分子生物学实验生技生科下游

分子生物学实验生技生科下游第一页，共四十三页，2022年，8月28日实验流程一第二页，共四十三页，2022年，8月28日实验安排准备材料：重组工程菌目标蛋白的表达第1次菌体超声破壁、离心、包涵体复性、装离子交换柱第2次测酶活、定蛋白、离子交换层析第3次亲和柱层析，并对收集样品进行测活、定蛋白等

第4次对分离纯化各样品进行蛋白电泳分析第5次Westernblotting，绘出分离纯化表绘制包涵体复性曲线第三页，共四十三页，2022年，8月28日实验操作第1次：菌体超声破壁、离心、包涵体复性、装离子交换柱实验顺序：超声破壁-->离心（洗涤，注意平衡）-->装柱

-->平衡-->包涵体溶解（2hr）-->复性-->测活涉及单元实验：破壁、离心、装柱、复性、酶活测定掌握要点：破壁原理装离子交换柱方法包涵体复性原理及方法脂肪酶测活原理

第四页，共四十三页，2022年，8月28日R=CH3;C3H8…用不同碳链长度的对硝基苯酚酯(p-nitrophenyl(pNP)esters)作为底物pNP–黄色物质在405nm处有最大吸收峰底物30μl酶液100μl缓冲液

2.87ml分光光度计根据吸光值的变化率和公计算酶活测活方法第五页，共四十三页，2022年，8月28日对硝基苯酚磷酸酯p-NPP碱性磷酸酶对硝基苯酚p-NP酯酶测活原理以对硝基酚磷酸二钠为底物，根据水解磷酯键所产生的对硝基酚量测定酶活力。在37℃、pH10.0条件下，每分钟转化产生1μmol/L对硝基酚的酶量为1个酶单位第六页，共四十三页，2022年，8月28日每10秒记一个数（0、10、20、……120）将时间及其对应的A405导入EXCEL文档中，做时间t—A405曲线，得到斜率，用公式：酶活=（ΔOD405-Δ自分解）*18231.26*稀释倍数（此处为1000）（u/ml）（注：ΔOD405为曲线斜率、Δ自分解为如果底物未分解（无黄色），视为0，否则需要将底物以KPB为对照进行标定）定量测活与定性测活（2分钟测一个点）对每个收集管进行A280与酶活力定性测定第七页，共四十三页，2022年，8月28日酶标定性测活每组一条酶标版（8孔单位uL）

孔号12345678破碎上清原液原液稀释10倍原液稀释100倍原液稀释1000倍原液稀释10000倍包涵体复兴液空白对照无KPB（磷酸缓冲液）174174174174174174194酶液2020202020200底物6666666底物留待即将酶标测定时加第八页，共四十三页，2022年，8月28日实验1次序安排1超声－离心－保留上清沉淀－洗涤－离心-保留沉淀2包涵体溶解－复性放置冰箱，每次实验测活3洗柱、装柱：水1：1介质平衡50-100ml4洗试管，自然倒扣晾干（纸巾垫）5注意留样!（上清0.5ml-20度保存）注意标清组号！6登记测活数据（老师本子）8值日：A室、B室（2组/次）

公用台物品不得挪用桌面整齐出席率-平时分！冰箱分配测活次序上午定性测活！第九页，共四十三页，2022年，8月28日第十页，共四十三页，2022年，8月28日第十一页，共四十三页，2022年，8月28日实验二内容对上一次制备的上清液（8ml）/2

进行离子交换层析样品活性分析及蛋白浓度测定绘制纯化表纯度分析(蛋白电泳)第十二页，共四十三页，2022年，8月28日蛋白质分离纯化方法离子交换凝胶过滤亲和层析疏水层析……第十三页，共四十三页，2022年，8月28日凝胶过滤的工作原理第十四页，共四十三页，2022年，8月28日离子交换层析蛋白质是两性电解质可解离基团：-氨基，-羧基，侧链R基团蛋白质等电点：在某一pH值，蛋白所带正负电荷相等，即净电荷为零时溶液的pH称为该蛋白等电点第十五页，共四十三页，2022年，8月28日

