基因表达载体构建及棉花菌转化和沉默抑制功能初步研究

分类号 密级UDCOTU表达载体的构建及棉花黄萎菌转化和沉默抑制功能初步研究答辩日期 答辩 论文评阅 廖乾答辩成员陈集双廖乾国家自然科学基金项 )资法，进而建立真菌ATMT法的侵染性克隆体系，对研究棉花、棉花黄萎菌以及棉花黄萎菌三者之间的互作关系，以及对真菌及其功能研究具有重要意义。本文本研究首先以植物表达载体PH7WG2D为基本骨架，通过PCR技术将VdCV1的OTU序列VcR4进行改造，获得含35S+VcR4+Ribozyme+Nos序列的attBPCRGatewayBP反应构建入门载体，入门载体与双元表达载体pH7WG2D通过LR反应构建双元表达载体PHVcR4，经酶切鉴定、PCR鉴定和分析PK7WG2D为基本骨架，通过同样的方法改T采用ATMT法转化棉花黄萎菌。结果显示，PHVcR4质粒农杆菌转化黄萎菌获得了具有未能整合到棉花黄萎菌组中，绿色荧光属于GFP瞬时表达，或者可能是表达质粒中的目的片段整合进了棉花黄萎菌组，但启动子未启动潮霉素转录。PKHyg质粒可能与载体PK7WG2D不适合作为真菌转化载体有关。pBHt1质粒农杆菌转化黄萎菌未能筛选到具有抗性的转化子，可能与农杆菌菌株为C58C1有关。黄萎菌的转化有待进一采用瞬时表达法，利用构建的OTU重组载体PHVcR4以及对照载体pHCm，初步探讨了OTU对转GFP本氏烟16C的沉默系统的抑制作用研究发现OTU不是植物的沉默抑制子，同时发现带有GFP的Gateway双元表达载体可用于基（TMTCottonVerticillumwiltdiseaseisoneofthemostdevastatingplantdiseasetocotton.EstablishmentofhighefficientV.dahliaegenetictransformationsystem,especiallyanAgrobacteriummediatedgenetictransformationsystem,isguidingsignificantfortheinteractionof-V.dahliae-Cottonandfunctionalysisofesoffungi.SincetheexactfunctionofVdCV1genehasnotbeenreportedyet,wehavedonepreliminaryBasedonthebackboneplantexpressionvectorPH7WG2D,theCaMV35SpromoterandtheRibozyme+Nos-terminatorwereligatedtotheflankofVcR4sequenceofOTUgene.respectively.ThentheattBPCRproductwasclonedintotheentryvectorbyBPreaction.ThebinaryexpressionvectorPHVcR4wasreconstructedbyanotherbinaryexpressionvectorpH7WG2DandtheentryvectorthroughLRreaction.The binantplasmidwassuccessfullyconstructedandconfirmedbyrestrictionendonucleasedigestionandsequencing.TheexpressionvectorPKHygwasconstructedinthesameway.Thehygromycin geneunderthecontroloftheAspergillusnidulanstrpCpromoterandNosterminatorwasinsertedintotheplantexpressionvectorPK7WG2D.ByexposingtheV.dahliae0-21toalowconcentrationofcycloheximideduringhyphaltipisolation,weisolatedthreestrainswhichhadnormalmycelialgrowth.TheRT-PCRresultindicatedthatthedsRNAwascompleyeliminated.InordertoevaluatewhetherAgrobacteriumtumefaciensmediatedtransformationmethodcanbeappliedforVerticilliumdahliaetransformation,theA.tumefaciensstrainGV3101andC58C1wereusedforthetransformationstrains.PHVcR4,PKHygandpBHt1wereusedastransformationvectors.Theresultsshowedthatoutgrowingsporesandhyphaehavinggreenfluorescencewereobservedinthetransformations,butwefinallyfailedtoobtaintransformantsresistanttoHygromycin.ThepresumablereasonmaybethatthefragmentinexpressionplasmidwasfailedtointegrateintothecottonVerticilliumdahliaegenome,andthegreenfluorescencewastheresultofatransientexpression.Ontheotherhand,thefragmentwassuccessfullyintegratedintothecottonVerticilliumdahliaegenome,butthepromotormaynotturnonhygromycingenetranscription.TransformationwithPKHygwasunsuccessful.Neithergreenfluorescencewasobservedintransformants,northetransformantscouldgrowontheculturalmediumwithHygromycin.ThepossiblereasonwasthatPK7WG2DwasnotsuitableforVerticilliumdahliaetransformation.TransformationwithpBHt1wasunsuccessfulbecauseofnotadoptionofAGL-1astransformationstrain.Insummary,transformationofVerticilliumdahliaebyATMTneedfurtherresearchandimprovement.Inthisstudy,wecarryoutapreliminarystudyontheinfluenceofOTUgeneonlocalgenesilencingbytheconstructed binantvectorPHVcR4andthecontrolvectorpHCminfiltratingonGFPtransgenticN.benthamianaplant(line16c).ThesestudiesindicatethatOTUgeneisnotaplantsilencingsuppressor,andtheGatewaybinaryexpressionvectorscontainingGFPgeneareavailableforthestudyofgeneticsilencingsuppression. 第一章文献综 棉花黄萎病菌及棉花黄萎菌研究概 棉花黄萎病菌简 真菌及棉花黄萎菌..........................................................................................OTU研究的概 真菌遗传转化方法的研究进 根癌农杆菌介导真菌遗传转化的研 PEG-CaCl2介导真菌遗传转化的研 电转化法转化真菌的研 枪法转化真菌的研 限制性内切酶介导真菌转化的研 真菌遗传转化筛选标记的研究进 抗药性标 营养缺陷型标 沉默和沉默抑制子研究概 5.1.