分子克隆技术第一部分优秀课件

分子克隆技术第一部分第一页，共八十七页，2022年，8月28日将某载体上的水稻DNA片段亚克隆到另一载体上第一部分：分子克隆技术第二页，共八十七页，2022年，8月28日第三页，共八十七页，2022年，8月28日pUC19第四页，共八十七页，2022年，8月28日pU1301第五页，共八十七页，2022年，8月28日pU1301+1.5KB外源双酶切：

BamHI+KpnI第六页，共八十七页，2022年，8月28日两种载体的抽提琼脂糖凝胶电泳检测DNA的质量两种载体的限制性内切酶消化目的片段的回收及亚克隆载体的去磷酸化载体与外源DNA的连接感受态细胞的制备连接子转化感受态细胞重组子筛选及鉴定亚克隆的主要步骤第七页，共八十七页，2022年，8月28日质粒载体的提取第八页，共八十七页，2022年，8月28日是一个复制子，载体在受体细胞中能大量繁殖，其携带的外源基因才能在受体细胞中得到大量扩增有1到多个限制内切酶的单一识别与切割位点，便于外源基因的插入具有选择性的遗传标记(如抗生素抗性标记等)以此知道它是否已进入受体细胞，并据此标记将携带载体的细胞从其他细胞中分离出来载体必备条件第九页，共八十七页，2022年，8月28日质粒是携带外源基因进入宿主细胞、扩增或表达外源基因的主要载体，它在基因操作中具有重要作用。质粒的分离与提取是最常用、最基本的实验技术。

第十页，共八十七页，2022年，8月28日双链闭合环状DNA分子，具有自主复制和转录能力，能使子代细胞保持它们恒定的拷贝数，可表达它所携带的遗传信息。它可独立游离于细胞质中，也可整合到细菌染色体上。质粒在细胞内的复制可分为严谨型（只在细胞周期的一定阶段进行复制，一个细胞内只有1至几个拷贝）和松弛型（细胞周期中随时可以复制，拷贝数较多，一般在细胞内有20个以上）质粒的基本特点第十一页，共八十七页，2022年，8月28日碱裂解法，主要包括4个步骤：细菌的培养：从平板上挑取单菌落接种于含相应抗生素的培养基中，培养至对数生长后期菌体的收集和裂解：通过离心收集菌体，NaOH/SDS处理裂解细胞染色体DNA、RNA及其它杂质的去除：碱处理后用冰冷的KAC缓冲液处理后离心质粒的纯化及沉淀：苯酚氯仿抽提，乙醇或异丙醇沉淀质粒的提取第十二页，共八十七页，2022年，8月28日SolutionI: Tris.HCl（pH7.5） 50mM EDTA 10mM RNaseA 100µg/mlSolutionII:NaOH 0.2M SDS 1%SolutionIII:Finalconcentration KAC1.32M UsingHACtoadjustpHto4.8TE(pH8.0)：Tris.HCl（pH8.0） 10mM EDTA（pH8.0）

1mM苯酚/氯仿无水乙醇或异丙醇

碱裂解法用到的试剂第十三页，共八十七页，2022年，8月28日solutionI重悬细菌solutionII，其中的SDS破坏细胞壁、膜，使细胞内容物释放出来，NaOH使DNA变性、碱基对打开，使宿主染色体DNA双链分开，而闭合环状的质粒DNA处于拓扑缠绕状态，两个环并不分开试剂的作用（一）第十四页，共八十七页，2022年，8月28日SolutionIII中和后，宿主DNA由于很大，碱基还未来得及配对就在冰冷的条件下与SDS、蛋白质、高分子量的RNA等缠绕在一起沉淀下来，而质粒DNA由于很小且双链未分开，能够迅速配对重新形成超螺旋，处于溶解状态。试剂的作用（二）第十五页，共八十七页，2022年，8月28日试剂的作用（三）苯酚/氯仿：纯化质粒，去除质粒溶液中残留的蛋白质等杂质；无水乙醇或95%乙醇或异丙醇：沉淀质粒DNATE或H2O：溶解质粒DNA第十六页，共八十七页，2022年，8月28日实验材料携带pUC19质粒载体的大肠杆菌菌液携带含有水稻DNA片段的pU1301载体的大肠杆菌菌液。第十七页，共八十七页，2022年，8月28日操作步骤取含有相应载体的大肠杆菌菌液于含有相应抗生素的LA培养基上涂布或划线分离单菌落，37℃过夜培养）；用无菌牙签或接种环挑取单菌落，接种于含有相应抗生素的LB培养基中，37℃摇床~250r/min过夜培养第十八页，共八十七页，2022年，8月28日吸取1.5ml菌液，12000g离心2钟，收集菌体，倒掉上清；再次吸取1.5ml菌液收集菌体，尽量将菌液倒干净；加入300l溶液I振荡打匀，重新悬浮细胞，震荡混匀（注意：应彻底打匀沉淀或碎块）；加入300l溶液II，轻柔颠倒混匀，放置至清亮，一般不超过5分钟（最好不超过2分钟）；

