中药软肝饮对诱导的肝纤维化大鼠信号通路的影响 3700字

中药软肝饮对诱导的肝纤维化大鼠信号通路的影响3700字【摘要】[目的]研究中药软肝饮对CCl4诱导的大鼠肝纤维化肝脏TGF-1及Smad3，Smad7叙述的影响，探讨其抗纤维化的作用机制。[办法]Wistar大鼠40只，随机分成正常对照组，模型对照组，软肝饮治疗组，鳖甲软肝片对照组，采用CCl4背部皮下注射构建肝纤维化模型，行HE和VG染色，光镜下察看肝组织肝纤维化程度。同时免疫组化SABC办法检测各组TGF-1、Smad3和Smad7的叙述。[结果]与正常对照组相比，模型组TGF-1、Smad3叙述明显增强，Smad7叙述明显下降。经软肝饮治疗后大鼠肝脏TGF-1叙述比模型组减弱。软肝饮同时下调Smad3的叙述，上调Smad7的叙述。另外，软肝饮组大鼠肝脏病理变化显著改善。[结论]肝炎平对大鼠肝纤维化肝脏TGF-1/Smad信号通路有明显的影响，能抑制CCl4诱导的大鼠肝纤维化，其作用机制可能为抑制TGF-1叙述，下调Smad3及上调Smad7的叙述。

【关键词】软肝饮;TGF-1/Smad信号通路;肝纤维化

肝纤维化(hepaticfibrosis，HF)是多种原因引起的慢性肝损伤的共同病理改变，其特征是纤维增生和降解不平衡，纤维组织在肝脏过度沉积的结果[1]。研究证实，肝星状细胞(hepaticstellatecells，HSC)活化和转型在肝纤维化中发挥关键作用，HSC的激活在HF发生、开展中处于中心地位[2-3]。而TGF-b是促进肝纤维化开展的最重要的细胞因子之一,它可与肝星状细胞外表的受体结合,通过激活Smad通路,从而促进胶原等细胞外基质的合成和分泌[4]。Smad家族是TGF-b1细胞内传导的通道，有研究发现[5-6]TGFb-Smad信号转导通路在肝纤维化的发生开展中起着重要的作用，软肝饮的抗纤维化作用亦可能与TGF-1/Smad信号通路有关，为了探讨其抗肝纤维化作用的机制，我们采用CCl4诱导大鼠肝纤维化模型，用免疫组化办法检测TGF-1、Smad3、Smad7的叙述，察看软肝饮对肝纤维化时肝脏TGF-1/Smad信号通路的影响。

1材料和办法

1.1材料

动物：同一品系清洁级健康Wistar大鼠40只，雄性，质量(130～150g)及普通饲料均由安徽中医学院实验动物中心提供。药品和主要试剂：(1)软肝方(组成:鳖甲50g、黄芪50g、柴胡25g、丹参50g、川芎34g、莪术34g)由本院药剂科提供，临用前用双蒸水稀释成不同浓度备用。(2)CCl4，购自南京建成生物有限公司(批号：10006418)。(3)鳖甲软肝片由内蒙古福瑞中蒙药科技股份有限公司生产(批号：20221106)，研制成粉末，双蒸水溶解成含药1ml/100g(0.6g/kg)混悬液。(4)TGF-1、Smad3、Smad7免疫组化试剂盒均购自武汉博士德生物项目有限公司。(5)花生油，购自超市。

2办法

2.2.1分组

将40只Wistar大鼠(雄性、体重量130～150g)随机分成4组:正常对照组10只,CCl4肝纤维化模型组10只，软肝饮治疗组10只，阳性(鳖甲软肝片)对照组10只。

2.2.2动物模型制备

将CCl4与高压灭菌花生油按1：9比例配成10%油剂，第1～4周，除正常组外，其他各组大鼠按0.5ml/100g背部皮下注射10%CCl4花生油溶液，每周两次。5～13周，正常组和CCl4肝纤维化模型组给予生理盐水，软肝饮组大鼠每天给予软肝饮灌胃1次,剂量为2.0g/kg大鼠体重(相当于临床用药量的16倍)。阳性对照组每天给与鳖甲软肝片1ml/100g(0.6g/kg)灌胃1次。各组动物每周称重一次，根据体重变化调整给药量。第13周末，末次给药24h后，全部大鼠股动脉放血处死,留取血液及全部肝脏,每只大鼠取相同部位肝脏用10%中性甲醛固定,残余-80°C低温冰箱保留;血液1500rpm离心后取血清置于-80°C低温冰箱保留。