离子交换层析柱层析程序：装柱、平衡、上样、洗涤、洗脱、合并样品种类：－O－CH2－CH2－N+－(CH2CH3)3二乙基氨基乙基纤维素（DEAE）

葡聚糖琼脂糖纤维素第十六页，共四十三页，2022年，8月28日离子交换层析的洗脱过程示意第十七页，共四十三页，2022年，8月28日离子强度梯度：通过不断增加离子强度，吸附到交换剂上的物质根据其静电引力的大小而不断竞争性的解脱pH梯度：当pH梯度接近各样品离子的等电点时，该物质就被解脱连续的（称梯度洗脱），不连续的（称阶段洗脱）待分离物质洗脱时常用的两种方法第十八页，共四十三页，2022年，8月28日实验设计离子交换原理离子交换层析根据化合物的净电荷进行分离？应该选用哪种层析介质？pH如何选择吸附条件及最佳吸附条件?平衡判断的标准操作手册？第十九页，共四十三页，2022年，8月28日实验二内容对上一次制备的上清液（8ml）/2

进行离子交换层析样品活性分析及蛋白浓度测定绘制纯化表纯度分析(蛋白电泳)第二十页，共四十三页，2022年，8月28日层析操作一般过程

装柱、平衡、上样、洗涤、洗脱、合并样品上样前后样品活性测定当天测定上样前后蛋白浓度测定最后一天测定上样前后样品体积测定当天测定第二十一页，共四十三页，2022年，8月28日步骤总体积（ml）蛋白浓度（mg/ml）蛋白总量（mg）酶浓度（U/ml）比活力（U/mg蛋白）总活力（U）产率（％）提纯倍数粗无细胞抽提液1000121200050.41650001001.0050C热变性除杂蛋白1000880004.80.604800961.44硫酸铵分级30％-50％饱和度沉淀部分250375011.03.672730558.83DEAE-凝胶层析，pH梯度第50-60管（5ml/管）经透析、浓缩259225889.822004423.6DEAE-纤维素KCl梯度，第21-31管（2ml/管）经透析、浓缩573536452182036.4125凝胶过滤葡聚糖凝胶G-100第31-40管（1ml/管）合并100.929.2170185170034444羟基磷灰石层析，磷酸盐梯度，第15-18管（1ml/管）合并40.7533755001500301200酶的提纯过程纯化记录表第二十二页，共四十三页，2022年，8月28日蛋白纯化过程分析纯化过程评价指标纯度检测方法柱效的初步判断：

OD280曲线和OD405曲线的重叠与纯化效果

第二十三页，共四十三页，2022年，8月28日A瓶0NNaCl100mlB瓶1NNaCl100ml第二十四页，共四十三页，2022年，8月28日1)在梯度洗脱仪中的洗脱瓶A（混合器）和洗脱瓶B（贮存器）内各装入100毫升缓冲液Ⅰ和缓冲液Ⅱ（注意加溶液的方法），注意液面应处于同一水平面，同时应排除连接管内的气泡2)开动梯度洗脱仪中的电磁搅拌器开关，调节搅拌速度，以混合器内缓冲液旋转而无明显旋涡为宜3)将洗脱瓶A、洗脱瓶B与层析柱上端连接管道打开，同时将层析柱下端接收样品4)控制洗脱流速，收集洗脱流出液约20管（3毫升/管），编号！操作要点第二十五页，共四十三页，2022年，8月28日

同一凝胶柱在不同流速下的洗脱曲线：较快的流速下得到的冼脱峰也宽流速低洗脱峰窄而高--分辨率较高，样品稀释较少

流速对洗脱曲线的影响第二十六页，共四十三页，2022年，8月28日实验2次序安排1上样（稀释一倍左右）速度要慢！洗涤（20－30ml左右）安装梯度洗脱装置200mlbuffer于左侧瓶，平衡后关闭通道，左侧加6gNaCl，然后进行梯度洗脱，（注意流速！1d/5秒5分/管），试管编号！定性测活及OD280，注意：酶活最高管留样100ul！将有酶活试管合并，精确测活酶液上清合并液留样0.5ml(上清液)用于分析，其余量好体积登记数据（上样前后精确测酶活性，体积）

定性测活和定量测活

定性测蛋白和定量测蛋白！！！留样？？？第二十七页，共四十三页，2022年，8月28日实验操作第2次：测酶活、定蛋白、离子交换层析分析

实验顺序：离心/留样/量体积！-->上柱-->定蛋白-->紫外吸收测蛋白峰、酶活曲线测定-->收集样品/留样/量体积！涉及单元实验：测酶活、定蛋白、离子交换层析

掌握要点：紫外吸收法绘蛋白浓度曲线方法

离子交换层析原理及方法

第二十八页，共四十三页，2022年，8月28日

BS－100自动部分收集器安装圈1．反全阀；2换管臂；3滴管；4，5换管臂固定螺丝；6.竖杆；7.竖杆囤定螓丝；8报警板；9.试管；10．收集盘；11.时间选挥旋钮；12.时间选择固定螺钉；13．自动开关；14、指示灯；15.电源开关；16．换向开关（逆、顺）；17．手动开关第二十九页，共四十三页，2022年，8月28日实验操作第3次：粗酶样品制备，亲和层析，并对收集样品进行分析

