slaf-遗传图谱结题报告无参考基因组

高密度遗传图谱构建及QTL定位项结题报客户单位 报告单位 百迈客生物科 联系人 传真 XXXXXXXX项目概 项目研究背 项目报告重要名词及术 材料基本信 合同关键指标情 项目执行情 分析结果概 项目流 酶切方案设 文库构建及信息分析流 生物信息学分析结 酶切方案设 数据统计与评 3.2.1质量值分布检 3.2.2碱基分布检 3.2.3数据产出和质量统 实验建库评 比对效率统 酶切效率评估统 片段选择评 SLAF开 SLAF多态性分 多态性SLAF编 遗传图谱构 上图标记筛 绘制连锁 连锁分 遗传图谱评 遗传图谱基本信息统 上图标记SNP信息统 偏分离标记信息统 上图标记深度信息统 上图标记完整度统 单体来源评 连锁关系评 性状关联分 QTL分 3.7数据可视 项目总 数据查 结果文件查看说 SVG文件格式的查 附件1生物信息分析流 附件2英文材料方 项目概项目研究背遗传连锁图谱（GeneticMap），是指分子标记在上的相对位置与遗传距离，通常以或DNA片段在交换过程中的分离频率厘摩（cM）来比较组，辅助组组装等科研工作。本项目利 百迈客生物科技自主研发的SLAF-seq[1]技术HighMap[2]XX

遗传分离群体（2

个子代）密度分子，进行遗传图谱构建和相关性状的QTL关联分析，获得与性状紧密关联的分子和候选区域。项目报告重要名词及术英文英文名中文名Pair-end SLAF经过SLAF-seq建库产生的特异酶切片段，一个酶切SLAFPolymorphic 多态性SLAF群体中存在多态性的SLAF，多态性的SLAF中Repetitive 重复序列区中的 位于重复序列区的SLAF，在数据上的表现的深度远高于平均水平或者超过物种倍性的DNAbinant两个标记间的连锁强度，LOD=3表示两个标记的连锁1000倍Map两个分子标记之间的遗传距离，单位为厘摩1cMGenetic分子标记在上的相对位置与遗传距离通常以基因或DNA片段在交换过程中的分离频率厘 数量性状 控制数量性状的一个片QTLMapQTL定 根据标记型与数量性状表型，应用一定的统计QTL位置（以重组率材料基本信项目执行情 XXXXXX XXXXXX XXXXXX分析结果概2项目相关信 具体情 备酶切方 酶切片段长 364-414酶切预测 CleanGCSLAF项目流酶切方案设根 组[3]大小以及GC含量等信息，最终选取棉花组作为参所用参考组地址 所用参考组具体信息如下表所示表3参考组具体信物物GC含棉 利用自主研发的酶切预测软件对参考组进行酶切预测选择最适酶切方酶切片段在组上尽量均匀分布酶切片段长度与具体实验体系的吻合程度最终获得酶切片段（SLAF）数满足预期数文库构根据选定的最适酶切方案，对检测合格的各样品组DNA分别进行酶切PCRIllumina平台。为评估建库实验的准确性，选用晴水稻（OryzasativaL.japonica）作为对照（Control）进行相同的处理参与建库和。1SLAF信息分析流利用Dual-index对得到的原始数据进行识别，得到各个样品的reads。对过滤完接头的reads进序质量和数据量的评估。通过Control数据的reads聚类的方法，在亲本和子代中开发SLAF，寻找多态性的SLAF[1]。对多态性的SLAF进行型编码后，通过HighMap作图软件[2]，构建遗传图谱，进行图谱评估。通过QTL定位软件进行QTL关联分析获得与性状紧密关联的SLAF和关联区域。生物信息分析流程见下图，详细流程见附件1。2生物信息学分析结酶切方案设2.1义为SLAF预测可得到350,000个SLAF具体酶切方案信息见下表4SLAF

364-414 InsertSize：酶切片段的长度范围；SLAFNumber：酶切方案预测的可以得到的SLAF数数据统计与当read中含有的N的含量超过该条read长度比例的10%质量值分布检。，碱基识别（BaseCalling）过程中每个碱基都会得到一个质量值，用于评估该碱基的准确性质量值是评估高通量单碱基错误率的重要指标质量值越高对应的碱基错误率越低。碱基错误率e和质量值Q的对应公式：，如果某碱基出错的概率为0.001，则该碱基的质量值Q应该为30。本项目母本样品(客户编号75)样品质量分布情况见下图：。，图3质量值分布注：横坐标为reads的碱基位置，纵坐标为单碱基的质量值。前150bp为双端序列的第一端reads的质量值分布，后150bp为另一端reads的质量值分布。同一个位置对应的不同质量的reads，颜碱基分布检碱基类型分布检查用于检测有无、C序或者建库所带来的，并且会影响后续分析。由于F-seqreads为AR本项目母本样品(客户编号75)样品碱基分布情况见C含量分布基本正常。4A，红色代表碱基C，橙色代表碱基G，蓝色代表碱基T，灰色代表中识别不出的碱基N。前125/150bp为双端序列的第一端Reads的碱基分布，后125/150bp为另一端reads的碱基分布。