靶标代谢组学技术在不同代谢物群研究中的应用,人体生理学论文

靶标代谢组学技术在不同代谢物群研究中的应用,人体生理学论文继基因组学、转录组学和蛋白质组学等各种组学之后，代谢组学已迅速发展成为系统生物学的一个重要分支。代谢组学是考察生物体系〔细胞、组织或生物体〕受刺激或扰动后〔如将某个特定的基因变异或环境变化后〕其所有小分子代谢产物的变化或其随时间的变化，用以研究生物体系代谢途径的一种技术[1].区别于其他组学针对生物大分子水平的研究，代谢组学关注的核心是小分子代谢产物群的变化，进而从小分子代谢物变化的整体水平来揭示生命经过的动态变化和调控规律。根据研究对象和目的的不同，代谢组学的研究形式主要分为两种[2-3]:非靶标代谢组学和靶标代谢组学。非靶标代谢组学[2,4-5]研究较为普遍，旨在尽可能全面地分析生物样本中所有代谢物〔包括未知化合物〕，从总体上把握整体轮廓及其代谢变化规律，寻找潜在生物标志物，具有全局分析的优势。但同时也存在一定的缺乏，如易遗漏一些低浓度物质的变化，达不到全局分析的目的；进行半定量分析，准确度不高，结果可信度较低；只是一个相对模糊的全景形式，对于不同的疾病和代谢途径缺乏特异性。非靶标代谢组学分析较多地采用核磁共振〔nuclearmagneticresonance,NMR〕和气相色谱串联质谱〔gaschromatography-massspectroscopy,GC-MS〕技术平台。NMR能实现对样品的非毁坏性、非选择性分析，知足对尽可能多的化合物进行检测的目的；GC-MS具有较高的分辨率和检测灵敏度，并且有可供参考的标准谱图数据库，能够用于代谢物的准确定性分析。随着新的分析方式方法的不断发展，当前对于非靶标代谢组学的分析，往往通过组合不同的分析技术，以实当代谢组的全面分析。靶标代谢组学[2,4]是对特定的目的代谢物的精到准确定性定量分析，主要研究特定构造功能类型的代谢物群，例如脂肪酸类、磷脂类、嘌呤嘧啶类或氨基酸类等。作为一种特定形式，能够根据非靶标代谢组学的研究结果，对特定的代谢物群进行定量分析，弥补非靶标代谢组学的缺乏。其主要优势是能够利用建立的数据库，结合多种代谢通路，对目的代谢物进行定量分析，准确度高，特异性强。但其缺点[6]是需依靠先验知识，建立方式方法依靠于标准品，对于生物样本代谢组信息的覆盖仍有局限，不适用于大规模的代谢轮廓分析。靶标代谢组学分析主要采用基于质谱的分析技术，三重串联四级杆质谱[7]〔triplequadrupole/massspectroscopy,QQQ/MS〕因其在定量分析上的独特优势成为靶标代谢组学分析的首选。气相色谱三重串联四级杆质谱〔GC-QQQ/MS〕和液相色谱三重串联四级杆质谱〔LC-QQQ/MS〕联用技术能够对不同极性的目的代谢物进行高选择性﹑高灵敏度和高通量的定量分析，完成对大量生物样本潜在生物标志物的验证。一般在GC-MS系统上用选择离子监测〔selectedionmonitoring,SIM〕或者在LC-MS系统上用多反响离子监测〔mul-tiplereactionmonitoring,MRM〕进行靶向MS/MS分析[3],华而不实LC-MS因其样品处理经过简单、分析速度快等优势，应用更为广泛。本文主要介绍靶标代谢组学技术在不同代谢物群研究中的应用。1脂类化合物脂类是一类低溶于水而高溶于非极性溶剂的生物有机分子。对于大多数脂类而言，其化学本质是脂肪酸和醇所构成的酯类及其衍生物。由于脂类构造复杂，功能繁多，生物样本本身又相当复杂，因而迄今没有一种分析手段能独立完成系统的大规模脂类分析。