每10g体重灌胃0.1～0.2mL，最多不超过0.4mL。小鼠灌胃量的极限是0.5～1mL；（3）灌胃方法和注意事项。小鼠经口灌胃给药方法保定动物：用右手将小鼠尾巴提起，置于鼠笼或粗糙的平面上，当小鼠向前挣扎时，用左手的拇指和食指捏住小鼠两耳后颈背皮肤，翻转小鼠置于掌心，拉直后肢，以小指压住小鼠尾巴即可。在保定小鼠过程中，不要用力过大，勿握其颈部，以免窒息死亡。小鼠的捉拿、固定小鼠的捉拿法小鼠经口灌胃给药方法

给药：以灌胃器轻轻压其头部，使口腔与食道成一条直线;再将灌胃针沿上腭壁轻轻进入食道;当灌胃针进入约3cm左右时即达胃内。

小鼠灌胃法如果灌胃针的位置插入正确，小鼠可自行吞服药；灌胃针插入位置不正确，小鼠会强烈挣扎，必须拔出重插，否则可能将药物灌入气管，造成小鼠死亡；注完药液后轻轻抽出灌胃针；小鼠一次最大灌胃量为：0.4ml/10g.bw。灌胃时的注意事项注意事项保定时：一定要固定好动物，使动物头不要随意摆动，但不能挤捏颈部。灌胃器针头弧度面向前从动物右嘴角处插入，灌胃动作要轻柔。不能虐待动物，尤其是大鼠，否则，容易被其咬伤。插入灌胃针时，如果遇到阻力，不能用力继续进针，应停止进针，等待其自动吞咽时，迅速进针。否则，容易损伤动物食道。5.中毒症状观察和结果记录染毒后认真观察中毒发生、发展过程，中毒反应的特点和毒作用靶器官。准确结果：观察24h。观察指标（1）中毒症状

对于了解受试化学物的急性毒性特征及该化合物毒性作用的靶器官非常重要；临床中毒反应和死亡时间可为中毒机制提供线索；

神经毒性：染毒后立即惊厥、共济失调等；

迟发性死亡：化合物有肝、肾毒性；

植物神经兴奋：腹泻、竖毛等；

可能的中毒表现：

兴奋，活动增加、骚动、窜跑、跳跃、呼吸加深加快；

抑制，活动减少、呆立、静卧、步态不稳、呼吸困难等；

刺激症状：搔鼻、尖叫、出汗、流涎、眼耳鼻等的出血。观察指标（2）体重观察期间的体重变化可以反映动物中毒后的整体变化，应3-5天测量一次；

体重减轻：可能是动物食欲下降、摄食量减少；也可能是化合物干扰代谢系统，影响食物吸收、利用；

体重增加：低水平的化学毒物促进动物生长，动物体重增长率大于对照组。观察指标（3）死亡数和死亡时间

十分重要的中毒机理研究信息；重点观察和记录各个剂量组动物的死亡数；每只动物死亡的时间（尤其是最早出现死亡的时间）。

观察指标（4）病理学检查及其他指标

及时剖检：对死亡动物的主要脏器进行肉眼观察，重点检查主要脏器的大小、外观、色泽、有无充血、出血、水肿等；对有病理变化的组织及脏器做组织病理学检查；

试验结束：对各个剂量组存活动物与对照组动物做大体病理解剖，必要时做组织病理学检查。

组别动物数（只）

剂量（mg/kg）对数剂量死亡数（只）死亡率

存活率表1小鼠盐酸二甲硝咪唑LD50测定结果实验结果记录（5）6.LD50的计算用改良寇氏法计算LD50。i—组距，即相邻两组剂量对数剂量之差；Xm—最大剂量对数；P—各剂量组死亡率(死亡率均用小数表示)；∑p—各剂量组死亡率之和。LD50的标准误Sx50—logLD50的标准误i—组距，即相邻两组剂量对数剂量之差P—各剂量组死亡率（死亡率均用小数表示）q—各组剂量存活率，q=1-pn—各组动物数LD50的95%可信限计算公式LD50的95%可信限=log-1(logLD50±1.96×Sx50)

7.结果评定根据小鼠的中毒症状、死亡时间、LD50及急性毒作用特点，初步判断该受试物的毒性大小和毒性特征。注意事项操作时要小心仔细、大胆敏捷、熟练准确、不能粗暴，不能恐吓动物，同时，要爱惜动物，使动物少受痛苦。正确捉拿动物，防止被咬伤。实验药品不能带出实验室。防止操作者中毒。实验二