如第一个位置代表的reads在第一个碱基的 数据产出和质量统对各样品的数据进行统计，包括reads数量、bases数量、Q30和GC含表5各样品数据统计1-M2-PSampleIDBMKID：百迈客对样品的统一编号，P代表父本，MTotalReadsreadsTotalBases：各样品的basesQ30Percentage：质量值大于或等于30的碱基所占百分比；GCPercentage：结果中G和C两种碱基所占总碱基的百分比；Total：整体数据信息(除control数据外)实验建库评本实验，晴水稻（OryzasativaL.japonica）作为Control，通过对Control数据的评估实验过程是否正常，确定酶切方案实施的有效性。本项目中Control所用晴水稻（OryzasativaL.japonica），组大小为382.8Mb，下比对效率统用于评估实验建库准确性的Control获得538,614reads的数据量，通过SOAP[5]软件将Control的reads与参考组进行比对，比对结果见下表，90.37%，比对效率基本正常。表6Controlreads比对结果统计

MappedReads

MappedReads

Unmapped Single-EndMappedReads：一条序列两端在参考组上的比对跨度小于50bp，或大于1kb的reads占readsUnmappedReads：未比对到组上的reads占总reads的比例Single-EndMappedReads和UnmappedReads来源：由于接头过滤不全，reads中碱基错配，异常的插入片酶切效率评估统酶切效率是评价简化组实验是否成功的一个关键指标组上的复杂开。通过统计reads插入片段中残留酶切位点的比例，统计比例越低，酶切效率越好[6]。从下表中可知，本项目Control数据的酶切效率为95.23%，表明酶7ControlDigestion Digestion DigestionNormally：reads中间不存在未被酶切开的酶切位点；DigestionPartly：reads中间存在未被酶切开的酶切位点；Total：reads片段总数。片段选择评根据ControlPair-endmappedreads在组中的位置计算SLAF的实际长度，Controlreads插入片段分布见下图5ControlreadsreadsreadsSLAF开利用自主研发的SLAF开发流程将同一个位置的reads作为一个，本项目共开发210,484个SLAF，SLAF亲本平均深度8SampleBMKSLAF1-M2-PSampleID：样品信息单中样品编号；BMKID：百迈客对样品的统一编号；SLAFNumber：SLAF数量；TotalDepth：reads数；AverageDepth：平均每个SLAF上该样品的reads数SLAF多态性分共开发得到的210,484个SLAF，各类型SLAF结果统计见下表。从下表可以看出，多态性SLAF共有47,832个，多态性比例达到22.72%。表9SLAF类型统PolymorphicSLAF：表示在一个SLAF中存在多态性位点，多态性位点主要包括是SNP和InDel；Non-PolymorphicSLAF：表示在SLAF中没有多态性位点；RepetitiveSLAF：指位于重复序列区的SLAFTotalSLAF：所有的SLAF多态性SLAF编，为了便于后续的遗传学分析，需要对多态性进行型编码型编aa（父本）和bb（母本），子代型ab则表示该样品在这个标记的编码类型型适用于近交群体（F2，RIL，DH），其余标记适用于杂交群体（如：CP），表10型编码规

hh,hk,kk，- nn,np，- PaternalGenotype：父本型；MaternalGenotype：母本型；OffspringGenotype：子代型；--表示子代型缺失码规则对本项目获得的47,832个多态性SLAF进行分型有37,603个成功编码，各类型统计分布见下图：图6各个类型分布注：横坐标表示所有的类型，纵坐标代表该类型个数9.59%。遗传图谱构上图标记筛为保证遗传图谱质量，将多态性SLAF按照以下规则进行过滤SNP数目大于5。由于SNP长度为200bp，出现过多的SNP被亲本完全纯合的多态性的剔除完整度过滤。筛选型至少覆盖所有子代70%以上的标记（该准根据实际标记数据量进行适当调整100代中至少有70个有确定型。QTL定位有影响。借鉴多数文献对偏分离标记处理方法对严重偏分离（卡P＜0.01）的多态性标记进行过滤。最终得到可用于作图的SLAF4765个。各类型统计见下表表11用于图谱构建的SLAF类型统 SLAF SLAFNumber：用于构建遗传图谱的SLAF数；Percentage：各类型SLAF占有效SLAF总数百分比；Total：有效SLAF总数。