加入300l溶液III颠倒混匀，放置于冰上10分钟，使杂质充分沉淀；第十九页，共八十七页，2022年，8月28日12000g离心10分钟；吸取800l上清液（注意：不要吸取到飘浮的杂质）至另一个1.5ml离心管中，加入2/3体积的异丙醇，室温下放置5分钟；12000g常温离心10分钟；弃上清，加500l75％乙醇，浸洗片刻后离心5分钟（注意离心管的放置方向），弃上清；加40l灭菌超纯水或TE溶解；质粒的质量检测，-20℃保存。

第二十页，共八十七页，2022年，8月28日氨苄青霉素（ampicillin）：其主要是通过阻碍细胞壁的合成最终导致细胞的裂解。氨苄青霉素抗性基因（ampr）：合成β-内酰胺酶，在氨苄青霉素进入细胞之前将其水解(使用浓度100µg/ml)卡那霉素（Kanamycinsulfate）

：核糖体结合，抑制蛋白质的合成（使用浓度：50µg/ml)RNaseA:

C或U的3’－P与相邻的5’－OH处切开RNA。配制：一般以10mg/ml溶于TE中，然后在沸水中煮15分钟，分装成小份储存于－20℃。试验中用到的抗生素和酶第二十一页，共八十七页，2022年，8月28日DNA纯度：吸光值检测：检测260nm、280nm吸光值，紫外分光光度计A260/A280=1.8－1.9；1.8最佳，低于1.8说明有蛋白质，大于1.8说明有RNA。质量检测：琼脂糖凝胶电泳：一般有一至三条带（超螺旋、线型、开环三种构型），点样孔附近无DNA带（无染色体DNA污染）。质粒DNA质量检测第二十二页，共八十七页，2022年，8月28日Hoechst33258:可与纳克级的DNA结合，而几乎没有RNA亲和性，激发波长365nm，发射波长460nm。0.1µg/mlHoechst33258适用于检测500ng/ml的DNA浓度，染料增加到1µg/ml，分析范围可延至15µg/ml，但会降低一定的灵敏度。缺点：更易于结合AT丰富区，对DNA组成敏感。EB:与DNA组成无关，但不如Hoechst33258敏感，且能结合RNA，激发波长302nm，发射波长590nm。3.DNA的定量（1）荧光检测仪1OD＝50g/ml DS-DNA或

1OD＝40g/ml RNAorSS－DNA（2.）分光光度计第二十三页，共八十七页，2022年，8月28日DNA的琼脂糖凝胶电泳

带电荷的物质在电场中的趋向运动称为电泳。电泳的种类多，应用非常广泛，它已成为分子生物学技术中分离生物大分子的重要手段。琼脂糖凝胶电泳由于其操作简单、快速、灵敏等优点，已成为分离和鉴定核酸的常用方法。

第二十四页，共八十七页，2022年，8月28日在pH值为8.0－8.3时，核酸分子带负电，在电泳时由负极向正极移动。采用适当浓度的凝胶介质作为电泳支持物，在分子筛的作用下，使分子大小和构像不同的核酸分子泳动率出现较大的差异，从而达到分离核酸片段检测其大小的目的。核酸分子中嵌入荧光染料（如EB）后，在紫外灯下可观察到核酸片段所在的位置。实验原理：第二十五页，共八十七页，2022年，8月28日影响DNA迁移速率的因素

DNA分子大小：迁移速率U与logN成反比（N为碱基对数目）。分子大小相等，电荷基本相等（DNA结构重复性）。分子越大，迁移越慢。琼脂糖浓度：logU=logU0-Kr