沉 5.2.沉默抑制 研究目的意义和研究内 研究目 研究内 第二章OTUGateway双元表达质粒构 材料与方 酶与试 双元表达质粒构建元 双元表达载体构建方 attBPCR产物内各元件的构 PCR产物纯 attBPCR产物构 入门载体构 碱法提取质 重组质粒酶切鉴 序列测 LR反应构建双元表达载 双元表达质粒酶切鉴 质粒PCR鉴 序列测 结果与分 attBPCR产物构建结 入门载体构建结 结 LR构建双元表达载体结 小结与讨 第三章含trpC启动子和潮霉素的Gateway双元表达载体的构 材料与方 酶与试 双元表达载体构建元 双元表达载体构建方 attBPCR产物内各元件的构 PCR产物纯 attBPCR产物构 入门载体构 碱法提取质 重组质粒酶切鉴 序列测 LR反应构建双元表达载 质粒PCR鉴 序列测 结果与分 attBPCR构建结 入门载体构建结 结 LR构建双元表达载体结 小结与讨 第四章不同表达质粒ATMT法转化棉花黄萎菌的比较分 材料与方 试剂与质 菌种脱毒培 脱毒菌株的鉴 黄萎菌总RNA提 RT-PCR检 农杆菌感受态的....................................................................................................双元表达质粒转化农杆 质粒酶切鉴 抗生素浓度筛 ATMT法转化棉花黄萎 结果与分 菌株0-21脱毒结 潮霉素浓度筛选实验结果分 农杆菌质粒酶切鉴 ATMT法转化棉花黄萎菌结果分 小结与讨 第五章OTU蛋白沉默抑制功能研 材料与方 酶与试 PHCm的构 农杆菌感受态的....................................................................................................双元表达质粒转化农杆 质粒PCR鉴 农杆菌浸 结果与分 瞬时表达载体对GFP转本生烟16c的GFP表达的影 小结与讨 第六章总结与讨 参考文 略语Double-strandedComplementarySodiumPolymerasechainNatriumDoubledistilledDimethylDEPCDistilledwatertreatedwithEthidiumNationalCenterforBiotechnologyBase第一献综棉花黄萎病菌及棉花黄萎菌研究概棉花黄萎病菌简棉花黄萎病主要由大丽轮枝菌（VerticilliumdahliaeKleb.）引起[5]。该病菌生长温度真菌及棉花黄萎近年来研究发现许多植物致病真菌携有真菌，其中一些可以导致病原真菌低毒防治的Cryphonectriahypo 的抑制作用[9]。现在发现同样对寄主力的还有侵染Ophiostomanovo-ulmi[10]和Sclerotiniahomoeocarpa[11]Sclerotiniasclerotiorum的Mito victoriae的 （Hv-145S）[13]，侵染Spergillusochraceus[14]和Rhizoctonia的Partiti ,侵染Diaportheambigua[16],Fusariumgraminearum[17],Botrytiscinerea[18]的未分类等。此外，在稻瘟病菌[19]、水稻纹枯病菌[20]、马铃薯立枯丝核菌[21]中都发现有dsRNA2011年本等发现棉花黄萎菌0-21株系中存在dsRNAdahliaechryso1（VdCV1）[22]，该属于Chryso，全组包括4个条带，根OTU研究的概OvarianTumorprotease（OTU蛋白酶）的研究主要来源于对动物和人及其相关的研究方面。第一、二个OTUB1和OTUB2是从Hala癌细胞中发现的，是裂真菌中发现OTU的有Cryphonectrianitschkei 1[26]、棉花黄萎菌[22]，其功能也未研究。OTUBains是一个裂解蛋白酶科[27]，具有抑制泛素联结（Ubiquitin-来自于2个不相关的动物Nairo 和Arteri 的OTU蛋白酶具有抑制寄主抗活性、抑制寄主免疫反应通路的作用，增强的侵染性[28]。转OTU蛋白的小鼠增强了对Sindbis 侵染的敏感性[28]。由于OTU保守序列的存在及在免疫和侵染方面的作用，OTUBains科最近吸引了许多学者的注意[24]。真菌OTU，对CrimeanCongohemorrhagicfever （CCHFV）的研究[29]表明，OTU基糖体蛋白对烟草花叶运动蛋白具有降解作用，采用26S核糖体的抑制剂能够增加随着越来越多的真菌组完成，真菌生物学进入了功能组时代[31]。自1973为研究功能的一种重要。目前，研究较多并成功转化的真菌主要包括丝状真菌、根癌农杆菌介导真菌遗传转化的研根癌农杆菌是普遍存在于土壤中的一种革兰氏细菌，其在大多数双子叶植物伤口的同时，可以将其质粒上的一段DNA插入到植物组中。根癌农杆菌介导真菌转化法（Agrobacteriumtumefaciensmediatedtransformation,ATMT）具有以下优点：1）受体范围广。ATMT转化真菌的受体材料可以是原生、孢子、菌丝体、子实体等组织及形态了Aspergillusawamori、Aspergillsniger、Colletotrochumgloeosporioides等一系列丝状真菌。Mullins等[35]以质粒pCAMBIA1300为骨架构建了四个双元质粒并将其转入Fusariumoxysporum孢子。Javier等[36分别用菌丝体和分生孢子作为受体成功构建了内生真菌Acremoniumimplicatum的转化系统。2）转化效率高。Groot等[34]研究表明，使用ATMT法转定遗传。RaedO.Abuodeh在转化Coccidioidesimmitis时发现在无潮霉素筛选的GYE培养基的影响。目前常用于真菌转化的农杆菌菌株有AGL-1、EHA105、LBA1100、LBA4404等。率相近，而LBA4404转化失败。Campoy等[39]在转化Monascuspurpureus时也发现类似的结株[40]。2）乙酰丁香酮（AS）对转化效率的影响。AS的作用是可以激活Vir，诱导Vir并不意味着S的浓度越高越好，茁等]在对淡紫拟青霉进行遗传转化时发现当S浓度达到100gm1时,转化效率降低。并且oioka等得研究表明在预培养期加入S可以增加TA的拷贝数[4。3）根癌农杆菌与受体菌浓度的比例对转化效率的影响。根癌农6在转化瓜类炭疽菌时采用的共培养时间是24h，原因是共培养时间过长会造成真菌萌发的菌丝越长，难于洗脱从而影响转化效率。等研究表明对于深绿木霉菌23的最佳共培养时间是48h。而mppinn等8]在转化tomcohizlmbiontariaiolorS238时采用的共培养时间是108h225℃是最适的转化温度[40]5）载体及其启动子对转化效率的影响。载体的空间结构会直接影响转化效率。等[4]在转化红曲霉时发现，使用载体pR5750和pgHg成功，但前者的转化效率是后者的pgHg只有启动子不同的载体p7-1值及载体膜类型等均可对转化效率产生影响，在进行具体试验时应该对各种条件进行优化，确定最佳的转化条件，以达到最佳的转化效果[。农杆菌介导的遗传转化技术适应了真菌功能组时代所的大规模定向和随机100种真菌利用M法转化成功[3,7法的应用范围必将更加广泛。PEG-CaCl2PEG-CaCl2介导的真菌遗传转化是以原生为感受态细胞，通过PEG的介导作用将含外源的质粒转入受体细胞。此法的关键步骤是原生的。目前采用的原生质用菌丝、分生孢子和担孢子[50]。影响PEG-CaCl2转化效率的因素包括PEG的浓度和分子量、CaCl2的浓度和PH等。虽然该法操作简便，但是原生的过程相当繁琐，并且转化效率也不高。等[51]利用PEG-CaCl2法对灵芝进行遗传转化，转化效率仅有5-6个DNA分子穿过质膜与受真菌原生的转化效率不高，所以对真菌转化采用此法的研究比较少[53]。