动物细胞工程四

1、植物细胞工程常用的技术有哪些？2、植物组织培养的过程？3、植物组织培养的理论基础？4、植物体细胞杂交的过程和理论基础？复习：动物细胞工程专题2细胞工程动物细胞培养动物细胞融合生产单克隆抗体动物细胞核移植动物细胞工程常用技术动物细胞培养是其他细胞工程技术的基础思考与回忆：1.动物细胞全能性特点？

随着细胞分化程度的提高而逐渐受到限制，分化潜能变窄。细胞核仍具有全能性。2.能否用植物组织培养的方法使动物细胞发育成动物个体？

不能。动物细胞和组织在体外培养的过程中，伴随一定的组织分化，不管采用什么手段和培养条件，由于细胞的运动、变化，细胞发生结构功能变异，结果长时间的培养只能使单一类型的细胞保存下来，最终成了简单的细胞培养。动物细胞培养和本节内容：一、动物细胞培养情境：在治疗烧伤病人时，通常采用的方法是取烧伤病人的健康皮肤进行自体移植。但对一个大面积烧伤的病人来说，自身健康皮肤有限，使用他人皮肤来源不同，而且会产生排异反应。那么，怎样能获得大量的自体健康皮肤呢？1.动物细胞培养的概念：动物细胞培养就是从动物有机体中取出相关的组织,将它分散成单个细胞,然后,放在适宜的培养基中,让这些细胞生长和增殖.思考：动物细胞培养的目的是什么？与植物组织培养目的相同吗？动物的细胞培养的理论依据（原理）？

细胞增殖2.动物细胞培养的原理：细胞增殖定义：人们通常将动物组织消化后的初次培养称为原代培养。胰蛋白酶处理取出组织胚胎或幼龄动物器官组织剪碎单个细胞细胞悬液转入培养瓶内培养（贴壁生长长成单层细胞。有接触抑制现象）。①原代培养3：过程图示原代培养细胞悬液CO2培养箱强调一：细胞贴壁过程■细胞贴壁：在培养瓶悬液中分散的细胞很快就贴附在瓶壁上，称为细胞贴壁。■培养瓶或培养皿壁要求：表面光滑、无毒、易于帖附。■当贴壁细胞分裂生长到表面相互接触时,细胞就会停止分裂增殖，这种现象称为细胞的接触抑制。强调二：接触抑制定义义：：当原原代代培培养养的的细细胞胞处处于于接触触抑抑制制后后,用用胰蛋蛋白白酶酶处理理,使细细胞胞从从瓶瓶壁壁上上脱离离下来来,然后后加加入入新新的的培培养养液液,将细细胞胞分分离离稀稀释释,并并从原原培培养养瓶瓶内内转转接接到到新新的的培培养养瓶瓶内内,这这个个过过程程称称传代代培培养养.（（分瓶瓶培培养养的的过过程程）②传传代代培培养养▲细胞胞株株：：传传代代细细胞胞一一般般能能传传到到40-50代代，，遗传传物物质质一一般般不不会会发发生生改改变变，叫叫细细胞胞株株。。强调调：：细细胞胞系系、、细细胞胞株株▲细胞胞系系：：传传代代50代代以以后后不不能能再再传传下下去去，，部部分分细细胞胞遗传传物物质质发发生生了了改改变变，能能连连续续传传代代，，获获得得不不死死性性，，叫叫细细胞胞系系。。细胞胞株株和和细细胞胞系系的的区区别别：：细胞胞系系的的遗遗传传物物质质改改变变，，具具有有癌癌细细胞胞的的特特点点，，失失去去接接触触抑抑制制，，容容易易传传代代培培养养。。3.总总结结：：动动物物细细胞胞培培养养过过程程动物物胚胚胎胎或或幼幼龄龄动动物物的的组组织织、、器器官官细胞胞悬悬浮浮液液剪碎碎用用胰胰蛋蛋白白酶酶处处理理10代代细细胞胞转入入培培养养瓶瓶40-50代代细细胞胞传代代培培养养无限限传传代代单个个细细胞胞加培培养养液液稀稀释释传代10代以以内，遗传物质不改改变，保持正正常二倍体核核型。传代10-50代左右，，增长缓慢以以至于完全停停止，部分细胞核型型可能发生变变化（遗传物质可可能改变）为什么用胰蛋蛋白酶处理？？原代培养特点点：细胞贴壁、接接触抑制继续传代培养养少部分细胞胞获得不死性，细胞突变，遗传物质已经经改变，等同于癌细胞胞。原代培养4.动物细胞胞培养的条件件:1）无菌无毒毒的环境境：适宜的温度：：人和哺乳动物物细胞最适温温度为36.5±0.5℃。