胶浓度，U为迁移率，U0

为DNA的自由电泳迁移率，为胶浓度，Kr为介质阻滞系数。不同的凝胶浓度，分辨不同范围的DNAAgarose： 0.5%：1-30kb； 0.7%：0.8-12kb1.2%：0.4-7kb；1.5%：0.2-3kb.第二十六页，共八十七页，2022年，8月28日DNA构象：一般迁移速率超螺旋环状>线状DNA>开环；当条件变化时，情况会相反，还与琼脂糖的浓度、电流强度、离子强度及EB含量有关。所加电压：低电压时，线状DNA片段的迁移速率与所加电压成正比。使分辨效果好，凝胶上所加电压不应超过5V/cm碱基组成与温度：4-30℃一般影响不大第二十七页，共八十七页，2022年，8月28日嵌入染料的存在：降低线性DNA迁移率，(不提倡加在电泳液中)电泳缓冲液的组成及其离子强度：影响DNA的迁移率，无离子存在时，核酸基本不泳动，离子强度过大产热厉害，熔化凝胶并导致DNA变性，一般采用1×TAE，0.5×或1×TBE，1×TPE（均含EDTApH8.0）第二十八页，共八十七页，2022年，8月28日实验步骤：将洗净、干燥的制胶板放入制胶槽中，水平放置在工作台上；配制0.8%的琼脂糖凝胶：称取0.24g琼脂糖于30ml0.5×TBE中，在微波炉中使琼脂糖颗粒完全溶解，冷却至温热时倒胶；凝胶凝固后，小心拔去梳子第二十九页，共八十七页，2022年，8月28日将DNA样品与上样缓冲液混合后将样品依次加入点样孔中；将制胶板放入电泳槽中，加入电泳缓冲液，打开电泳仪，将电压调至不高于5V/cm，使核酸样品向正极泳动（注意点样孔在电泳槽的负极一端）；电泳完成后切断电源，取出凝胶，放入0.5µg/ml的溴化乙锭（EB）中浸泡10－15min，在紫外透射仪上观察电泳结果并照相记录。第三十页，共八十七页，2022年，8月28日电泳指示剂：核酸电泳常用的指示剂有两种，溴酚蓝（bromophenolblue,Bb）呈蓝紫色；二甲苯晴（xylenecyanol,Xc）呈蓝色，它携带的电荷量比溴酚蓝少，在凝胶中的的迁移率比溴酚蓝慢。