等[54]利用电击法成功转化紫孢侧耳原生，但转化比仅有3.6%。转化受体细胞再生、转化频率原因使的该法的应用受到了很大限制[55]Masahide[56]利用枪法成功转化了Pleurotusostreatus，转化效率为1个转化子/μgDNA限制性内切酶介导转化（RestrictionEnzyme-MediatedIntegration—REMI）是通过限制性内切酶酶切真菌组DNA，然后与线性化质粒DNA相连接，同时与受体原生质割的组DNA没有完全修补所致。REMI作为分离植物病原真菌致病相关的有效工具目前已应用于多种真菌的转化。张永光等[57]REMI电转化产甘油假丝酵母，并对香菇进行转化，结果发现前者的转化效率是后者的10倍。抗药性标4185100/ml200μ/ml9。高兴喜等[0将CryAb)成功转入哈茨木霉菌中，潮为150/ml.方丽等]合PUS体pGHP2转200/mlJvr等6roniumipliat100/ml。沈卫锋等1为100/ml。等]在转化深绿木霉菌23250/ml.陈强等250μ/ml.100/ml20/ml球孢白僵菌转化时使用包括除草剂和潮霉素B等10种抗生素，仅除草剂有明显的抑制作用。Ward等[65]得研究表明oliC3可以作为Aspergillusniger的筛选标记。生型生长。尿嘧啶营养缺陷型是目前最常见的营养缺陷型标记，d`Enfert等[66]的研究道的可以作为野生型标记的有ade、met、pro、inl、arg、trp、ribo和leu等[67,68]。Cutler等[69]的研究表明nial可以用于依赖硝酸盐同化作用的转化系统的标记。Sandhu等[70]以niaD为筛选标记对Beauveriabassiana和Metarhiziumanisopliae进行转化。[68]沉默和沉默抑制子研究概沉沉默（genesilencing）是指生物体中特定由于种种原因不表达，它是由Jorgenson等人于1990年在在转苯基苯乙烯酮合成酶的紫色矮牵牛花中首次发现[71]，后来的其他的生物中也有相应的发现。沉默分为转录水平的沉默（transcriptionalgenesilencing，TGS）和转录后水平的沉默（post-transcriptionalgenesilencing,PTGS）两种因在细胞核中能够稳定转录，但在细胞质中却无对应的mRNA存在。当植物载体侵被称为诱导的沉默（ -inducedgenesilencing,VIGS）[72]。诱导的沉因沉默是植物抗病的可能机制[73]。因此，它不仅仅是研究沉默机制的热点，而且还是研究植物功能和抗病防御的一种非常有效的。沉默抑制子(RNASilencingSuppressor)即植物RNA沉默的抑制子，是植物与在长期的进化过程中形成的一种抑制植物RNA沉默的反防御因子，从而可通过抑制RNA沉默实现自身对寄主植物的成功侵染目前已经发现了20多种抑制子蛋白[74]，如由黄瓜花叶（cucumbermosaic 马铃薯A（potatoA,PVA）编码的HC-pro蛋白，番茄丛矮(tomatobushy ,TBSV)编码的P19抑制子等。其中由CMV编码的2b蛋白是最先被证实的PTGS也发生于细胞核内。另外，嫁接实验[75]表明2b蛋白可信号分子的长距离运输。Brigneti等[76]人也发现CMV2b只能在新生叶片中抑制沉默，而不能逆转叶中已建立起来的沉默，这进一步说明CMV2b可抑制系统沉默信号的传导，从而促使向研究目本文通过利用Gateway技术构建含VdCV1中OTU双元表达载体，并利用沉默抑制功能，为进一步研究VdCV1中OTU的功能以及VdCV1与黄萎研究内OTUGateway双元表达质粒构含trpC启动子和潮霉素的重组Gateway双元表达质粒的构以trpC为启动子，以表达载体pK7WG2D为骨架，构建含潮霉素抗性的重Gateway双元表达质粒PKHyg含OTU的重组Gateway双元表达载体—PHVcR4转化黄萎菌；含trpC启动子和潮霉素的重组Gateway双元表达载体—PKHyg转化黄萎菌；含trpC启动子和潮霉素的双元表达载体pBHt1转化黄萎菌OTU对转GFP烟草16C的沉默抑制功能初步研第二章OTUGateway双元表达质粒构tay（inviten开发的一种基于位点特异性重组原理的通用克隆技术。由于该项技术突破了传统的通过酶切与连接的方法构建载体[7，可以将高dB基因，否则无法繁殖，这就大大降低了载体构建中出现假阳性的概率8。目前该技术已被迅速应用于反向遗传学方法研究动物及植物单、多的功能研究。已有研究表明，双35S启动子可以启动目的在真菌中表达[9d1中克的U过tay由M35S启动子调控的真核表达载体p7W2D双35S下OU构代dB序列的对照载体。材料与方酶与试DNAAxygeneInvitrogen公司合成。卡那霉素(Kan)和壮观霉素（Spec）购自生物工程公司。为了增强VcR4中OTU的表达，我们构建载体时分别在VcR4前端引入强启动子35S序列，并在其末端加入特定核酶序列和NOS终止子。延伸PCR技术（overlap叠PCR技术可以有效的实现。同时，为了方便导入Gateway入门载体系统，我们预先在35SattB1NOSattB2Gateway元件如图2.1所示。2.1attBPCR产物构建示意Fig.2.1ConstructionoftheattBPCRattBPCR产物内各元件的35SNos-TpK7WG2DVcR4的模板来自VdCV1克隆质粒55号（本提供，扩增Cm的模板来自质粒pDONR221，所需引 template（约0.5 1dNTPmixture（2.5 1.610pyrobest 2F（10 1R（10 1PyrobestDNA 0.2 13.2 20PCR℃3℃30℃3030℃1min（35SCmNos-T）3.5min（4 PCR产物纯PCR会出现非特异性条带，因此有必要对所得产物进行纯化，以便下一步离心管的重量，该重量作为一个凝胶体积（100mg100µl；0.5BufferDE-A体积的BufferDE-B重复步骤7）一次（可选2-3min；12000rpm离心1min，洗脱目的条带，1.0%attBPCR产物构将以上所得PCR纯化产物利用PCR技术融合在一起，引物使用attB1 template1（0.52.5template2（0.52template3（0.51attB1（101attB2（10110pyrobest2dNTPmixture（2.51.6PyrobestDNA0.28.720PCR℃3℃30℃3030℃4 入门载体0.5mlattBPCRproduct（约20ng/µl） pDONR 0.5 425℃，81µlProteinaseK，37℃，1042℃，60sec后立即置于冰上，237℃，225rpm，14℃，4500rpm1min，超净工作台内弃600µl上清，剩余部分混匀后取100100mg/L碱法提取，37荡培养8-16h；8000rpm，1min，弃净上清菌体悬浮于150μlSolution5μl1.0%琼脂糖凝胶电泳检重组质粒酶切鉴 5.510×H 1重组质粒 3MluⅠ(10 0.5 10反应混合物轻微涡旋混匀后低速离心，373序列测经酶切鉴定的阳性质粒送桑尼公司进行DNA(ABI3730XLDNAyzer,USA)。引物为M13正反向引物。结果通过与VectorNTI软件构建的入门载体LR反应构建双元表达载0.5mlEntryclone（约30 6 2 825℃，81µlProteinaseK，37℃，1042℃，60sec后立即置于冰上，237℃，225rpm，14℃，4500rpm1min，超净工作台内弃600µl上清，剩余部分混匀后取100100mg/LPCR0.1F1R1dNTPmixture（2.510PCR1.620.214.12094394305830723721541.3.11序列测经酶切鉴定和PCR鉴定的阳性质粒送桑尼公司进行DNA(ABI3730XLDNAyzer,USA)。结果通过与VectorNTI软件构建的重组表达载体序列比对以验结果与分attBPCR产物构建结1.0%琼脂糖凝胶电泳检attBPCR产物及其组成元件，结果如2.2所示