常用的脂类物质分析技术有软电离质谱和液质联用,如电喷雾电离〔electrosprayionization〕质谱〔ESI/MS〕技术在脂类的表征、定性和定量分析中就发挥了重要的作用。随着研究不断深切进入，新的分析方式方法不断建立，脂类代谢物数据库不断发展完善。脂肪酸是构成人体脂肪和类脂的基本物质，是细胞膜磷脂的重要成分[8].研究表示清楚[9-14],脂肪酸代谢紊乱与某些疾病的发生有着密切的联络，检测脂肪酸代谢的动态变化可用于研究机体从稳态发展为疾病的经过，或者机体在接受治疗后由疾病恢复到稳态的经过。除此之外，脂肪酸含量变化可以作为某类疾病的生物标志物，用于疾病的预警和诊断。脂肪酸是由一条长的烃链和一个末端羧基组成的羧酸，烃链的长度和不饱和度很大程度上影响了脂肪酸的性质。脂肪酸的分析常采用GC-MS技术，但是该法提取和衍生化经过繁琐；而LC-MS分析方式方法因样品处理经过简单而得到越来越多的应用。近年来，短链脂肪酸〔shortchainfattyacids,SCFA〕和支链氨基酸〔branchedchainaminoacids,BCAA〕因其在生理和病理经过中的重要作用，而遭到研究者的广泛关注。Zheng等[15]采用氯甲酸丙酯〔propylchloroformate,PCF〕衍生化的方式方法，用GC-MS同时测定喂食不同营养成分的家兔粪便样品中SCFA和BCAA的含量。在pH8的水∶丙醇∶吡啶〔V/V/V=8∶3∶2〕反响液中参加100lPCF进行衍生，然后用正己烷对衍生后的产物进行两步提取。该法衍生化效率高、检测限低、回收率高，已成功用于正常人粪便、血浆及尿样中SCFA和BCAA的检测。类二十烷酸也称类花生酸，由二十碳多不饱和脂肪酸衍生而来，大多数的类二十烷酸是花生四烯酸的衍生物，如前列腺素类〔prostaglandin,PG〕，凝血唑恶烷类〔thromboxanes,TX〕和白三烯类〔leukotriene,LT〕。类二十烷酸是炎症和氧化应激反响中的主要调节介质，也常作为某些病理状态或癌症的生物标志物。不同类型的二十烷酸化学性质可能不同，加上其相对不稳定性，使得类二十烷酸的全面定量分析变得困难。尿液中类二十烷酸的分析通常采用GC-MS或LC-MS/MS,但一般需要复杂的样品提取和衍生化经过。对于类二十烷酸的分析方式方法已有大量研究报道，但对于不同代谢通路产生的类二十烷酸的定量分析研究比拟罕见。Sterz等[16]使用超高效液相色谱-串联质谱〔ultraperformanceliquidchromatography-SIM-MS/MS,UPLC-SRM-MS/MS〕建立了一种简单灵敏的方式方法用于定量分析尿液中的类二十烷酸。相比于耗时复杂的固相提取方式方法，该研究采用了一种较为简单的液液提取方式方法；除此之外，所有化合物进入质谱后，在选择反响监测〔selectedreactionmonitoring,SRM〕形式下，经碰撞解离产生特征离子对，不需要进行衍生化，即可进行检测，操作简便。采用该法实现了对尿液中多种主要类二十烷酸的定量分析，包括PG类〔PGE-M、PGF2a〕、TX类〔TXB2〕、LT类〔LTE4〕及12-羟基花生四烯酸等。该方式方法成功应用于吸烟者尿液中类二十烷酸的测定〔吸烟和尼古丁的摄入会引起尿液中类二十烷酸水平的升高〕，证明了该法的适用性。二十二碳六烯酸〔docosahexaenoicacid,DHA〕在大脑中含量非常丰富，是一种对人体非常重要的-3多不饱和脂肪酸，对维持大脑的正常功能具有重要作用。研究表示清楚，DHA含量变化和氧化作用的发生与神经退行性疾病相关；在某些病理状态下，DHA的氢过氧化物〔hydroperoxy-DHA,HpDoHE〕和氢氧化物〔hydroxide-DHA,HDoHE〕的含量也会有所增加。