实验顺序：亲和层析

-->紫外吸收测蛋白峰

-->酶活曲线测定(3管)-->考马斯亮蓝法定蛋白涉及单元实验：破壁、离心、装柱、层析、分析、留样掌握要点：亲和层析原理和操作

亲和层析合并液量体积、精确测活、定蛋白

计算比活、纯化倍数、回收率（登记数据）第三十页，共四十三页，2022年，8月28日镍柱纯化实验流程

一．上清液测活二．Ni柱纯化步骤：装柱:清洗玻璃柱，连接好橡皮管，将层析柱安装到铁架台上向柱内加入1-2ml蒸馏水，再加1-2ml镍柱介质（助教完成）平衡:先用水15-20ml洗介质,再用5-10ml

平衡液（实验台上20mMTrispH8.0）平衡柱子(流速慢!)。平衡液沿柱内壁缓慢加入上样:取3ml上清液上样，上样过程中的穿出夜收集起来，再重新上样，如此循环3次！（流穿液测活）洗涤:上样完成之后，用3-5ml洗涤液（实验台上10mMTrispH8，50mM咪唑）洗去没有结合的蛋白（洗涤液测活）洗脱:用3ml洗脱液（实验台上10mMTrispH8，300mM咪唑）洗脱目标蛋白。1ml/管，收集3-5管。各管洗脱液测活。三．复性液测活第三十一页，共四十三页，2022年，8月28日各样品测活、测蛋白稀释倍数及加样量参考表

待测液测酶活DEAE离子交换:上清液上样稀释500-1000倍复性液:直接测活DEAE洗脱合并液:Ni-NTA上清液:稀释250-500倍测活第三十二页，共四十三页，2022年，8月28日实验操作第4-5次：对分离纯化各样品进行蛋白电泳分析//Westernbloting，绘出分离纯化表实验顺序：蛋白电泳，同时进行数据分析涉及单元实验：蛋白电泳掌握要点：掌握蛋白电泳方法及/Westernbloting

了解分离纯化样品纯度鉴定的各种方法绘制酶的分离纯化表第三十三页，共四十三页，2022年，8月28日1.

包涵体复性上样液2.

上清上样液（Ni柱沉淀）3.DE管活性最高管4Ni柱洗脱活性最高管5.Mark（蛋白电泳位置）6.

7.

8.

9.10点样量：20ul样品（不足用buffer补足）＋

20ulloadingbuffer

煮沸3分钟，离心Ni柱点样：上清（1/3量）、洗脱Westen电泳位置！

Mark点在最边上，并空行，用于染色要求点两块板，顺序一致！预染Mark样品处理勿忘！第三十四页，共四十三页，2022年，8月28日Ni柱点样：Ni柱洗脱活性最高管1-8组

Mark点在最边上，并空行，用于染色要求点两块板，顺序一致！走电泳时左右方向不能错，电泳结束后剪下Mark泳道，氨基黑染色Westernbloting第三十五页，共四十三页，2022年，8月28日第三十六页，共四十三页，2022年，8月28日实验目的与原理

Westernbloting技术是用来检测蛋白表达的灵敏方法由蛋白质的SDS、电转及杂交几部分组成杂交技术主要有NC膜封闭，靶蛋白与第一抗体的反应，结合靶蛋白的一抗和二抗的反应，显色等组成将凝胶上的蛋白质转移到NC膜上，用其他蛋白作为封闭液，将膜上余下的其他蛋白结合位点封闭，加入与检测蛋白特异性结合的第一抗体，经免疫反应，一抗与靶蛋白结合，经洗膜后，膜上仅在靶蛋白处结合抗体。然后加入与第一抗体有免疫特异性的二抗，使之与一抗反应，反应后经洗膜液洗涤，二抗仅存在于结合靶蛋白的一抗上。因为这种二抗都为酶标抗体，通过酶显色反应，膜上结合靶蛋白位置即将呈现一定的颜色

第三十七页，共四十三页，2022年，8月28日第三十八页，共四十三页，2022年，8月28日WESTERNBLOT第三十九页，共四十三页，2022年，8月28日从负极(黑孔板)到正极(白孔板)依次为：黑孔板、凝胶支持纤维垫、滤纸、凝胶凝