35SVcR4Nos-T

2.2attBPCR产物及其内部各元件电泳检测结(A)35S、VcR4、Nos-TCm。M，DNAMarker(Takara，D517A)；(B)attB产物检测。M，DNAMarker(Takara，D517A)Fig.2.2ElectrophoresisresultofattBPCRproductandits(A)Theresultofprocessed35S,VcR4,Nos-TandCm.M,DNAMarker(Takara，D517A);(B)TheresultofpurifiedattBPCRproduct.M,DNAMarker(Takara,D517A).经纯化处理的attBPCR产物及其组成元件的电泳检测结果显示，利用PCR技术已成功将35S、VcR4Nos-T连接起来，片段大小与预期片段大小3637bp相吻合，可用于下一步Gateway克隆构建。另外一个片段Cm后预期大小1306bp，与电泳结果相一致。纯化后的35S和VcR4、浓度与Nos-T比起来明显较低，所以在做PCR时入门载体构建结Gateway入门载体构建结果结果2.3所示。酶切结果如2.4所示A

B

2.3入门载体质粒提取电泳SM0311）1-7，Cm入门载体质粒Fig.2.3ElectrophoresisresultofEntrySM0311）1-7，entryvectorsofCmA

B

2.4质粒酶切鉴定电(AMluⅠ酶切重组质粒。MDNAMarker(Fermentas,SM0311),1-3为酶切后的VcR4(B)MluⅠ酶切重组质粒。MDNAMarker(Fermentas,SM0311),1-3为酶切后的Cm binatedplasmidsdigestedwithrestriction(A)Result binatedplasmidsdigestedwithMluⅠ.M,DNAMarker(Fermentas,SM0311);1-binatedplasmidsofVcR4digestedwith(B)M,DNAMarker(Fermentas,SM0311);1- binatedplasmidsofCmdigestedwith1%VectorNTI构建7Gateway克隆方法的高效性。酶切预测结果分5191bp932bp2275bp+932bp与实际结果相一致，进一步确证所选克隆为阳性克隆，待结果最终验证序列的正确性。结ClaI