可见对于DHA氢过氧化物和氢氧化物的鉴定和分析具有重要的临床意义。Derogis等[17]建立了一种灵敏度高、专属性强的方式方法，用于定量分析12种主要HpDoHE和氢HDoHE的异构体。在该研究中，通过光致氧化合成HpDoHE,然后进一步使用硼氢化钠〔NaBH4〕复原得到HDoHE.分离得到的异构体使用LC-MS/MS的SRM形式为每一个异构体开创建立相应的特征离子对，实现了对各个异构体的定量分析。采用该法测定大鼠血浆和脑中HpDoHE及HDoHE异构体的含量，已证明其适用性。除此之外，该法可用于HpDoHE和HpDoHE衍生物的鉴定和定量分析，对于氧化脂质组的研究也具有重要的意义。磷脂是生物组织中非常重要的一类脂质，不仅仅是生物膜的主要成分，并且作为重要的代谢物介入大量的生命活动〔如细胞中信号转导、膜固定及底物转运等〕。正是由于在生物体代谢经过中的重要作用，磷脂也成为脂质组学研究的一个热门。质谱被广泛应用于磷脂的分析，但由于离子抑制效应等因素，低丰度的磷脂往往较难检测出来。在进行质谱分析前，对不同种类的磷脂进行预分离，可提高检测的灵敏度和重复性。Kim等[18]采用HPLC-MS从大鼠心脏和骨骼肌线粒体中分离检测到7种磷脂类化合物〔磷脂酰乙醇胺、磷脂酰胆碱、磷脂酰甘油、磷脂酰肌醇、磷脂酰丝氨酸、心磷脂及单溶心磷脂〕，并且对华而不实6种〔磷脂酰丝氨酸除外〕进行了定量分析。该法优化了提取纯化步骤，提高了灵敏度和重复性，为线粒体中磷脂类化合物的分析提供了一种较好的定性和定量分析方式方法。鞘磷脂即鞘氨醇磷脂，在磷脂酶的作用下，可水解为磷酰胆碱和神经酰胺，这些代谢物在调节细胞生长、分化和程序性死亡的机制中发挥着重要的作用。Blaas等[19]以C6-鞘磷脂为内标，采用亲水作用色谱-高效液相串联质谱〔HILIC-HPLC-ESI-MS/MS〕对人体母乳中的鞘磷脂进行了定量分析；提取后的母乳样品采用硅胶固相提取方式方法纯化，分离得到的鞘磷脂经磷脂酶水解得到相应的神经酰胺，然后采用反相高相液相串联质谱〔RP-HPLC-ESI-MRM/MS/MS〕对鞘磷脂进行了构造确证。该法为母乳中不同构造类型的鞘脂的研究提供了新的思路。2肉毒碱肉毒碱是类维生素，是机体脂肪酸代谢必需的一种辅酶，可与长链脂肪酸结合构成酰基肉碱，作为载体，将脂肪酸运送至线粒体基质中，完成-氧化；除此之外，在支链氨基酸的代谢中肉毒碱也发挥着重要的作用。血浆中肉毒碱和酰基肉毒碱的检测，对于诊断由脂肪酸代谢紊乱引起的疾病具有很大的帮助。Peng等[20]采用串联四级杆离子阱质谱〔QTRAP-MRM-MS/MS〕建立了一种快速准确的方式方法来分析肉毒碱和酰基肉碱。该法无需衍生化，避免了以往文献中存在的衍生化反响不完全及酰基肉碱水解等影响因素；采用HILIC预先分离肉毒碱和酰基肉碱，能够较好地分开各异构体，排除干扰物质的影响，避免假阳性结果。为考察方式方法的适用性，对216名健康人和116名患者血浆中肉毒碱和酰基肉碱进行检测，结果发现49名患者为有机酸血症或者脂肪酸代谢紊乱。对乙酰氨基酚〔paracetamol〕是一种广泛使用的止痛剂，过量服用会造成肝毒性或引起其他急性肝损伤。线粒体功能障碍和氧化应激损伤是对乙酰氨基酚导致肝损伤的重要作用机制。新研究发现，服用过量对乙酰氨基酚患者的血浆中谷氨酸脱氢酶活性加强，线粒体DNA的浓度增加，并将其作为线粒体损伤的生物标志物。但是这些标志物相对分子质量较大，要在细胞死亡或细胞膜破损时才能从细胞中释放出来。McGill等[21]采用超高效液相色谱-四级杆飞行时间质谱〔UPLC-QTOF-MS〕，应用代谢组学的方式方法来挑选线粒体损伤的生物标志物。