适宜的酸碱度度：液体合成培养养基：（糖、氨基酸））、促生长因因子、（无机机盐、微量元元素）等；通常还需需加入血浆、血清等等天然成分。4）气体环境境：2）营养：3）温度和pH：“95％空气气+5％CO2”的混合气体培培养箱。氧气是细胞代谢谢必须的；CO2维持培养液的的PH。对培养液和所所有培养用具具无菌处理；培养液中添加抗生素防止培养过程程中污染；定期更换培养养液以清除代谢产产物，防止对对培养细胞造造成危害。主要有：营养物质（糖糖、氨基酸、、无机盐、微微量元素、促促生长因子））动物血清（10%～20%）等培养液（液体体培养基）的的成分血清如：小牛血清清等血浆如：鸡血浆等等组织浸出液可用鸡胚胎浸浸出液,水解乳蛋白由乳白蛋白质质经水解得到到淡黄色粉末末,一般可配配制成0.5%溶液。天然培养基小资料根据细胞的生生理生化代谢谢特点,人工配配制而成,为细细胞提提供一一个近近似体体内生生存环环境,又便便于控控制和和标准准化操操作基本成成分各种碳碳水化化合物物(糖糖)、、氨基基酸、、维生生素、、无机机盐、、生长长因子子、激激素等等常用培培养液液几十种种人工合合成培培养基基小资料料问题3：为为什么么用胰胰蛋白白酶处处理？？问题1：为为什么么选用用动物物胚胎胎或幼幼龄个个体的的器官官或组组织做做动物物细胞胞培养养材料料？因为其其细胞胞生命命力旺旺盛，，分裂裂能力力强，，分化化程度度低。。问题2:为为什么么培养养前要要将组组织细细胞分分散成成单个个细胞胞？扩大细细胞与与培养养液的的接触触面积积，利利与细细胞吸吸收营营养。。动物组组织细细胞间间隙中中含有有一定定量的的弹性性纤维维等蛋蛋白质质，胰蛋白酶酶处理理动物物组织织，可可以使使动物物组织织细胞胞间的的蛋白白质和和细胞外外的其其他成成分酶酶解，，获得得单个个细胞胞。问题4：为为什么么用胰胰蛋白白酶处处理而而不用用胃蛋蛋白酶酶？动物细细胞培培养的的最适适PH值为，，胰蛋蛋白酶酶作用用的适适宜PH为，，胃蛋蛋白酶酶适宜宜PH为2.胃胃蛋白白酶在在PH为7.2-7.4的动动物细细胞培培养中中无活活性。。问题5：用用胰蛋蛋白酶酶处理理不会会把所所培养养的细细胞消消化掉掉吗？？控制好好时间间！长长时间间处理理当然然会损损伤细细胞。。问题6:动动物细细胞培培养液液的主主要成成分是是什么么？较较植物物组培培培养养基有有何独独特之之处？？问题7:动动物细细胞培培养能能否像像绿色色植物物组织织培养养那样样最终终培养养成新新个体体？主要成成分：：（葡葡萄糖糖、氨氨基酸酸）、、（水水、无无机盐盐）、、维生生素和和动物物血清清等。。独特特之处处有：：1、、液体体培养养基2、、成分分中有有动物物血清清等不能，动物物细胞培养养只能使细细胞数目增增多，不能能发育成新新的动物个个体问题8:动动物细胞培培养的原理理：细胞增殖。。问题9:目目前使用的的或冷冻保保存的正常常细胞通常常在10代代以内，为为什么？10代以内内的细胞遗传物质不不改变，保保持正常二二倍体核型型。5.动物细细胞培养技技术的应用用:1.蛋白质质生物制品品的生产如病毒疫苗苗、干扰素素、单克隆隆抗体2.应用于于基因工程程主要用于作作为受体细细胞3.检测有有毒物质，，判断某种种物质的毒毒性4.细胞的的生理、药药理、病理理研究如用于筛选选抗癌药物物植物组织培培养和动物物细胞培养养的比较：：比较项目植物组织培养动物细胞培养原理细胞的全能性细胞增殖培养基性质固体培养基液体培养基培养基特有成分蔗糖植物激素葡萄糖促--动物血清培养结果植物体细胞株、细胞系培养目的快速繁殖、培育无病毒植株获得细胞或细胞分泌蛋白取材植物幼嫩部分或花药胚胎或幼龄动物的器官或组织其他条件无菌无毒，适宜条件无菌无毒，适宜条件去核注核重组细胞二、动物体体细胞核移移植技术和和克隆动物物1、概念：动物核移植植是将动物物的一个细胞的的细胞核,移入一个个已经去掉细胞核核的卵母细细胞中.