T7

T7EntryClonepDONR221/PCRProductof35s+VcR4+R+Nos-AvaIAvaIClaIAvaI

6123

rrnBT1transcriptionterminatorM13(-20)forwardprimerAvaI(2426)2.5VectorNTI模拟构建入门载体Fig.2.5TheconstructionofentryvectorbyVectorLR构建双元表达载体结PCR2.62.7Vector（10206bp+1983bp）相一致。质粒PCR鉴定结果与目的条带大小一致。经验证替A M1232.6目标质粒酶切鉴定EcoRⅠ酶切目标质粒。MTrans5KDNAMarker；1、3、5、7为重组质粒；2、4、6、8为酶切EcoRⅠ酶切目标质粒。MMarker（akara，D517A；1-3Resultof binatedplasmidsdigestedwithEcoRⅠ.M,Trans5KDNAMarker;1、3、5、7,binatedplasmids；2、4、6、8， binatedplasmidsdigestedwithEcoRⅠResultof binatedplasmidsdigestedwithEcoRⅠ.M,Marker(Takara，D517A);1-3, plasmidsdigestedwithEcoRⅠ

2.7PCR鉴定电泳结MTrans5KDNAMarker；1-4M,Trans5KDNAMarker;1-4,destinationplasmidsPCRASacI(14437AXhoIHindIIIPstISmaIKpnIXhoI(12997StuIEcoRIPstI(11257

PstIStuISacI(1087HindIIIPstIPstIApaIPstIMluIBamHISmaIKpnI(1517SacIExpressionClone/pH7WG2D,1/OE+eGFP/PJC31/pDONR221/PCRProductof35s+VcR4ApaI EcoRI15105BamHIoja272SmaIKpnIoja273PstISmaIBamHIBEcoRIPstI(11257

PstI(

HindIII(PstI(PstI(

PstIHindIIIBamHISmaI(

PstI(BamHISmaI(EcoRIExpressionClone/pHWG2D,1/OE+eGFP/PJC31/pDONR221/PCRProduct

12189

oja273PstI(SmaI(BamHIPstI(HindIII(2.8VectorNTI模拟构建目标载体图Fig.2.8TheconstructionofdestinationvectorbyVector(A)PHVcR；(B)小结与讨本研究以表达载体PH7WG2D为骨架，通 Gateway技术插S片段和S片段，成功构建了以P为报告，以g为筛选，含双S启动子和U的重组双元表达质粒4和对。本研究首先对棉花黄萎菌VdcV1组中含OTU的片段VcR4进行改造，改造PH7WG2D载体上带有eGFP序列。众所周知，GFP与目的融合不影响本米]、小麦[]、甘蔗[]等作物均有。P在真菌转研究中同样可以作为筛选标tfnie等1的研究表明改进的FP质粒不仅提高了稳定性，而且更易在真菌中表达。此外，尽Odell等[92]研究35S启动子表达无组织特异性，但后来的研究发现启动子在不同宿主体内表达效率不同，并且存在组织和特异性[82]。因此，本文第第三章含trpC启动子和潮霉素的Gateway双元表达载体的构已有研究表明，trpC启动子能够启动潮霉素在棉花黄萎菌中表达[62]。为了避免35S启动子在棉花黄萎菌中不启动转录，我们同时构建了含trpC启动子和潮霉素基GatewayPK7WG2D。筛选标记仍然是eGFP和潮霉素。材料与方酶与试和壮观霉素（Spec）购自生物工程公司。测来确认潮霉素（Hyg）是否表达。构建示意图如图3.1所示。3.1attBPCR产物构建示意Fig3.1ConstructionoftheattBPCRattBPCR产物内各元件的物表达载体pH7WG2D。所需引物如下： 1dNTPmixture（2.5 1.610pyrobest 2F（10 1R（10 1PyrobestDNA 0.2 13.2 20 10min PCR产物纯attBPCR产物构 15 入门载体碱法提取重组质粒酶切鉴序列测经酶切鉴定的阳性质粒送桑尼公司进行DNA(ABI3730XLDNAyzer,USA)。引物为M13正反向引物。结果通过VectorNTI软件分析验证序列的正LR反应构建双元表达载0.5mlEntryclone（约30 6 2 825℃，842℃，60sec后立即置于冰上，237℃，225100mg/LPCR 0.1 1 1dNTPmixture（2.5 1.610PCR 2 0.2 14.1 20 3 30 30 3 15 序列测经酶切鉴定和PCR鉴定的阳性质粒送桑尼公司进行DNA(ABI3730XLDNAyzer,USA)。结果通过与VectorNTI软件构建的重组表达载体序列比对以验结果与分attBPCR构建结A

Nos-

3.2attBPCR产物及其内部各元件电泳检测结(A)纯化的trpC。M，DNAmarker（Fermentas,SM0311；(B)经纯化的attBPCR产物检测。DNAMarker(Takara，D517A)Fig.3.2ElectrophoresisresultofattBPCRproductanditsTheresultofunprocessedtrpC.M,DNAMarker（Fermentas,TheresultofpurifiedattBPCRproduct.M,DNAMarker(Takara,大小2406bp相吻合。可以用于Gateway克隆入门载体的构建。 图3.3入门载体质粒提取电泳图M，DNAMarker(Takara，D517A)；1-8，入门载体Fig.3.3ElectrophoresisresultofEntryVectorsM，DNAmarker（Takara，D517A);1-8，entryvectors 3.4质粒酶切鉴定电MluⅠ酶切重组质粒。M为DNAMarker(Fermentas,SM0311)；1-3为酶切后的阳性质粒Fig.3.4Electrophoresisresultof binatedplasmidsdigestedwithrestrictionenzymeResultof binatedplasmidsdigestedwithMluⅠ.M,DNAMarker(Fermentas,SM0311);1-3,binatedplasmidsdigestedwith1%琼脂糖凝胶电泳检测显示，构建的入门载体大小与英骏公司VectorNTI构建的入门载体图谱大4953bp相吻合，初步表明入门载体构建成功。MluⅠ酶切结果与预测大小（4021bp+932bp）一致进一步确证所选克隆为阳性克隆，待结果最终验证序结本次实验送出pDONRG1HYG-2和pDONRG1HYG-3两个质粒进序，通过与软软件VectorNTI构建入门载体示意图。T7T7EntryClone/pDONR221/PCRProductoftrpC+Hyg+Nos-4953