绘制连锁将筛选出的4765个SLAF，通过两两之间计算MLOD值[7]，设置最小群与最大群数预设MLOD值区间按的MLOD值从小到大排列，之间MLOD值最高的分在同锁群过滤掉与其他SLAF的值均低于5的，定位为上图标记（Marker）12MarkerMarkerLGIDIDMarkerNumber连锁分HighMap[2]Marker的线性排7遗传图谱评遗传图谱基本信息统Marker13Group<5LinkagegroupID：连锁群编号，本项目与组的编号一致Gap<5cM：gap5cMgap数的比例，比例越高，代表图谱越均匀；MaxGapgap，最大gap越小，表示图谱越均匀；Total：所有连锁群总的数、总图距、平均图距和最大的Gap信息。上图标SNP信息统SNP5,323SNPLinkageGroup LinkageGroupIDSNPNumber：SNPMarker个数；Tri/Trv：SNP转换/SNP颠换；TotalSNP标记转换/颠换总数。偏分离标记信息统偏分离标记（Segregationdistortion）普遍存在，并且会影响图谱构建结果及15LinkageGroupMP00000060600000020200000000000000000000000001014040000LinkageGroupID：本项目连锁群编号；M：在这条连锁群上子代型偏向母本的SLAF个数P：在这条连锁群上子代型偏向父本的SLAF个数上图标记深度信息统16SampleBMKMarker1-M2-PAverageofSampleID：样品信息单中样品编号；BMKID：百迈客对样品的统一编号；MarkerNumber：各样品的上图标记数；TotalDepth：各样品上图标记总深度；AverageofOffspringMarker数，上图标记总深度的平均值（所有标上图标记完整度统标记的比例）如下图所示。本项目完整度平均为98.06%，保证了图谱分型图8所 上图标记完整性分布单体来源评双交换位点产生的原因有两个：1）组的重组热点区域；2）由于导致的定的问题，通常双交换控制在3%以下，LG1的单体来源评估如下图所示。本项目每个中较大区段的来源会保持一致，说明遗传图谱质量高。9LG1注每一个横行代表一个er按照在连锁群上的位置顺序排列每一列代表一个样品中的一条，绿色代表来自母本，蓝色代表来自父本，红色代表杂合分型，同一列颜色发生变化的位置即为重组事件发生的位置。17Group03000000LinkageGroupID：连锁群ID；SingletonPercent：双交换的位点比例；MissingPercent：缺失的比例。连锁关系评10LG1MarkerMarker重组率越小，颜色越接近黄色，距离越远的Marker重组率越大，越接近紫色。性状关联分QTL分本项目采用/qtl进行TL定位分析，首先通过T检验000次设定阈值，先考虑0.99置信度对应的阈值，若没有定位区间则考虑0.95置信度对应的阈值；若没有定位区间则考虑0.90置信度的阈值。若仍没有结果则不考虑手动降低阈值到3.0；若3.0没有区间则降到2.5；若2.5没有区间则降到2。18GroupGroup38--39

LODthreshold：该性状的关联阈值；LinkageGroupID：连锁群编号；MaxLOD：该性状的关联的最大LOD值；QTL分布图，19QTLer的排列顺序，左纵坐标是LODmarker对应的LOD值，红线表示marker区域。3.7数据可视结合上述内容，将图谱基本信息，SLAF信息，QTL绘制到CircosSLAFSLAF标记越多，颜色越深；第20Circos项目总，数据总结：本项目共获得1253.3Mbp数据平均Q30为90.87%，GC含量40.43%，样GC分布正常。综上所述，数据量、质量均达到，实验建库评估总结：Control数据的双端比对效率为90.37%，酶切效率为95.23%，SLAF建库正常。酶切方案总结：本项目通过组进行方案预测，选择Hpy166II+EcoRV-HF酶切组合进行酶切，SLAF长度选择在364-414bp，预测到350,000个SLAF，SLAF在组各上分布基本均匀，多态性SLAF开发总结：本项目共获得210,484个SLAF，其中多态性SLAF有47,832个，共有37,603个成功编码，过滤前满足群体分离类型编码的数为21,153个，构建遗传图谱时有效多态性为9.59%。本项目共构建18条连锁群，上图4,155Marker，总图距为1,976.68cM，上图标记完整度为98.06%，发生双交换的比例为0.36%，亲本深度为114.81X，子代18.24X。18个连锁群的图谱和分型数据，以及14个数量性状表型数据，进行数量性QTL定位分析，14个性状MapQTL获得52个性状关联区域。数据查结果文件查看说 中有Readme.txt说明详细介绍了每个文件所代表的内容上传的结果数据文件多以文本格式为主（fa文件、txt文件、detail文件、xls文件等）。在Windows系统下查看文件推荐使用Editplus或UltraEdit作为文本浏览程序，否则会因文件过大造成死机在Unix或Linux系统下可以浏览较大的文本文件，用Less等操作命令可以顺利地查看。SVG文件格式的查SVGSVG插件。