2.3免疫组化半定量判断指标

光镜下察看肝脏病理变化并参照王宝恩等[7]肝纤维化分级法进行胶原纤维增生程度半定量分析。免疫组化SABC(即链酶亲和素-生物素-酶复合物Strept-Avidin-Biotin-Complex)法检测TGF-1、Smad3、Smad7，结果判定:采用Bresalier[8]半定量公式稍加修改判断染色结果。切片在10倍物镜视野下察看，随机计数5个视野中各染色强度细胞数的百分比。根据细胞染色强度分为四级，并分别计分;阴性，细胞无着色(0分);弱阳性，细胞着色为浅黄色(1分);中度阳性，细胞着色为棕黄色(2分);强阳性，细胞着色为棕褐色(3分)，计算每一强度的视野数，根据以下公式计算每张切片的平均染色强度:IS(intensityscore)=∑{(0×F0)+(1×F1)+(2×F2)+(3×F3)｝，Fi=%10×视野数(i=0，1，2，3)。

2.4统计学处理

用SPSS11.0软件包统计分析，计量资料以mean±SD表示，方差齐用多组间均数两两比拟用单因素方差分析，LSD法，方差不齐用秩和检验，多样本两两比拟用Nemenyi法进行统计分析，双侧a=0.05为显著性检验水准。

3结果

3.1病理组织学改变

正常组肝细胞以中央静脉为中心向四周呈放射状排列，结构正常。模型组肝组织病理损害严重，正常结构被破坏，肝索排列紊乱，肝细胞明显肿胀变性，其中多为脂肪变性，肝小叶中央区明显坏死。间质内有炎性细胞浸润，胶原增生显著，增生结缔组织分割肝小叶，接近形成假小叶。软肝饮治疗组与模型组相比，肝组织结构破坏不明显，肝细胞脂肪变性程度显著减轻，可见少量炎性细胞浸润，肝细胞坏死减轻，少见纤维结缔组织增生(图1A，B)。

3.2免疫组化结果

TGF-1在正常组肝组织肝窦处有阳性着色，与正常组比拟模型组TGF-1叙述明显增强(P3.3各组大鼠肝组织Smad3和Smad7的叙述

正常对照组肝组织可见少量Smad3弱阳性叙述，主要分布于血管壁;模型组Smad3强阳性叙述细胞数明显增多，主要分布于纤维化汇管区及纤维间隔里的梭型细胞间质和局部肝实质细胞的胞质;各治疗组肝组织中仅梭型细胞间质的Smad3呈中度阳性叙述(图3A)。其中模型组阳性叙述细胞的平均染色强度积清楚显高于各治疗组(图3B)，二者比拟均，P0.05二者无显著性差别。Smad7在正常对照组大鼠肝脏组织仅少量阳性叙述;模型组肝实质细胞呈弱阳性叙述(图4A)，各治疗组大鼠肝脏实质细胞广泛叙述Smad7(图4B)。其中模型组Smad7阳性叙述细胞平均染色强度积清楚显低于各治疗组，分别比拟二者均P0.05无显著性差别(表1)。表1大鼠肝组织TGF-1，Smad3，Smad7的叙述(略)

4讨论

转化生长因子-1(TGF-1)是影响活化肝星状细胞(HSC)、促进胶原等细胞外基质合成，加剧纤维化形成的主要生物因子，活化后的TGF-1结合于特异性受体后进入信号转导途径，发挥其生物学作用。迄今为止，Smad蛋白是TGF-1受体胞内激酶的唯一底物，它既是胞内信号分子，又有转录激活作用。Smad蛋白家族中的Smad3与Smad7是TGFb受体后信息分子，参与调控细胞的增生、转化、合成、分泌和凋亡。其中Smad3是HSC活化的重要媒介，而Smad7是TGFb信号的拮抗因子[9]。

祖国医学认为，气虚血滞为肝纤维化之本，湿毒热邪稽留血分为标，肝无血养而失柔，治那么要以活血益气、养血柔肝为根底，如余邪未清，佐以祛邪。软肝饮主要由黄芪、丹参、莪术、鳖甲、柴胡等多味中药组成，具有活血化瘀、益气散结、疏肝利胆的成效，正是针对肝纤维化的病理环节组方。本结果显示，软肝饮治疗组肝纤维化程度较模型组明显减轻，软肝饮能够显著抑制TGF-1，拮抗胞内关键信