rrnBT1transcriptionterminator3.5VectorNTI模拟构建目标载体图Fig.3.5TheconstructionofentryvectorbyVectorLRLR反应转化后经过酶切鉴定，根据构建图谱（图3.8酶切鉴定使用HindⅢ。酶 bp，琼脂糖凝胶电泳显示条带与预期一致。PCR鉴定结果果见3.6，PCR鉴定结果见图3.7。M1233.6目标质粒酶切鉴定HindⅢ酶切目标质粒。M，DNAMarker(Takara，D517A)；1-3为酶切后的阳性质粒Fig.3.6ElectrophoresisresultofdestinationplasmidsdigestedwithrestrictionenzymeResultof binatedplasmidsdigestedwithHindⅢ.M,DNAMarker(Takara，D517A); binatedplasmidsdigestedwithHindⅢ 3.7PCR鉴定电泳M,DNAMarker(Fermentas,SM0311)；1-2M,DNAMarker(Fermentas,SM0311);1-2,destinationplasmidsPCR

ExpressionClone/p7WG2D,1/pDONR221/PCRProductoftrpC+Hyg+N

3.8VectorNTI模拟构建目标载体图Fig.3.8TheconstructionofdestinationvectorbyVector小结与讨本章实验同样利用PCR和Gateway重组克隆技术构建了表达载体PKHyg，在入门克隆已正确的基础上，经过酶切鉴定和PCR鉴定表明载体构建成功。与第二章构一个真菌启动子，可能比35S更适合在真菌转中起始转录。Hamer等[93]曾系统研究构巢曲霉菌trpCPromoter，得出-82的上游序列是trpC转录必须的结构元件。本研究trpCpBARGPEG1pBARGPEG1Martin等[94]1993使用trpC作为真菌转载体的启动子已有很多例子。Rho等[95]使用ATMT法转化Magnaporthegrisea时，使用的筛选标记潮霉素就是置于trpC启动子之后。Ulrich等达。但trpC启动子序列长度在已公开的不同载体中有差异，本用trpC启动本章构建的载体的过程再一次说明Gateway重组技术的高效性。但是此法也有一定的缺陷性，即所要导入的目的载体必须包含attL位点。这使得一些载体的构建还需要通过传统的酶切连接方式进行，限制了Gateway技术的使用范围。另外，通过PCR连第四章不同表达质粒ATMT法转ATMT法是目前真菌遗传转化常用的法，借助此方法可以有效的研究真菌的代谢及生理现象的机理，定向改造真菌的遗传物质[33]ATMT法已成功转化黄萎病菌并获得转GFP的单孢[62]ATMT法转化棉花黄萎菌，将前两章构建的双元表达载体导入，为研究OTU的功能奠定基础。材料与方试剂与质InvitrogenBRoche公司；ASAldrichsigma公司；其他无机试剂购自杭州精细化工。菌种脱毒2d2mm×2mmPDA固体重复步骤2）一次切除菌丝尖端接种于不含放线菌酮的PDA黄萎菌RNA称取干燥菌体0.15g加入1mlTrizol后继续研磨至溶液澄清透亮，室温静置5min，使其充解12000rpm，5min加入等体积的氯仿，振荡混匀后静置吸取上清，重复步骤4）3-5次加入等体积的异丙醇，混匀后4RT-PCR1）0.5mlPCR 3 0.5 0.5DEPC- 2.75 6.7570℃,10min；4℃，5min后继续加入（dsRNA99℃,3min5min2min，继续加入5×M-MLV 2dNTP 0.5RNA 0.25M- 0.5 1042℃,60min；70℃,10min；4℃,52dNTP1.610×PCR2110.212.22094594305630 3072472104LB平板（含30µg/mlRif、50µg/mlGen）挑取单菌落，37℃,225rpm，过夜培养转移至50ml离心管中，4℃，5000g，8min20ml预冷的0.1MMgCl24℃，5000g，8min后弃上清分装成每管100µl后立即置于冰上，-80取农杆菌感受态置于冰上，5-10质粒酶切根据已有的研究，黄萎菌接种于含不同浓霉素B（50、100、150、200）PDA3个重复，25℃培养，连续观察菌落生长状况1个月。ATMT法转化棉花黄萎培养7-10d。划线活化菌种，28℃,LB平板（含100µg/mlSpec、30µg/mlRif、50µg/mlGen）上挑取单菌落接种与5mlLB液体培养基（含上述抗生素）225rpm，28℃过夜培养；培养4-6h至OD600=0.6；数，用IM液体培养基稀释至孢子浓度为106个/ml。100µl已活化的农杆菌GV3101100µl黄萎病孢子稀释液充分混匀后涂布于MM平板（含200µmol/LAS，25℃，培养2d；Cef，25结果与分0-21脱毒结