小鼠骨髓细胞微核试验2实验原理微核是在细胞的有丝分裂后期染色体有规律地进入子细胞形成细胞核时，仍然留在细胞质中的染色单体或染色体的无着丝粒断片或环。它在末期以后，单独形成一个或几个规则的次核，被包含在细胞的胞质内而形成，由于比核小得多故称微核。

通过检测哺乳动物骨髓细胞中嗜多染红细胞（PCE）的微核出现率，间接反应骨髓细胞染色体畸变发生率的高低，从而判断受试药物是否具有致突变作用,主要用于测试干扰细胞有丝分裂的物质。小鼠骨髓嗜多染红细胞微核的形成3实验材料3.1器材解剖器械，显微镜，载玻片等。3.2试剂甲醇（分析纯）、甘油（分析纯）、Giemsa储备液、pH6.8磷酸盐缓冲液、小牛血清、生理盐水3.3药物环磷酰胺3.4动物小鼠7-12周龄，体重20-30g，雌雄各半。4操作步骤4.1给药环磷酰胺生理盐水溶液按50mg/kg剂量腹腔注射2次，间隔24h。空白对照：生理盐水4.2骨髓液的制备和涂片试验动物第二次染毒6小时后用颈椎脱臼或麻醉法将其处死，取胸骨，擦净血污，剔去肌肉。在洁净的玻片滴小牛血清1滴，剪去骨骺，用止血钳将骨髓挤到血清中，混匀，推片，干燥。4操作步骤4.3固定将推好晾干的骨髓片放入染色缸中，甲醇液固定5-10min，取出，晾干。不能及时染色的涂片也应固定好保存。4操作步骤4.4染色将固定晾干后的涂片，用新鲜配制的Giemsa染液(Giemsa储备液1份+pH6.8的磷酸盐缓冲液9份)染色10-15min，冲洗，晾干。1/15mol/L磷酸盐缓冲液(PH6.8)

磷酸二氢钾(KH2PO4)

4.50g

磷酸氢二钠(Na2HPO4·12H2O)

11.81g

加蒸馏水至1000mL

4操作步骤嗜多染红细胞（PCE）呈灰蓝色，正染红细胞（NCE）呈粉红色。典型的微核多为单个、圆形、边缘光滑整齐，嗜色性与核质一致，呈紫红色或蓝紫色。4.5观察计数低倍镜下观察，选择细胞完整、分散均匀，着色适当的区域，再在油镜下观察计数。

计数1000个PCE中含微核的PCE数，并且计数至少200个细胞（PCE+NCE≥200个）中PCE与NCE的比值。4操作步骤MNNCE5结果记录细胞总数微核细胞数微核率（‰）PCE数NCE数PCE/NCE空白组染毒组表微核率统计嗜多染红细胞微核率=有微核的嗜多染红细胞总数/检查嗜多染红细胞数×1000‰正常小鼠骨髓嗜多染红细胞微核率为千分之五以下，超过千分之五为异常。6结果分析与评价本试验中只计数PCE中微核，微核率以千分率表示。PCE/NCE为评价细胞毒性的指标，受试组PCE/NCE值与阴性对照组比较有统计学意义表示受试化学毒物的剂量过大，试验结果不可靠。正常PCE/NCE约为1（正常范围0.6-1.2），如比值小于0.1，表示PCE形成受到严重抑制；如比值小于0.05，表示受试物剂量过大，实验结果不可靠。

实验三急性皮肤刺激试验

目录试验原理试验目的试验材料试验方法结果分析方法评价试验原理局部刺激试验是毒理学试验中的一项重要内容，对可能具有局部刺激作用的化学物必须进行此项试验，但对具有强酸（pH≤2）或强碱（pH≥11.5）性质的化学物不需做本试验，因为这些化学物属于腐蚀性物质。另外，已知具有高毒性的化学物也不必进行皮肤刺激试验。皮肤刺激试验又称皮肤原发性刺激试验。试验目的了解受试化学物对皮肤的直接刺激作用以及刺激强度。试验材料——实验动物实验动物：成年白色家兔或白色豚鼠，首选白色家兔。在皮肤刺激试验中，动物品种的选择很重要。目前多选用兔和豚鼠，对于强刺激或无刺激作用的化学物选用家兔检测效果好，但对作用缓和的刺激性化学物，选用豚鼠所获得的试验结果较准确。试验材料——受试化学物受试化学物：应用受试化学物原液或根据需要原液稀释成若干个不同浓度的稀释液，也可应用受试化学物的细粉。每小区皮肤的应用剂量为液体受试化学物0.3~0.5ml（84液），粉状受试化学物0.1~0.5g