1.含甘油或蔗糖，利于DNA样品沉入点样孔中2.含有电泳指示剂，以指示电泳的进程上样缓冲液：第三十一页，共八十七页，2022年，8月28日EB：溴化乙锭，可嵌入DNA分子中，受紫外光激发而发出荧光，利用它可检测DNA。是诱变剂，可引起插入突变，并有中度毒性，操作时应注意防护。操作时应戴手套，尽量减少台面污染。1000×贮存液(0.5mg/mL)，使用时按1：1000稀释配制染色液。第三十二页，共八十七页，2022年，8月28日质粒电泳检测：一般有一至三条带（质粒DNA的三种构型）超螺旋线型开环第三十三页，共八十七页，2022年，8月28日质粒电泳检测第三十四页，共八十七页，2022年，8月28日本科生试验图片第三十五页，共八十七页，2022年，8月28日质粒载体的抽提，外源DNA的准备琼脂糖凝胶电泳检测DNA的质量亚克隆载体与外源DNA的限制性内切酶消化(目的片段的回收，亚克隆载体的去磷酸化)载体与外源DNA的连接感受态细胞的制备连接子转化感受态细胞重组子的转化及筛选、鉴定利用质粒克隆外源DNA片段的主要步骤第三十六页，共八十七页，2022年，8月28日外源DNA克隆的要求特点不同的突出端用两种限制酶消化后需纯化质粒以提高连接效率一般酶切位点可保留,非重组克隆背景低不需CIP处理外源DNA只以一个方向插入重组质粒中相同的突出端线状质粒DNA常需用磷酸酶（CIP）处理一般酶切位点常可保留外源DNA会以两个方向插入重组质粒可带有外源DNA的串联拷贝末端为平端要求较高的DNA及连接酶不同酶切的平头可连接非重组克隆的背景高质粒及外源DNA连接处的酶切位点消失（不同平端酶）重组质粒可能带有外源DNA的串联拷贝第三十七页，共八十七页，2022年，8月28日载体及外源片段的限制酶消化:限制性内切酶切出相互匹配的粘性末端（一种酶）或不相匹配的粘性末端（不同酶消化）或平端；载体的去磷酸化:碱性磷酸酶去除载体的5’－P基团，以防载体自连；线状载体与外源片段的连接:连接酶使双链DNA5’－P与相邻的3’－OH之间形成新的共价键，若质粒载体的两条链都带有5’磷酸基团，则可形成4个新的磷酸二酯键，但如质粒已去磷酸化，则只能形成2个新的磷酸二酯键，且产生的两个杂交分子带有2个单链切口，当杂合体导入到感受态细胞后可被修复。第三十八页，共八十七页，2022年，8月28日限制性内切酶碱性磷酸酶连接酶几种工具酶第三十九页，共八十七页，2022年，8月28日有特定的识别序列，通常为4－6碱基的回文对称序列。切割位点位于识别序列内的固定位置上，切割后在5’末端有磷酸基团，3’末端有羟基。切割后形成粘性末端或平末端，前者又分为3’突出端（如PstI）和5’突出端(如EcoRI)两种其活性发挥只需Mg2＋作辅酶。II类限制性内切酶的特点第四十页，共八十七页，2022年，8月28日限制酶的一个活性单位（1U）：原则上指在50µl反应体系中，37℃下，经过1小时的反应将1µg的DNA完全分解所需要的酶量。限制酶的star活性：限制酶在极端非标准条件下使用时对底物DNA的特异性可能降低，即可将与原来识别的特定DNA序列不同的碱基序列切断，这种现象叫限制酶的star活性。它的出现的频率与酶、底物及反应条件有关。第四十一页，共八十七页，2022年，8月28日高浓度的甘油（>5％）；酶过量（>100U/ug）；低离子强度（<25mM）；高pH(>pH8.0)；有机溶剂（DMSO，乙醇，乙二醇，二甲基乙酰胺；用其他二价阳离子代替Mg2+(Mn2+,Cu2+,Co2+,Zn2+)不同的酶对上述因素的敏感程度不同引起星星活性的主要因素：第四十二页，共八十七页，2022年，8月28日氯化镁、氯化钠/钾、Tris盐酸盐、β－巯基乙醇或二硫苏糖醇（DTT）牛血清白蛋白（BSA）典型的限制性内切酶作用的缓冲体系成分包括：第四十三页，共八十七页，2022年，8月28日BamHI：

G▼GATTC CCTAA▲GKpnI: GGTAC▼C C▲CATGG第四十四页，共八十七页，2022年，8月28日含外源DNA片段的载体(M812)（50l反应体系，用1.5mltube，冰上操作）

质粒DNA

30lBamHI(10u/µl) 1lKpnI(10u/µl)

1l

10×buffer 5lddH2O 13l分别取5l酶切产物用0.8％－1.2%凝胶检测酶切效果

50

lTotal目的载体（Puc19)的限制性内切酶消化第四十五页，共八十七页，2022年，8月28日电泳检测MarkerpUC19质粒对照pUC19质粒酶切产物M812质粒对照M812质粒酶切产物点样顺序：第四十六页，共八十七页，2022年，8月28日2011本科生酶切图片

lane1-4,pUC19酶切产物Lane5,pUC19质粒Lane6，M812质粒Lane7-10,M812酶切产物Lane11,DL-2000

marker,1

11第四十七页，共八十七页，2022年，8月28日造成DNA酶切不完全的主要原因有：DNA不干净，反应体系中存在酶的抑制剂；操作不当，酶或DNA加至管壁上，反应体系没完全混合；反应条件不合适，用错了缓冲液或温度不合适；酶的活力不够第四十八页，共八十七页，2022年，8月28日DNA样品中抑制酶活的污染物主要有：DNA样品中的蛋白质、酚、氯仿、乙醇、EDTA、SDS、高浓度的盐等均能抑制酶切活性解决办法：增加酶作用的单位数（10-20U/µgDNA)增大反应体积以稀释可能的抑制剂延长反应时间消化基因组DNA时，加入终浓度1-2.5mmol/L多聚阳离子亚精胺可改善酶切效果，其作用是结合带负电荷的污染物。纯化DNA第四十九页，共八十七页，2022年，8月28日酶切反应的终止加入终农度为12.5mmol/L的EDTA以鳌合镁离子而终止酶的反应多数酶在65°C10分钟可被不可逆灭活，少数65°C不失活的酶在75°C15分钟也能失活若酶对热具完全抗性，可通过酚抽提乙醇沉淀来纯化第五十页，共八十七页，2022年，8月28日pUC19酶切产物的纯化：加入ddH2O150l（扩大体积），加入200µl氯仿/异戊醇（24:1），颠倒混匀后离心10min；