【参考文献SunX,LiuD,ZhangX,etal.SLAF-seq:anefficientmethodoflarge-scaleDenovoSNPdiscoveryandgenotyusinghigh-throughputsequencing[J].PloSONE,2013,8(3):e58700.LiuD,MaC,HongW,HuangL,LiuM,etal.ConstructionandysisofHigh-DensityLinkageMapUsingHigh-ThroughputSequencingData[J].PLoSONE,2014,9(6):e98855. DaveyJW,CezardT,Fuentes‐UtrillaP,etal.SpecialfeaturesofRADSequencingdata:implicationsforgenoty[J].Molecularecology,2013,22(11):3151-3164.KozichJJ,WestcottSL,BaxterNT,etal.Developmentofadual-indexsequencingstrategyandcurationpipelineforyzingampliconsequencedataontheMiSeqIlluminasequencingplatform[J].Appliedandenvironmentalmicrobiology,2013,79(17):5112-5120.LiR,LiY,KristiansenK,etal.SOAP:shortoligonucleotidealignmentBioinformatics,2008,24(5):713-ArabidopsisGenomeInitiative.ysisofthegenomesequenceofthefloweringplantArabidopsisthaliana[J].Nature,2000,408(6814):796.Stam.Constructionofintegratedgeneticlinkagemapsbymeansofanewcomputerpackage:JOINMAP.ThePlantJournal,19933(5):739-744.附件1生物信息分析流程以及软件介当read中含有的N的含量超过该条read长度比例的10%readsSLAF将产生的reads通过blat软件进行序列比对按照相似度90%进行聚类，groupSLAFSLAF，进行分子标记的开发。针对每一个SLAF，根据亲本深度大于10X的序列确定每个SLAF标记的型，要求每个型序列包含30%的子代信根据每个SLAF中SLAF标记的型的个数，区分SLAF的类型，其中有5个型以上的SLAF确认为在重复序列上的SLAF，2~4个型的SLAF为多态性SLAF，1个型的即为非多态的SLAF。对多态性的SLAF进对已经成功编码的SLAF标记进行过滤，筛选高质量的SLAF标记进行后续SNP2代完整度70%以上；3偏分离标记（p<0.01）;4亲本测序深度小于QTL与标记之间的重组率和MLOD而后根据MLOD值将分子标记分为不同的连Kosambi函数完成。QTLR/qtlCIMPermutationtest（P<0.05）QTL阈值的QTL区域。HighMap、HighMap是百迈客自主研发的高密度遗传图谱构建软件，HighMap构图过程主要包括连锁分群标记排序型纠错和图谱评估4部分采用多次排序JoinMap4.1JoinMap4.0。利用该构、R/qtlR/qtl是在实验群体中定位数量性状位点的一个可扩展的交互环境。它作为RR的一个附加包，R里面最基本的数学、统计以及作图功能。更可以方便使用者将一般的统计分析程序和QTL定位软件完美结合。目前的R/qtl版本，通过利用区间作图（EM算法），Haley-Knott回归和多重插补，包括了估算遗传图谱，鉴定型错误，进行单QTL组扫描，双QTL和二因组扫描。所SOAP代数据提供数据分析的软件包。当前，它包含有新型比对程序结构差异扫描程序（SOAPsv）和短序列片段reads从头开始组装程序BlatBlatTheBLAST-LikeAlignmentTool,类BLAST比对工具，由W.JamesKent于2002年开发。当时随着人类组计划的进展，把大量和个缺陷：速度偏慢、结果难于处理、无法表示出包含intron的定位。于是用于比较小的序列（如cDNA等）对大组的比对。Blast会把每一个比对作Blat把相关的呈共线性的比对结果连接成为更大的比对结果，exonsintrons。因此，在相近物种的同源性分析和EST分析中，blat得到了广泛的应用。