核酸检测技术及其在国内外血液筛检中的应用

核酸检测技术及其在国内外血液筛检中的应用输血相关传染病的预防和掌握已经成为全社会关注的焦点,技术的引进是进一步提高血液安全性的重要一环。本文就病原体核酸检测技术(nucleicacidtesting,NAT)及其在国内外血液筛检中的应用状况和结果作一介绍,并对该方法在我国推广和应用的必要性和可行性作初步探讨。NAT酶免检测(EIA)技术已经广泛运用于血液筛检,该方法的灵敏度和特异性也HBV、HCVHIV1∶66000、1∶1030001∶676000[1]。这些危急的主要缘由是:病毒感染者“窗口期”献血,病毒变异,是指从感染病原开头,直至用某种检测方法能够检测到该病原存在为止的这一段HBsAg、抗-HIV、抗-HCV45-56ｄ22ｄ72ｄ[4,5],故美国90%以上输血传播HIVHBV75HCV[6]原或抗体血清学检测不能有效地保障血液安全。NATNATHBV、HCV和HIV感染的平均“窗口期”缩短9d(缩短“窗口期”20%)、59d(82%)和11d(50%[5,]NAT31504HCVRNANAT性疾病[9]。因此,NAT的引入可使输血传播疾病的危急性降到最低[10]。NAT1985年具有划时代意义的聚合酶链反响(polymerasechainreaction,PCR)PCRNAT[11这些技术灵敏度和特异性或高或低,操作或简洁或简单,适合在各PCRTMAPCRDNA特异性和快速简便等优势得到了广泛的应用。通过简洁的技术改进和联合,涌现RNAPCR(RTPCR)、敏感性和特PCR)PCR、检PCR(PCRELISA)、PCR酸探针杂交技术(PCRSSOP)PCRPCR目前在临床检测中使用较多的是荧光定量PCR,主要用于各种传染病的诊断、DNAPCR参加浓度的内标或外标,便能进展定量检测。由于该方法实现了反响体系的全封闭和操作的全自动,不仅削减了污染,还提高了效率。虽然国内很多生物技术企业已经利用荧光PCRNAT止正式通过美国FDA2RocheCOBASAmpliHIV1/HCV,FDA50copies/ml>95%PCR20copies/ml般都很难满足95%检出低病毒载量标本的要求。信任不断提高检测灵敏度,早日研发并注册成功我国自己的NAT血液筛检用试剂也是国内生物技术企业的进展目标。转录介导的扩增方法包括转录介导的扩增系统(transcriptionmediatedamplification,TMA)和核酸序列依靠扩增系统(nucleicacidｓsequencebased amplification,。TMA是一种利用Money鼠白血病病毒〔MMLV〕逆转录酶和T7RNA多聚酶2种酶的共同作用,在等温条件下来扩增RNA或DNA的反响系统,主要扩增原理为:目标序列在逆转录酶作用下,以引物为引导进展逆转录,逆转录酶的RNA酶性将杂合链上的RNA降解以后,合成双链的DNA,并在T7RNA多聚酶作用下,转录出成千上万个目标RNA序列,这些RNA又可以作为模板进展下一个循环,整个是一个自催化过程。NASBA的原理与TMA相像,只是在核酸提取和扩增产物检测的方法上有所不同。这两种方法的特异性强,灵敏度高,反响条件简洁,扩增效率高,无需特地的扩增仪器,且因整个反响在1个试管中进展,也削减了污染。NATDNAsignalamplificationassay,bDNA)、环介导的等温扩增技术(loopmediatedisothermalamplification,LAMP)、连接酶链技术(ligasechainreaction,LCR)和链置换扩增(stranddisplacementamplification,SDA)等。这些技术或由于自身缘由,或由于刚研发出来尚未进入bDNA1995年左右推出,其信号放大是通过碱性磷酸酶(AP)标记的探针杂交结合到一个树枝状核酸枝状体上而实现的。bDNADNAbDNA待测核酸,其检测灵敏度远远低于PCR,故该项技术实际上不适合用于血液筛检,bDNAHBVHCVNAT在国内外血液筛检中的应用开展NAT检测的国家及所用的技术NAT在国外特别是一些兴旺国家和地区已普遍应用于血液筛检[1例如,日本是世界HBV、HCV、HIVNAT[1]加坡、中NAT1997起就开头NAT2023NATFDANAT1：国家或地区技术混合检测／单检•Germany(1997国家或地区技术混合检测／单检•Germany(1997•PCR•Pool1999〕•Netherlands(1997〕•PCR•Pool•U.K.