使其重组组并发育成成一个新的胚胎,这个新的的胚胎最终终发育为动物个体.2、原理：动物细胞核核具有全能能性比较以下细细胞的全能能性：受精卵、二二分裂球的的子细胞囊胚细胞、、多能造血血干细胞单能造血干干细胞、水螅的消化化细胞、人人的消化细细胞细胞具有全全能性多能细胞单能细胞高度分化的的体细胞3、分类：胚胎核移植植、体细胞胞核移植。。胚胎细胞分分化程度低低，恢复其其全能性相相对容易。。动物体细胞胞分化程度度高，恢复复其全能性性十分困难难4、体细胞胞核移植过过程---示动物克克隆---无性繁殖殖1.）克隆隆羊多利培培育过程：：黑面绵羊去核卵母细胞白面绵羊乳腺细胞核细胞核移植重组细胞电脉冲刺激早期重组胚胎胚胎移植另一头绵羊羊的子宫妊娠、出生克隆羊多利◆特别注意：：克隆动物性性状与供体体动物完全全一样吗？？不可能！因为：一、供体动动物只提供供细胞核，，而细胞质质中的遗传传物质（如如线粒体DNA）来来自于受体体卵母细胞胞.二、生物的的性状不仅仅与遗传物物质有关，，还受环境境的影响。。供体受体代孕受体黑面绵羊去核卵母细胞白面绵羊乳腺细胞核a重组细胞电脉冲刺激早期重组胚胎b另一头绵羊的子宫妊娠、出生克隆羊多利1、写出AB所代表表细胞工程程名称：a表示：b表示:2、实施细细胞工程时时，所需受受体细胞大大多采用卵卵母细胞的的原因：体积大，易易操作。含含有促使细细胞核表达达全能性的的物质和营营养条件。。3、多利面面部毛色是是：根据遗传学学原理说明明判断依据据。4、若黑面面绵羊的基基因型为AA,白面面绵羊的基基因型为aa，则克克隆羊的基基因型为核移植胚胎移植白色多利全部的的核基因都都来自白面面绵羊aa◆取供体细胞胞传代培养养10代以以内的细胞胞.为什么么？◆用的是去核核的减数第第二次分裂裂中期细胞胞（MⅡ中期）为什么？？◆激活方法：：◆激活目的：：◆促融方法：：电刺激◆胚胎移植至至代孕受体体内妊娠、分娩娩2.）核移移植流程供体：优质质高产奶牛牛受体：普通通奶牛（卵卵母细胞的的采集与培培养）1.体积大大，易操作作。2.含含有促使细细胞核表达达全能性的的物质和营营养条件。。有人说它三三个母亲，，对吗？核移植流程程:1、供体细细胞的采集集与培养5、用物理理或化学方方法激活受受体细胞，，使其完成成减数分裂裂进程。6电刺激促促融使供体体核进入受受体卵母细细胞，构建建重组胚胎胎。4、将供体体细胞注入入去核卵母母细胞3、显微操操作去除卵卵母细胞中中的核2、受体卵卵母细胞的的采集与体体外培养7、胚胎移移植入代孕孕母牛体内内8、妊娠分分娩与供体体遗传物质质基础相同同的犊牛。。胚胎分割：：受精卵二等分四等分把每等份分分别移植到到母体子宫宫内，迅速速繁殖出大大批性状相相似的个体体。动物的基因因组中，一一类基因是是维持生存存的，在各各种细胞中中都处于活活动的状态态。另一类类基因随着着组织器官官和发育阶阶段不同而而选择性表表达。分化的细胞胞内基因的的活动很不不完全，因因此很难像像受精卵那那样发挥细细胞全能性性。胚胎细胞克克隆比高度度分化的体体细胞克隆隆要容易得得多。动物难以克克隆的原因因5.体细胞胞核移植技技术的应用用前景6.体细胞胞核移植技技术存在的的问题看书P49-50页定义：指用自然或或人工方法法，使两个个或多个不不同的细胞胞融合成一一个细胞的的过程。不同基因型型的细胞之之间的融合合就是细胞杂交。。三、动物细细胞融合动物细胞融融合诱导融合的的因素：生物法：灭灭活的仙台台病毒诱导导融合。利用灭活仙仙台病毒是是动物细胞胞融合所特特有的。这是由于病病毒的磷脂脂外衣与动动物细胞的的膜十分相相似的缘故故。病毒外外壳上的某某些糖蛋白白可能还有有促进细胞胞融合的功功能。化学法：聚聚乙二醇诱诱导融合因为聚乙二二醇易得、、简便，且且融合效果果稳定，是是目前应用用最广泛的的方法。