4.1脱毒菌株RT-PCR检测电泳SM0311；1,0-菌株totalRNAFig.4.1ElectrophoresisresultofEntrytothreedifferentconcentrationcycloheximide(0.5%,0.75%,1%,respectively).毒的存在，而阳性对照菌株0-21中提到的总RNA中可见目的条带扩出。理论上放线菌酮可以抑制蛋白的起始和合成，因此本实验最后采用1.0%浓度的放线菌酮处理的菌株0-21，以期其脱毒效果优于其他脱毒菌株便于后期研究VdCV1中OTU的功能及潮霉素浓度筛选实验结果分潮霉素的平板上菌丝开始生长，而含100150µg/ml潮霉素的平板上无菌丝生长。可见潮霉素浓度为100µg/ml可以完全抑制棉花黄萎菌菌丝的生长。考虑到随后的真菌转化实验采用的材料是黄萎菌分生孢子，结合已有文献，最后采用的初筛浓度是50µg/ml，待进一步筛选采100µg/ml。A

4.2质粒酶切鉴定电EcoRⅠ酶切重组质粒。M为Trans5KDNAMarker,1、3为重组质粒；2、4HindⅢ酶切重组质粒。M,Marker(Takara，D517A)；1-2Fig.4.2ElectrophoresisresultofplasmidsdigestedwithrestrictionResultof binatedplasmidsdigestedwithEcoRⅠ.M,Trans5KDNAMarker;1,3, binatedplasmidsdigestedwithEcoRⅠResultof binatedplasmidsdigestedwithHindⅢ.M,Marker(Takara，D517A);1-2, plasmidsdigestedwithHindⅢ对转化农杆菌后的质粒进行酶切鉴定，其中PHVcR4EcoRⅠ进行酶切成功。可用于下一步利用ATMT法转化黄萎菌。 PHVcR4质粒农杆菌转化黄萎菌结果4.3是带有PHVcR4的农杆GV3101与新鲜的黄萎菌脱毒菌株0-2148h后在诱导培养基上观察到的绿色荧光（4.3A，7天后发现有菌丝也有绿色荧光（4.3B。初步表明黄萎菌转化成功。与PKHyg质粒农杆菌转化黄萎菌结果相似。 4.3绿色荧光蛋白在黄萎菌转化子不同时期绿色荧光蛋白在分生孢子中表达（2d；(B) 绿色荧光蛋白在菌丝中表达（7Fig.4.3ExpressionofGFPatdifferentdevelopmentalstagesofV.GFPexpressioninconidia(2d);(B)GFPexpressioninmycelium(7小结与讨本研究采用ATMT法将不同质粒农杆菌转化棉花黄萎菌。PHVcR4质粒农杆菌转化能是：1）表达质粒中的目的片段未能整合到棉花黄萎菌组中，绿色荧光属于GFP瞬时表达；2）表达质粒中的目的片段整合进了棉花黄萎菌组，但启动子未启动潮霉素转录，导致具有绿色荧光的孢子和菌丝不具有潮霉素抗性。PKHyg质粒农杆菌转化黄萎菌时在荧光倒置显微镜下未见到绿色荧光，表明转化不成功，可能是PK7WG2D载体不适合用于农杆菌转化真菌。pBHt1质粒农杆菌转化黄萎菌不成功可能与农杆菌菌株为TrpC启动子和终止子，筛选标记为潮霉素，是文献[35]能够经AGL-1农杆菌转化真菌的载体。pBHt1质粒是从中国菌种保藏中心购得，采用几种方法都很难从农杆菌C58C1致不能将该质粒转入到已购得的菌株AGL-1或GV3101，因此本研究还有待后续验证和 第五章OTU蛋白沉默抑制功能研RNA沉默就是组的免疫系统[99]。真菌CHV1的P29蛋白是从真菌发现的第一个沉默抑制子且能够抑制GFP序列引起的转GFP本氏烟16C的绿色荧侵染性的特性[28]。由此联想OTU蛋白是否具有抑制沉默的功能。因此本章进行材料与方酶与试潮霉素B购自Roche公司；AS购自Aldrich公司；其他无机试剂购自杭州精细LB平板（30µg/mlRif、50µg/mlGen）划线活化菌种，28℃,48挑取单菌落，37℃225rpm，过夜培养1:100100mlLB培养基，30℃4转移50ml离心管中，4℃，5000g，8min后弃上清4℃，5000g，8min2ml预冷0.1MCaCl2和甘油溶液（3ml0.1MCaCl20.5ml甘油预先混匀取农杆菌感受态置于冰上，5-101min，42℃1800µlLB，225rpm，28℃2100µg/mlSpec、30µg/mlRif、50µg/mlPCR 0.1 1 1dNTPmixture（2.5 1.610PCR 2 0.2 14.1℃3℃30℃30℃3℃154