英国(2023〕•PCR•Pool•Switzerland•PCR•Pool•Japan日本(1997年１月起对原料•PCR•Pool浆；1999〕•PCR•pool•Canada•TMA/PCR•pool/IDT•韩国〔20231〕•USA(19993〕•TMA•IDTNewZealandTMApool/IDTAustraliaTMAIDTSingaporeTMAIDTPortugalTMA/PCRPool/IDTFrance(2023〕TMA/PCRPoolSpainTMA/PCRPoolItalyTMApoolHongKongTMA/PCRPool•台湾〔2023〕•TMA/PCR•Pool各国承受的技术各不一样〔参见表1。日本使用的方法为罗氏公司与日本NATＴＭNPX〔PCRHBV,HCVHIVChironTMATMA(ABC)系统则使用罗氏COBASAmpliScreen;荷兰及局部欧洲国家将荷兰阿克苏公司推出的NucliesensCOBASAmpliScreen扩增体系结合起QiagenScreen进展评估,目的是寻求一种最适合的NAT技术,既保障血液安全,又能保证血液的准时供给,还要做到省时省力。NAT的血液安全水平已经大幅度提高,但是由于EIA“窗口期”所致的漏检概率仍旧2。1/34.8HIV-1NAT+1/34.8HIV-1NAT+6160121751/266.9国家试剂检测方式NAT单独阳性检出状况文献美国ChironProcleixChiron: 16人1999.03-2023.03:14TMAHIV-1/HCVassay;Roche Cobas发光检测；Roche：24人份HCVNAT+：170/39,721,4041/23万；HIV-1NAT+12/37,164,054AmpliScreenHIV-1 and HCV混 合 ，PCR-ELISA1/310万tests日本 Multiplex1999711999.7–2023.4：文 献HBV/HCV/HIV-1日-20231月HBVNAT+15,16reagent(Roche31日，500人：26／25609771/9.8与日本共同研制)份；HCVNAT+202321：9／25609771/28.450人份HIV-1NAT+：0／256.1混样;2023.2.1–2023.12.31：合格血液检测HBVNAT+308160121751/5.2HCVNAT+46／16012175,ChironProcleix2个点单人份，2023.06.07-2023.11.14：17利亚TMA HIV-1/HCV316人份，及个人assay;TMA, 化学发万；交 流光检测；HIV-1 NAT+1/4,489,5504〔1/449.04,489,55018〕中欧HCVPCR:RocheCobasAmplicon;96人份混合HCVNAT+：6/360万，1/60万；HIVNAT+：2/360万，1/180万19HIVPCR:自己研PCR法国ChironProcleix单检，或8人2023.07-2023.12：20TMAHIV-1/HCV；16人份,HCVNAT+：3/6141/205或RocheCobas不考虑血清学HIVNAT+：2/6141/307Nuclisens核酸提取仪坡ChironProcleixTMA HIV-1/HCVassay;单人份检测2023.10-2023.10:HCVNAT+：4／304,715,即万；1/7.6个人沟通〔21〕万韩国ChironProcleix16人份2023.06.14-2023.12.03个人交TMAassay;HIV-1/HCV估：单采献浆者24599，献血者15597:流〔22〕HCVNAT+：1/40196；HIVNAT1/40196；2023.01.01南非ChironProcleix单人份199923TMAHIV-1/HCVHIVNAT+:2/197091/1.0assay;HCVNAT＋:0/19709AmpliscreenHIV-1AmpliscreenHIV-1andHCV结合theOrganon我国核酸筛查技术应用的问题很难掌握。有关我国献血者及原料浆中NAT34。3NAT检测争论的状况单位深圳保安区中心血站厦门血液