吸出上清，加1/10体积3MNaAc和两倍体积乙醇，-20℃放置15分钟以上；12000rpm4℃冷冻离心15分钟；倒去上清，用75％乙醇浸洗沉淀，风干后溶于10lddH2O；

第五十一页，共八十七页，2022年，8月28日氯仿对眼睛、皮肤、粘膜及呼吸道都有刺激作用，它是致癌剂并可损伤肝脏和肾脏，操作时需戴手套、安全镜并在通风橱中进行。苯酚是强腐蚀剂，能引起严重烧伤。操作时应戴手套、安全镜、穿防护服，并在通风橱中进行。注意第五十二页，共八十七页，2022年，8月28日当一个体系中有多种DNA分子，而我们只需要其中的某种DNA时或者反应体系中含有目的DNA子以外的其它分子如各种工具酶、dNTPs、引物及矿物油等时，可以利用凝胶电泳分离各种DNA，然后挖胶回收目的DNA带。回收方法主要有：

1.低熔点琼脂糖

2.透析带电洗脱法

3.glassmilk纯化

4.柱回收试剂盒DNA的回收纯化：第五十三页，共八十七页，2022年，8月28日柱式DNA胶回收试剂盒操作步骤：1.通过琼脂糖凝胶将目的DNA带与载体带分开；2.紫外灯下用干净的刀片切下含目的DNA带的胶块放入1.5ml离心管中；（注意：不含DNA的胶尽可能切除，在长波长的紫外灯下切胶，并尽量缩短DNA暴露在紫外光下的时间）3.按400µl/100mg胶的比例加入BindingBufferII,50-60ºC水浴中10分钟，使胶融化，每2-3分钟混匀一次；（注意若胶的浓度较大需增加BindingBufferII的比例、增加融胶的时间，若胶块体积较大也需增加融胶的时间）4.将融化的胶溶液转移到套放在2ml收集管内的UNIQ-10柱中，放置2分钟，8000rpm离心1分钟；第五十四页，共八十七页，2022年，8月28日5.取下UNIQ-10柱，倒掉收集管内的废液，将UNIQ-10柱放入同一个收集管内，加入500μlWashSolution,8000rpm室温离心1分钟；6.重复5步一次，7.取下UNIQ-10柱，倒掉收集管内的废液，将UNIQ-10柱放入同一个收集管内，12000rpm室温离心15秒；8.将UNIQ-10柱放入一个新的1.5ml离心管内，在柱子膜中央加40µlElutionBuffer或水（pH>7.0），室温或37ºC放置2分钟；（提高洗脱温度到55ºC-80ºC有利于提高DNA的洗脱效率）9.12000rpm室温离心1分钟，离心管中的溶液即为回收的DNA片段第五十五页，共八十七页，2022年，8月28日注意1.首次使用前，必须在WashSolution中加入4倍体积的无水乙醇，充分摇匀后使用，每次使用后将瓶盖拧紧，以保持WashSolution中的乙醇含量。2.ElutionBuffer为2.0mmol/LTris-HCl,pH8.5.4ºC保存。也可用PH8.0的TE或PH≥7.0的水代替。第五十六页，共八十七页，2022年，8月28日载体去磷酸化第五十七页，共八十七页，2022年，8月28日细菌碱性磷酸酶（BAP）,牛小肠碱性磷酸酶（CIAP）以及小虾碱性磷酸酶（SAP）都能催化磷酸单脂键的水解（包括DNA、RNA、dNTP和NTP上的5’－磷酸残基），不能催化磷酸三脂的水解。比较而言，CIAP的活性比BAP的高10－20倍,CIAP经加热处理，容易失活但不能完全失活,若要使酶完全失活，不论是BAP还是CIAP还需要经苯酚处理。而SAP经65⁰C加热15分钟就可完全失活。活性定义：在37⁰C、pH9.8的条件下，1分钟内水解对硝基苯磷酸盐（ρ-nitrophenylphosphate)生成1μM的对硝基苯(ρ-nitrophenol)所需的酶量定义为1个活性单位（U）.碱性磷酸酶第五十八页，共八十七页，2022年，8月28日载体去磷酸化反应体系：DNA 20lCIAP（TaKaRa） 0.5l10buffer 4.0lddH2O 15.5l37℃