呋塞米〔呋喃苯胺酸，furosemide〕是一种利尿剂，可以以引起肝损伤，但给药初期不会造成线粒体损伤，对小鼠分别给予过量对乙酰氨基酚和呋塞米，发现给予对乙酰氨基酚的小鼠血浆中3种酰基肉碱的含量增加，而给予呋塞米的小鼠血浆中未发现酰基肉碱含量的显着变化，表示清楚酰基肉碱的含量变化也许能够作为小鼠线粒体功能障碍的特征生物标志物。采用该方式方法，检测服用过量对乙酰氨基酚而致肝损伤的患者血浆中的酰基肉碱含量，结果未发现酰基肉碱的显着变化。分析其可能的原因是患者在服用过量对乙酰氨基酚后，给予N-乙酰半胱氨酸进行解毒，影响了酰基肉碱的测定。为探究给药后人血浆和小鼠血浆差异产生的原因，该研究小组对小鼠给予过量对乙酰氨基酚后给予N-乙酰半胱氨酸，对小鼠血浆进行检测，发现给予N-乙酰半胱氨酸后酰基肉碱的含量较给予对乙酰氨基酚后酰基肉碱的含量有所下降。该方式方法中发现的小鼠线粒体损伤时可能的生物标志物-酰基肉碱，对于寻找与线粒体损伤相关的人类疾病〔未经过N-乙酰半胱氨酸治疗〕生物标志物提供了研究思路。3核苷类化合物核苷类化合物是维持生命活动所需的基本物质，是构成DNA和RNA的基本物质，因其具有广泛的生理活性，能够用于抗肿瘤抗病毒[22]等的治疗。某些疾病的发生也与核苷类物质的代谢异常相关，因而，核苷类化合物含量的变化能够作为生物标志物，用于某些疾病的诊断[23-29].当前，HPLC、毛细管电泳〔capillaryelectrophoresis,CE〕、HPLC-MS以及GC-MS等分析方式方法已用于核苷类物质的分析。谢玉萍等[30]采用HPLC-ESI/MS/MS技术，结合MRM形式，建立了同时检测19种核苷的方式方法。该方式方法具有灵敏度高、选择性强、定量准确及分析速度快等优点，可用于分析不同生长状态的大肠杆菌中核苷的种类和含量随时间的变化趋势。Struck等[27]建立了一种定量分析泌尿生殖系统癌症患者尿样中核苷的方式方法，利用HPLC-ESI-QQQ/MS/MS技术，结合MRM形式，在17min内同时检测12种核苷，观察核苷代谢变化，为进一步研究核苷类物质作为癌症生物标志物的可能性提供了方式方法。Stentoft等[31]建立了一种简单且重复性好的前处理方式方法，采用LC-MRM/QQQ/MS/MS技术，同时准确定量分析了奶牛血浆中20种不同构造性质的嘌呤嘧啶代谢物，并且通过分析不同基质〔血浆、尿液、牛奶〕和不同物种〔牛、鸡、猪、大鼠、人〕采集的血液中嘌呤嘧啶代谢物，考察了该方式方法的适用性。修饰核苷是机体的代谢产物，在转录后由多种特定的甲基转移酶和连接酶作用于多聚核苷分子而构成，其作用与维系本身构造和调节功能有关。Li等[32]收集了25名健康人和51名冠状动脉疾病〔coronaryarterydisease,CAD〕患者的尿样，预处理后，采用固相萃取法提取、纯化甲基化的核苷，继而采用HPLC-ESI-SRM/MS/MS技术共分析了6种甲基化的核苷〔N3-甲基胞苷、N1-甲基腺苷、N6-甲基腺苷、N2-甲基鸟苷、N1-甲基鸟苷和N2,N2-二甲基鸟苷〕，华而不实N6-甲基腺苷在CAD患者与健康对照组尿液中的含量变化具有明显的差异。表示清楚尿液中N6-甲基腺苷的含量变化可能与冠状动脉疾病相关。Xia等[29]采用HPLC-UV/MS/MS对2型糖尿病患者中糖尿病性肾病患者肌酐和嘧啶循环相关代谢物进行定量分析。发现患者血浆中胞嘧啶、胞苷、胸苷含量显着增高，而尿苷、胸腺嘧啶及脱氧尿苷含量没有显着变化。该研究结果表示清楚，胞嘧啶、胞苷、胸苷含量变化可用于糖尿病病情发展的检测及治疗效果的评价。