2英文材料方SLAFlibraryconstructionandhigh-throughputAnimprovedSLAF-seqstrategywasutilizedinourexperiment.FortheXXEnglandBiolabs,NEB,USA)wereusedtodigestthegenomicDNA.Asinglenucleotide(A)overhangwasaddedsubsequentlytothedigestedfragmentsusingKlenowFragment(3´→5´exo–)(NEB)anddATPat37°C.Duplextag-labeledsequencingadapters(purified,LifeTechnologies,USA)werethenligatedtotheA-tailedfragmentsusingT4DNAligase.Polymerasechainreaction(PCR)wasperformedusingdilutedrestriction-ligationDNAsamples,dNTP,Q5®High-FidelityDNAPolymeraseandPCRprimers(Forwardprimer: 5’-CAAGCAGAAGACGGCG-3’)(purified,LifeTechnologies).PCRproductswerethenpurifiedusingAgencourtAMPureXPbeads(BeckmanCoulter, be,UK)andpooled.Pooledsampleswereseparatedby2%agarosegelelectrophoresis.FragmentsrangingfromXXtoXX（切胶范围）basepairs(withindexesandadaptors)insizewereexcisedandpurifiedusingaQIAquickgelextractionkit(Qiagen,Hilden,Germany).Gel-purifiedproductswerethendiluted.Andpair-endsequencing(Eachend125bp)wasperformedonanIlluminaHiSeq2500system(Illumina,Inc;SanDiego,CA,USA)accordingtotheSequencedatagrouandSLAFmarkeridentificationandgenotywereperformedusingproceduresdescribedbySunetal1.Briefly,low-qualityreads(qualityscore<20e)werefilteredoutandthenrawreadsweresortedtoeachprogenyaccordingtoduplexbarcodesequences.Afterthebarcodesandtheterminal5-bppositionsweretrimmedfromeachhigh-qualityreads,cleanreadswereclusteredbysimilarity90%.SequencesclusteredtogetherweredefinedasoneSLAFlocus3.Singlenucleotidepolymorphism(SNP)lociofeachSLAFlocuswerethendetectedparents,andSLAFswithmorethan3SNPswerefilteredoutfirstly.AllelesofeachSLAFlocuswerethendefinedaccordingtoparentalreadswithsequencedepth>XX-fold（亲本深度）,whileforeachoffspringthereadswithsequencedepth>X-fold（子代深度）wereusedtodefinealleles.Fordiploidspecies,oneSLAFlocuscancontainatmost4genotypes,soSLAFlociwithmorethanallelesweredefinedasrepetitiveSLAFsanddiscardedsubsequently.OnlySLAFswithtwotofouralleleswereidentifiedaspolymorphicandconsideredpotentialmarkers.AllpolymorphismSLAFslociweregenotypedwithconsistencyintheparentalandoffspringSNPloci.ThemarkercodeofthepolymorphicSLAFswereysedaccordingtothepopulationtypeXX（群体类型）,whichconsistofsegregationtypesGenotypescoringwasthenperformedusingaBayesianapproachtofurtherensurethegenotyquality1.Firstly,aposterioriconditionalprobabilitywascalculatedusingthecoverageofeachalleleandthenumberofsinglenucleotidepolymorphism.Then,genotyqualityscoretranslatedfromtheprobabilitywasusedtoselectqualifiedmarkersforsubsequentysis.