或50℃反应30min以上

Total40l第五十九页，共八十七页，2022年，8月28日去磷酸化载体的纯化加0.4l0.5M的EDTA（终浓度5mM)，75℃水浴10min,使CIAP失活；加入ddH2O150l（扩大体积），加入等体积苯酚/氯仿/异戊醇（25:24:1），颠倒混匀后离心10min；

吸出上清，加1/10体积3MNaAc和两倍体积乙醇，-20℃放置15分钟以上；12000rpm4℃冷冻离心15分钟；倒去上清，用75％乙醇浸洗沉淀，风干后溶于10lddH2O（0.5mltube中）第六十页，共八十七页，2022年，8月28日载体与外源DNA片段的连接第六十一页，共八十七页，2022年，8月28日连接酶使双链DNA5’－P与相邻的3’－OH之间形成新的共价键，若质粒载体的两条链都带有5’磷酸基团，则可形成4个新的磷酸二酯键，但如质粒已去磷酸化，则只能形成2个新的磷酸二酯键，且产生的两个杂交分子带有2个单链切口，当杂合体导入到感受态细胞后可被修复。第六十二页，共八十七页，2022年，8月28日大肠杆菌连接酶T4噬菌体连接酶。连接酶第六十三页，共八十七页，2022年，8月28日各种连接酶特性的比较：T4DNALigase

E.coliDNALigaseT4RNALigaseLigasesofthermophilicbacteria最适pH辅酶7.2-7.8ATP7.5-8.0NAD7.2-8.4ATPNAD平滑末端可能*不能NODNA5’P末端和RNA3’OH末端可能可能不能NORNA5’P末端和DNA3’OH末端可能不能不能NORNA和RNA少数可能不能可能NO第六十四页，共八十七页，2022年，8月28日外源DNA 4l目的载体DNA 4l10buffer 1lT4ligase(1U/l) 1l

连接反应体系：16ºC水浴保温过夜Total10l第六十五页，共八十七页，2022年，8月28日感受态细胞的制备及质粒的转化转化是指将质粒或以它为载体构建的重组子导入细菌的过程。将连接产物转化到感受态细胞中，实现重组克隆的增殖，便于后续分子操作。可以采用多种方法筛选和鉴定目的克隆。

第六十六页，共八十七页，2022年，8月28日感受态细胞的制备体外连接的DNA重组分子导入合适的受体细胞才能大量增殖。为了提高受体菌摄取外源DNA的能力，提高转化效率以获得更多的转化子，人们摸索出了不同的方法处理细菌，使其处于感受态。目前主要采用电转化法和CaCl2法将外源DNA导入受体细胞中，因此需要相应地制备电转化感受态细胞和CaCl2感受态细胞。第六十七页，共八十七页，2022年，8月28日将外源DNA导入大肠杆菌主要有两种方法：CaCl2法：利用冰冷的CaCl2处理对数生长期的细胞，可以诱导其产生短暂的“感受态”，易于摄取外源DNA。106～107转化子/gDNA。电转化法：利用瞬间高压在细胞上打孔。因而需用冰冷的超纯水多次洗涤处于对数生长前期的细胞，以使细胞悬浮液中应含有尽量少的导电离子。109～1010转化子/gDNA；第六十八页，共八十七页，2022年，8月28日所有操作均应在无菌条件和冰上进行；所使用的器皿必须干净。迹量的去污剂或其它化学物质的存在可能大大降低细菌的转化效率。操作注意事项第六十九页，共八十七页，2022年，8月28日前夜接种受体菌（DH5），挑取单菌落于LB培养基中37℃摇床培养过夜（约16小时）；取1ml过夜培养物于100ml添加有20mMMgCl2的LB培养基中，在37℃摇床上剧烈振荡培养约2.5-3小时（300rpm）；将0.1MCaCl2溶液置于冰上预冷；以下步骤需在超净工作台和冰上操作吸取1.5ml培养好的菌液至1.5ml离心管中，在冰上冷却10分钟；CaCl2感受态细胞的制备（一）第七十页，共八十七页，2022年，8月28日4℃下4000rpm冷冻离心10分钟；弃去上清，加入100l预冷0.1MCaCl2溶液，用移液枪轻轻上下吸动打匀，使细胞重新悬浮，在冰放置20分钟；4℃下4000rpm冷冻离心10分钟；弃去上清，加入100l预冷0.1MCaCl2溶液，用移液枪轻轻上下吸动打匀，使细胞重新悬浮，4℃下4000rpm冷冻离心10分钟；弃去上清，加入20l预冷0.1MCaCl2溶液，用移液枪轻轻上下吸动打匀，使细胞重新悬浮；细胞悬浮液可立即用于转化实验,48小时内使用，可以暂时保存在4℃.长时间保存，需添加冷冻保护剂（15%～20%甘油）后超低温冷冻贮存备用（－70℃）。CaCl2感受态细胞的制备（二）第七十一页，共八十七页，2022年，8月28日操作注意事项