20农杆菌Voinnet的方法[100,101]PHVcR4，PHCm1％W/V)的比例分别接种于含三抗（100μg/mlSpec，30μg/mlRif50µg/mlGen）LB液体培养基中12h（28℃，200rpm1％W/V10mM2-（N-吗啉）-乙基磺酸（MES）20μM乙酰丁香酮（Acetosyringone）的三抗（100μg/mlSpec，30μg/ml10min，4℃离心收集菌体，并将沉淀菌体重新悬浮于浸润缓冲液中，调整浓度使其OD为1.0左右，室温放置3h。pBI121-35S-GFP，pBI121-Fny-2b1％W/V)的比例分别接种200rpm1％W/V10mM2-（N-吗啉）-乙基磺酸（MES）20μM乙酰丁香酮（Acetosyringone）的三抗（30μg/mlKan，30μg/mlRif50μg/mlGen）mlLB培养基中，振荡培养（28℃，200rpm）至对数生长期，6000rpm，15min离心收OD1.0左右。分别将35S-GFPpBI121-Fny-2b1：1进行混合，283h。取1ml注射器，去掉针头吸取农杆菌菌液待用。选取5-6周龄4-6片真叶的处理两片叶片，一片叶片上左右对称注射两个区域，每个处理用163天后，用长波紫外灯(BlackRaymodelB-100A;UV)GFP荧光的分布情况，并用带有紫外和黄色滤光片的数码相机(NikonD70S)拍照记录结果与分瞬时表达载体对GFP转本生烟16c的GFP表达的影图5.1OTU瞬时表达对本生烟16C沉默系统的影1,Cm3days;2,Cm6days;3,Cm9days;4,OUT,3days;5,OUT,6days;6,F2b+GFP,Fig5.1.EffectofOTUproteinsonlocal1,Cm3days;2,Cm6days;3,Cm9days;4,OUT,3days;5,OUT,6days;6,F2b+GFP,9pHCm3eGFP摄看图暗红色不明显，故增加第9天采用普通相机拍摄能显示浸润区暗红色，表明阳性对照35S-GFP与35S-F2b农杆菌浸润区为亮绿色，表明浸润区GFP的沉默得到浸润了pHVcR4质粒农杆菌植株浸润区第3天后比未浸润区绿色稍亮，表明质粒所带GFP在浸润区有表达但第6天后也变为暗红色表明pHVcR4质粒与对照pHCm质粒一样质粒GFP序列在浸润区已成功诱导的植物的沉默作用，从而使转GFP的植物绿色荧光蛋白系统沉默，不能表达GFP蛋白。小结与讨本研究发现带有GFP的Gateway双元表达载体可以用于沉默抑制研究。由此充分发挥了Gateway双元表达载体的快速成构建载体的功能。另一方面，将待研究基因与GFP整合在一个载体中，减少了构建多个载体的烦锁，大大节约研究时间。当然，对于Gateway双元表达载体而言，将GFP全长序列改造为GFP部分序列，本研究发现OTU没有抑制烟草植物沉默的功能。虽然OTU具有抑制是同一途径；也可能与烟草植物不是这一真菌的OTU的寄主有关。本研究结果第六章总结与株，进行比较分析，并对OTU蛋白是否具有抑制沉默的功能进行了探索。得到了如的Gateway双元表达载体可以用于沉默抑制研究ATMT方法转化真菌是真菌遗传转化研究的一条新途径[33]。在具体的转化过程是GV3101和C58C1，未使用目前最多转化成功率最高的菌株AGL-1，显然以后的[33]PH7WG2D转化时可以观PK7WG2D转化时未见绿色荧光表达。实验后期采用的真菌ATMT载体pBHt1由于包含在农杆菌菌株中，常规方法未能获得其质粒。随后的研究应该AGL-1进行转化着手。启动子影响因素方面，本实验已先后尝试两种启动子—35StrpC对棉花黄萎菌进行转化，但效果都不明显，随及[1].我国棉花黄萎病研究进展[J].棉花学报,1995,7(4):243-[2].棉花黄萎病的研究进展[J].农业技术与装备,2011,206(2):15-[3]郑敬业.我国棉花黄萎病研究文献计量分析[J].农业学,2008,20(6):47-[4].棉花黄萎病的研究进展[J].农业科技通讯,2009(5):91-[5]张绪振,张树琴,棣,等.我国棉花黄萎病菌种的鉴定[J].植物病理学报,1981,11(3):13-20[6],高智谋,曹君,等.棉花黄萎病菌菌丝生长和产孢量的影响因素研究[J].农业科学,2006,34(17):4330-4331[7]毛岚,宋培玲,杨家荣.ISSR分析[J].西北农林科技大学学报,2009,37(5):149-154[8].真菌的研究进展[J].广西农业科学,2005,36(3):280-ChoiG.HandNussDLNuss.HypovirulenceofchestnutblightfungusconferredbyaninfectiousviralcDNA[J].Science,1992,257(5071):800-803HongY,etal.Multiple esinanisolateoftheDutchElmdiseaseOphiostomanovo-ulmi[J].Virology,1999,258(1):118-DengFandG.Boland.AsaliteRNAofOphiostomanovo-ulmimito3ainhypovirulentisolatesofSclerotiniahomoeocarpa[J].Phytopathology,2004,94(9): XieJ,etal.Characterizationofdebilitation-associatedmycoinfectingtheplant-pathogenicfungusSclerotiniasclerotiorum[J].JGenVirol,2006,87(1):241-249 ZhaoT,HavensWMandGhabrialSA.Diseasephenotypeof-infectedHelminthosporiumvictoriaeisindependentofoverexpressionofthecellularalcoholoxidase/RNA-bindingproteinHv-p68.Phytopathology,2006,96(3):326-332LiuW,DunsGandChenJ.GenomiccharacterizationofanovelpartitiAspergillusochraceus[J]Genes,2008,37(3):322-StraussEE,LakshmanDKandTavantzisSM.MolecularcharacterizationofthegenomeofapartitifromthebasidiomyceteRhizoctoniasolani[J].JGenVirol,2000,81(2):PreisigO,etal.AnovelRNAmycoinahypovirulentisolateoftheplantDiaportheambigua[J].JGenVirol,2000,81(12):3107- KwonSJ,etal.MolecularcharacterizationofadsRNAmyco,Fusariumgraminearum-DK21,whichisphylogeneticallyrelatedtohypoesbuthasagenomeorganizationandgeneexpressionstrategyresemblingthoseofplantpotex-likees[J].MoleculesandCells,2009,28(1):73-74CastroM,etal.Adouble-strandedRNAmycoconfershypovirulence-associatedtraitstoBotrytiscinerea[J].FEMSMicrobiolLett,2003,228(1):87-91MaejimaK,etal.Completenucleotidesequenceofanewdouble-strandedRNAfromthericeblastfungus,Magnaportheoryzae[J].ArchVirol,2008,153(2):389-391 陈隆钟,等.颗粒的存在与其对水稻纹枯病菌的影响[J].JOURNALOFXINJIANGUNIVERSITY,2004,21(Supp):2-9LiuC,LakshmanDKandTavantzisSM.Quinicacidinduceshypovirulenceexpressionofahypovirulence-associateddouble-strandedRNAinRhizoctoniaCurrGenet,2003,43(2):103- CaoYF,etal.GenomiccharacterizationofanoveldsRNAdetectedinthephytopathogenicfungusVerticilliumdahliaeKle