试剂美 国BiotronicsTechHBV,HCVAmpliSensor试剂盒自行设计引

检测方式2015000rpm离心浓缩，半自动荧光定量PCR50人份混合，

NATHCVNAT+:1/8805(ALT390U/L)；HBVNAT+:抗-HBc阳性中：5/495(1％)HCVNAT+:2/10000,即

文献2425中心物，HCVNucliSensExtractorNASBA技ECL检测1／5000江苏省血液中心HCV试剂盒RNA单人份，PCR,电泳HCVNAT+:／37526上海血液美国Chiron8人份或24人份混HCVNAT+:0／103539;7中心ProcleixHIV-1/HCV光检测HIVNAT+:0／103539;北京血液匹 基2426000gHCVNAT+:0/34373;27中心HCV/HIV-1荧光PCR检测试剂Roche提取柱，荧光PCRHIVNAT+:0/34373多单位参与的国际合作深圳血液中心沈阳血液中心

美国ChironProcleixHIV/HCVRocheAmpliscreenHBV/HCV/HIV匹基HCV荧光PCR测试剂

16自动混样；TMA化学发光检测24人份混合，STAR2023自动混样;RocheMPLC自动提取核酸；RocheCOBASAmplicor扩增和检测2426000gRoche提取柱，荧光PCR

HCVNAT+：2/802591个ALT254IU/ml)HIVNAT+：0/80259HCVNAT+:0/16512;HIVNAT+:0/16512;HBVNAT+:8/16512,即1/2064HCVNAT+:0/8.3

2829人沟通(深圳2023年５月)阳血液中心，李剑平博士，20236中山中心单人份，PCR,电泳HCVNAT+:30血站及芜77/28098(1/365)湖中心血正业HCVPCR站表4 国内原料浆开展NAT检测争论状况单位试剂检测方式NAT文献中国药品匹基HCV/HIV-12426000gHCVNAT+:0/19196;31生物制品检定所荧光PCR核酸检测试剂离心浓缩，Roche酸提取柱，荧光PCRHIVNAT+:0/19196上海莱士血制品匹 基HBV/HCV/HIV-1荧光PCR核酸检测试剂48离心浓缩，Roche酸提取柱，荧光PCRHBVNAT+:1/1401718(1/140HCVNAT+:31/1401718(1/4.532HIVNAT+:3/1250007(1/41.7中国药品生物制品检定所

ChironProcleixHCV/HIV-1Assay

16人份混合，TMA技HCVNAT+:1/10032; 个人沟通〔检术；化学发光检测 HIVNAT+:0/10032 定所白坚石20231〕我国核酸筛查技术应用工作小结：NATNATHCV NAT+检出率结果差异很大，从1/365〔国产试剂,电泳〕～1/4.0NATHCVNAT+:1/1.0～1/4.5NAT+：1/41.7；HBVNAT+：1/140〔48。必需重视核酸检测的质量掌握体系：留意避开穿插污染：检测方法：传统的电泳检测为开放式，不适合；严格的核酸检测试验室设置和治理。留意试剂质量：为适应血液混样检测对灵敏度的要求，一些国产血筛试〔如匹基〕在考察期间不错。但仍有待完善，表现在：波动小；国产试剂批间差异问题；特异性问题。因此存在假阴性问题。国产试剂尚在起步阶段，尚不能实现自动化，没有配套软件。标本留样和处理：也是核酸检测质量掌握体系中的重要环节，否则在检NAT血液核酸筛查进展趋势NATNAT