密切注视细菌的生长状态和密度，尽量使用对数生长期的细胞（一般通过检测OD600来控制。DH5菌株OD600为0.5时细胞密度是5×107/ml）；所有操作均应在无菌条件和冰上进行；所使用的器皿必须干净。迹量的去污剂或其它化学物质的存在可能大大降低细菌的转化效率。第七十二页，共八十七页，2022年，8月28日转化步骤

制备选择性培养基平板：在融化的250mlLA培养基中250lAmp，250lX-gal，25lIPTG，混匀后倒入灭菌培养皿中；取出3管制备好的感受态细胞，放在冰上融化；3管感受态细胞分别加DNA连接产物、标准超螺旋质粒DNA（阳性对照）及不加入任何DNA（阴性对照），用移液器轻轻吸打均匀，在冰上放置30分钟；第七十三页，共八十七页，2022年，8月28日热击：将离心管放置42℃水浴，热击90秒，注意：勿摇动离心管；冰镇：快速将离心管转移至冰浴，放置1－2分钟；复苏：每管加400lSOC培养基，在37℃摇床温和摇动温育45分钟，使细菌复苏；第七十四页，共八十七页，2022年，8月28日布皿：取适当体积均匀涂布于含有IPTG、X-gal、抗生素（Amp）的LA平板；培养：倒置培养皿，于37℃培养12－16小时

即可观察到蓝白相间的菌落（其中白色菌落为含有外源插入片段的转化子，蓝色菌落是载体自连的转化子）第七十五页，共八十七页，2022年，8月28日注意：利用氨苄青霉素抗性筛选转化子时，转化细胞铺平板的密度要低（90mm平板上不得超过105个菌落），同时37℃培养不应超过20小时，具氨苄青霉素抗性的转化体可将－内酰胺酶分泌到培养基中，迅速灭活菌落周围的抗生素，从而导致对氨苄青霉素敏感的卫星菌落的出现。第七十六页，共八十七页，2022年，8月28日电转化感受态细胞的制备（一）前夜接种受体菌（DH5），挑取单菌落于LB培养基中37℃摇床培养过夜（约16小时）；取1ml过夜培养物于100mlLB培养基中，在37℃摇床上剧烈振荡培养约2.5-3小时（300rpm）；将菌液迅速置于冰上，同时10%的甘油置于冰上预冷；以下步骤需在超净工作台和冰上操作吸取1.5ml培养好的菌液至1.5ml离心管中，在冰上冷却10分钟；4℃下3000g低温离心5-10分钟；第七十七页，共八十七页，2022年，8月28日电转化感受态细胞的制备（二）弃去上清，加入1500l预冷的10％的甘油，用移液器轻轻上下吸动打匀，使细胞重新悬浮；4℃下3000g低温离心5-10分钟；弃去上清，加入750l预冷预冷的10％的甘油，用移液器轻轻上下吸动打匀，使细胞重新悬浮；4℃下3000g低温离心5-10分钟；弃去上清，加入20l预冷预冷的10％的甘油，用移液枪轻轻上下吸动打匀，使细胞重新悬浮超低温冷冻贮存备用（－70℃）。第七十八页，共八十七页，2022年，8月28日使用的培养基最好用NaCl减半的LB培养基；密切注视细菌的生长状态和密度，尽量使用对数生长期的细胞（一般通过检测OD600来控制。DH5菌株OD600为0.5时细胞密度是5×107/ml）；制备