物理法：离心、振动动、电刺激激动物细胞融融合技术的的应用遗传学上：：基因定位位由于细胞杂杂交中染色色体容易丢丢失，因此此利用杂交交细胞检测测特定染色色体丢失与与特定基因因产物（蛋蛋白质）减减少的对应应关系，可可以进行基基因定位。。例如：人-鼠杂交细细胞通常丢丢失人的染染色体，可可以进行人人类基因的的定位（如如由于1号号染色体丢丢失导致尿尿苷单磷酸酸激酶活性性丧失，可可知该基因因位于1号号染色体上上）免疫学上：：利用杂交交瘤技术，，制备单克克隆抗体。。用途诱导方法细胞融合的方法植物细胞全能性细胞融合的原理动物细胞融合植物体细胞杂交比较项目比较项目植物、动物物细胞融合合的比较细胞膜的流流动性细胞膜的流流动性去除细胞壁壁后诱导原生质体体融合使细胞分散散后诱导细胞融融合物理（离心心、振动、电刺激）化学（聚乙乙二醇）物理、化学学方法（同左）灭活的病毒毒获得杂种植植株主要用于制制备单克隆抗体体回忆：1、抗体的的化学本质质？球蛋白2、抗体是是由何种细细胞产生的的？效应B细胞3、抗体主主要分布在在哪？血清4、抗原的的特异性取取决于什么么？抗原决定簇簇5、抗原决决定簇的种种类和数目目是否相同同？不同动物细胞融融合的成功功应用———单克隆抗体体的制备一种抗原只只能与相应应的抗体发发生特异性性结合。6、抗原与与抗体的关关系？一个抗原可可以与多个个抗体特异异结合4脾脏4种效应B细胞B1B2B3B4抗原B1B2B3B4Ab1Ab2Ab3Ab44种特异性性抗体问题情境1：长期以来，，人们为了了获得抗体体，采用的的就是把某某种抗原反反复注射到到动物体内内，然后从从动物血清清中分离出出所需抗体体的方法。。你认为这种种做法有什什么弊端？？产量低，而而且机体会会产生多种种抗体，抗抗体纯度低低，反应不不够灵敏，，这种情况况给临床医医学的诊断断与治疗带带来诸多不不便。问题情境2：每个浆细胞胞只分泌一一种特异性性抗体，要要想获得大大量专一性性抗体，你能利用前前面学习过过的动物细细胞工程的的有关技术术来解决问问题吗？（1）用单单个特定B淋巴细胞胞进行无性性繁殖，形形成大量的的细胞群体体，即克隆。（2）如此此克隆出的的B淋巴细细胞遗传特特性高度一一致，由它它们分泌的的抗体化学学性质单一一、特异性性强，叫做做单克隆抗体体。质疑：（动物细胞胞培养）在体外培养养条件下，，一个B淋淋巴细胞可可能无限增增殖吗？那么怎样才才能获得大大量单克隆隆抗体呢？？科勒米尔斯坦1984年年诺贝尔医医学和生理理学奖1975年年研究单克克隆抗体的的制备过程程获得成功功为什么先注注射特定抗抗原？特定抗原获得的B细细胞会是同同种的吗？？已免疫的B细胞细胞融合第一次筛选选（多种）杂交瘤细胞胞存活HAT培养养基筛选：：1、淋巴细细胞合成DNA有D和S两条条途径，其其中D途径径能够被氨氨基嘌呤阻阻断。但是是一般不分分裂增殖。。2、骨髓瘤瘤细胞是特特殊选择的的代谢缺陷陷型细胞，，其DNA合成过程程只具有D途径，能能被氨基嘌嘌呤阻断。。3、杂交瘤瘤细胞则既既可无限增增殖，又具具备DNA合成途径径。杂交瘤细胞胞（多种）细胞培养多孔培养板板第二次筛选选选出能产生生特定抗体的细胞群，，继续培养养。（专一抗体体检验阳性性细胞）克隆阳性细细胞体外培养单克隆抗体体单克隆抗体体从小鼠腹水水中提取1、单克隆隆抗体作为为诊断试剂,在临床生生化诊断、、病理组织织定位、体体内肿瘤的的定位等,与常规抗抗体相比,具有特异性强,灵敏度高高等特点.2、单克隆隆抗体上连连接抗癌药药物,治疗疗癌症等疾疾病(生物物导弹)单克隆抗体体的优点：：可以从特异异性抗原成成分比例极极少的抗原原混合物中中，获得单单一类型的的抗体。特异性强，，灵敏度高高。单克隆抗体体的应用单克隆抗体体的应用：：①在基础理论论研究中具具有重要意意义②在疾病诊断断、治疗和和预防方面面，具有特特异性强、、灵敏度高高等优越性性。