4氨基酸类化合物氨基酸〔aminoacid,AA〕是构成蛋白质的基本单位，赋予蛋白质特定的分子构造形态；作为细胞的信号分子，可调节基因的表示出和蛋白质的磷酸化级联反响；AA还能转化为其他的物质〔如丙酮酸盐、2-氧化戊二酸和延胡索酸等〕进一步进入三羧酸循环，介入能量代谢。除此之外，AA代谢作为中心碳代谢的重要部分，发挥着关键作用。越来越多的研究表示清楚AA的代谢变化可用于疾病的分析[33-36].因而，建立一种简单、可靠的AA定量分析方式方法具有重要的意义。AA种类较多且构造类似，大部分没有紫外和荧光响应，为提高分离度和检测灵敏度，一般将其衍生化后再进行定性定量分析。已发展的AA测定方式方法有很多，常见的有GC-MS[37]、LC-MS[38-41]及CE-MS[42-44]技术。Piraud等[45]利用LC-MRM/MS技术建立了一种新的无需衍生化来检测AA的方式方法，为遗传性AA代谢紊乱的检测提供了技术支持。Salazar等[40]利用6-氨基喹啉-N-羟基琥珀酰亚胺基氨基甲酸酯进行衍生化，采用稳定同位素标记和MRM形式，应用AccQTag-UPLC-ESI-MS/MS技术对拟南芥叶提取物中的AA进行定量分析。该方式方法通量高，选择性好，能够实如今10min内检测38种代谢物，检测限达1.0210-11mol/L,较其他方式方法灵敏度提高1~5个数量级。慢性阻塞性肺病〔chronicobstructivepulmonarydisease,COPD〕是呼吸系统常见病之一。近年来，COPD的基础研究和治疗方式方法都不断深化。Ubhi等[35]采用LC-MS/MS技术研究不同类型COPD患者血清样品，检测34种AA和二肽代谢变化，发现AA代谢变化可用于COPD的诊断及区分COPD的不同亚型。十分是-氨基丁酸的含量变化可用于监测疗效及具有恶病质的胰腺癌复发情况。非对称二甲基精氨酸〔asymmetricdimethylargi-nine,ADMA〕是一氧化氮合酶〔nitricoxidesynthase,NOS〕竞争性抑制剂[46],通过抑制血管内皮细胞NOS抑制一氧化氮〔nitricoxide,NO〕合成，NO合成和分泌减少，会导致血管张力调节机制受损[47].Yi等[48]建立了一种LC-ESI-SIM/MS方式方法定量分析了T2DM患者血浆中L-精氨酸、ADMA和对称性二甲基精氨酸。研究发现与对照组相比，ADMA的含量在T2DM患者中显着增高，表示清楚ADMA的含量变化可能与心血管疾病相关。5结束语靶标代谢组学可用于验证发当代谢组学提出的假讲，进行基于假讲的探寻求索性实验，针对特定代谢物，研究代谢模型。采用MRM技术和同位素稀释或质量标签标记的方式方法对挑选出来的标志物定量，进行临床确证。代谢物的准确定量将使代谢组学研究更全面更可靠，有助于更清楚明晰地研究疾病机制，到达疾病预警、指导和评价治疗的目的。靶标代谢组学和非靶标代谢组学各具优势同时存在缺乏。考虑到非靶标和靶标分析各自的特征和优势，中科院大连化学物理研究所研究小组提出了拟靶向的概念[50].拟靶向技术方案的核心思想是将非靶向分析的高通量、无偏向的代谢物信息获取和靶向方式方法的高特异性检测和准确定量相结合，进而实现对待测样本中已经知道及未知的多个代谢物离子靶标进行同时检测。该法在保证检测灵敏度及对代谢组信息覆盖的同时，显着提高了数据的线性范围以及重复性等指标，保证了后续的基于代谢组数据的标志物发现及验证。基于这一概念，其实验室先后建立了基于GC-MS、LC-MS的拟靶向方式方法，并应用于植物代谢组学[49-50]、血清肝癌标志物的挑选[51]及胃癌早期诊断标志物的发现[52]等研究。为了使代谢组学研究更全面、结果更准确，应有效结合非靶标和靶标分析