（洗衣粉）。试验材料——其他脱毛剂大头针、纱布、棉球、胶布、塑料薄膜移液器、天平试验方法——脱毛在动物脊柱两侧或躯干中部用化学药品脱去被毛准备好脱毛区。脱毛方法：先将被毛剪短，然后在所需部位涂上一薄层脱毛剂，2~3min后用玻璃棒刮去被毛，并用温水清洗脱毛剂，纱布擦干。采用局部全封闭斑贴法或局部半封闭斑贴法进行皮肤刺激试验。试验方法——局部全封闭斑贴法当以动物背部脊柱两侧的皮肤做受试部位时，先将其两侧脱毛区分成若干个小区，小区面积的总和应约为动物体表面积的1/10。将其中一侧的各个小区，分别用大头针在皮肤上划一“#”字形擦伤，以观察受试化学物对损伤皮肤的刺激作用；另一侧用以观察受试化学物对完整皮肤的刺激作用。将受试化学物原液及不同浓度的稀释液，分别直接涂敷于受试皮肤的若干个小区，然后在各区皮肤上放一块4~6层的纱布块或其他半吸水性惰性物（1cm×1cm或直径为1cm）。试验方法——局部全封闭斑贴法固体药剂可直接加到皮肤上，再用湿纱布覆盖或是放于预先浸湿的皮肤上，也可将糊状受试化学物涂于纱布块上，再将其贴于皮肤上，然后在纱布块上覆盖一层较大的不透气的塑料薄膜，用胶布和绷带固定。经4~8h后，除去斑贴物，每24h观察一次各小区皮肤的局部反应，连续观察4d，按皮肤刺激反应评分（表1），定量地评定受试化学物对皮肤局部刺激作用的强度。红斑通过肉眼观察，水肿通过轻轻触摸的方法来评分。表1皮肤刺激强度反应评分皮肤反应强度评分A.红斑和焦痂形成无红斑0极轻微红斑（勉强可见）1边界清晰的红斑（明显红斑，淡红至鲜红色）2中等至严重的红斑（鲜红至深红色）3极严重红斑（深红至紫红色），并有焦痂形成（真皮层受损）4B.水肿形成无水肿0极轻微水肿（勉强可见）1轻度水肿（边缘明显地高出周围皮肤）2中度水肿（水肿区高出边缘皮肤约1mm）3严重水肿（水肿区高出边缘皮肤1mm以上，面积超出斑贴区）4试验方法——局部半封闭斑贴法本法与局部全封闭斑贴法不同之处在于：1.每组的白色家兔数不应少于3只；2.采用纱布作斑贴物，在无刺激作用的前提下，用半封闭敷料固定；3.斑贴不需要在擦伤皮肤上进行；4.斑贴4h，然后去掉斑贴并清洗皮肤，观察0.5h、1h、24h、48h和72h后的皮肤反应。皮肤刺激反应评分同全封闭法。结果分析将表1中A项和B项评分结果相加，凡总分低于2分者可视为无刺激性或轻度刺激性；2~6分之间者具有中等刺激性；6分以上者具有强刺激性。刺激性极强的物质，试用前需经适当稀释后再进行斑贴，如稀释用的溶剂本身具有刺激作用，则需作溶剂对照试验。另外，也可按表2中的标准来判断试验结果。表2皮肤刺激强度分级标准皮肤刺激强度分级皮肤局部反应评分无刺激性无异常改变0轻度刺激性充血、红斑<2中等刺激性红斑，少量小出血点，水肿，少量丘疹以及小水疱2~6强刺激性红斑，皮下出血，水肿，有很多小水疱并有可能合并成大水疱，糜烂，表皮剥落，有溃疡形成等>6方法评价皮肤刺激试验的结果不仅与检测技术有关，也与试验过程中的质量控制相关。凡是杀虫剂、杀真菌剂、杀鼠剂以及具有刺激