③单抗诊断断盒、生物导弹下图表示单单克隆抗体体的制备过过程，请分分析完成下下列问题：：（1）A过程是从从小鼠的脾脾脏取得细细胞，该该细胞能够够产生。。从小小鼠体内提提取分离该该细胞之前前，应给小小鼠注射类类物质质。（2）B过过程是一个个过过程，该该过程的进进行需要灭灭活的或诱诱导。。C→D是过过程，选出出能产生特特异性抗体体的，，继续续培养。（3）单克克隆抗体在在疾病的诊诊断、治疗疗和预防方方面与常规规抗体相比比，其特点点是能产生抗体体的B（淋淋巴）特定抗体抗原细胞融合灭活的（仙仙台）病毒毒PEG筛选杂交瘤细胞胞特异性强、、灵敏度高高，优越性性非常明显显。采用此方法法可以将两两个不同种种、属的动动物优点集集中在一起起，产生具具有双亲优优点的可繁繁殖的杂种种动物。细胞核移植植对动物优优良杂交种种的无性繁繁殖具有重重大意义。。这一技术术的成功与与完善对于于优良家禽禽的无性繁繁殖和濒临临绝迹的珍珍贵动物的的传种意义义重大。1、植物组组织培养和和动物细胞胞培养的比比较复习：培养结果培养目的培养基性质原理动物细胞培养植物组织培养比较项目培养结果培养目的培养基特有成分培养基性质原理比较项目细胞的全能能性细胞增殖固体培养基基液体培养基基蔗糖、植物物激素葡萄糖、动动物血清植物体细胞株、细细胞系快速繁殖、、培育无病毒植株株获得细胞或或细胞分泌蛋蛋白2、动物细细胞融合的的原理？3、动物细细胞融合不不同于植物物原生质体体融合所用用的诱导剂剂是什么？？细胞膜具有有一定的流流动性。灭活的（仙仙台）病毒毒9、静夜四无邻邻，荒居旧业业贫。。1月-231月-23Friday,January6,202310、雨雨中中黄黄叶叶树树，，灯灯下下白白头头人人。。。。14:11:5914:11:5914:111/6/20232:11:59PM11、以我独独沈久，，愧君相相见频。。。1月-2314:11:5914:11Jan-2306-Jan-2312、故人江海海别，几度度隔山川。。。14:11:5914:11:5914:11Friday,January6,202313、乍见见翻疑疑梦，，相悲悲各问问年。。。1月-231月-2314:12:0014:12:00January6,202314、他乡生生白发，，旧国见见青山。。。06一一月20232:12:00下午午14:12:001月-2315、比不了了得就不不比，得得不到的的就不要要。。。一月232:12下午午1月-2314:12January6,202316、行动出成成果，工作作出财富。。。2023/1/614:12:0014:12:0006January202317、做前，，能够环环视四周周；做时时，你只只能或者者最好沿沿着以脚脚为起点点的射线线向前。。。2:12:00下午午2:12下午午14:12:001月-239、没有失败败，只有暂暂时停止成成功！。1月-231月-23Friday,January6,202310、很多事情努努力了未必有有结果，但是是不努力却什什么改变也没没有。。14:12:0014:12:0014:121/6/20232:12:00PM11、成功就是是日复一日日那一点点点小小努力力的积累。。。1月-2314:12:0014:12Jan-2306-Jan-2312、世间间成事事，不不求其其绝对对圆满满，留留一份份不足足，可可得无无限完完美。。。14:12:0014:12:0014:12Friday,January6,202313、不不知知香香积积寺寺，，数数里里入入云云峰峰。。。。1月月-231月月-2314:12:0014:12:00January6,202314、意志坚强强的人能把把世界放在在手中像泥泥块一样任任意揉捏。。06一月月20232:12:00下下午14:12:001月-