{Sun,2013#26}Low-qualitymarkersforeachmarkerandeachindividualwerecountedandtheworsemarkerorindividualweredeletedduringthedynamicprocess.WhentheaveragegenotypequalityscoresofallSLAFmarkersreachedthecutoffvalue,theprocessstopped.High-qualitySLAFmarkersforthegeneticmapwerefilteredbythefollowingcriteria.First,averagesequencedepthsshould>X-foldineachprogenyand>XX-foldintheparents.Second,markerswithmorethanXX%missingdatawerefiltered.Third,thechi-squaretestwasperformedtoexaminethesegregationdistortion.Markerswithsignificantsegregationdistortion(P<0.05)wereinitiallyexcludedfromthemapconstructionandwerethenaddedlaterasaccessorymarkers.LinkagemapMarkerlociwerepartitionedprimarilyintolinkagegroups(LGs)bythemodifiedlogarithmofodds(MLOD)scores>5.Toensureefficientconstructionofthehigh-densityandhigh-qualitymap,anewlydevelopedHighMapstrategywastoordertheSLAFmarkersandcorrectgenotyerrorswithinLGs.4Firstly,binantfrequenciesandLODscoreswerecalculatedbytwo-pointysis,whichwereappliedtoinferlinkagephases.Then,enhancedgibbssampling,spatialsamplingandsimulatedannealingalgorithmswerecombinedtoconductaniterativeprocessofmarkerordering.5,6Briefly,inthefirststageoftheorderingprocedure,SLAFmarkerswereselectedusingspatialsampling.Onemarkerwastakenrandomlyinapriorityorderoftestcross,andmarkerswitha binationfrequencysmallerthanagivensamplingradiusareexcludedfromthemarkerset.Subsequently,simulatedannealingwasappliedtosearchingforthebestmaporder.Summationof binationfractionswascalculatedasillustratedbyLiuetal4.annealingsystemcontinueduntil,inanumberofsuccessivesteps,thenewlygeneratedmaporderisrejected.BlockedGibbssamplingwasemployedtoestimate binationfrequenciesoftheparentsaftertheoptimalmaporderofsamplemarkerswereobtained4.Theupdated binationfrequencieswereusedtointegratethetwoparentalmaps,whichoptimizethemaporderinthenextcycleofsimulatedannealing.Onceastablemaporderwasobtainedafter3-4cycles,weturnedtothenextmapbuildinground.Asubsetofcurrentlyunmappedmarkerswasselectedandaddedtotheprevioussamplewithdecreasedsampleradius.Themapalgorithmrepeatsuntilallthemarkersweremappedappropriay.The