重组质粒鉴定方法解析

重组DNA转变受体细胞后，须在不一样样样水平进步行优选，以差别转变子与非转变子、重组子与非重组子以及判断所需的特异性重组子。在转变过程中，其实不是每个受体细胞都被转变；即便获取转变细胞，也其实不是都含有目的基因，所以需采纳有效方法进行优选。优选的方法包含依据遗传表型优选、限制性内切酶分析优选、核酸探针优选、PCR优选等。本实验采纳遗传表型优选中的抗生素平板优选或α互补优选的方法。一、抗生素平板优选【实验原理】目标基因是

Kan的抗性基因，而载体含

Amp

的抗性基因，所以在含有

Amp

和Kan的培育基中生

长

的

菌

落

即

为

阳

性

菌

落

。【操作步骤】1．制备含有Amp和Kan的LB琼脂培育板2．将

100μl

转变菌液用无菌涂布器平均涂布于含有

Amp

和

Kan

培育板上，

37℃培育

12-16h

。3．在含有体

Amp和培

Kan培育板上能生长的菌落即为阳性重组质粒。并将其接种于含养基2ml中培育

Kan的8-16h

LB液。4．小量制备质粒，限制性酶切分析进一步判断。二、α互补优选【实验原理】合用于含有半乳糖苷酶基因（LacZ）的载体，如pUC系列等，其原理是：载体含有LacZ的调控序列和N端146个氨基酸的编码信息。在这个编码区中插入了一个多克隆位点。当这类载体进入可编码

β-半乳糖苷酶

C端部分序列的宿主细胞后（质粒和宿主细胞编码的片段各自都没有酶活性），它们可以融为一体，形成拥有酶学活性的蛋白质，这类现象叫

α互补。由

α互补而产生的

Lac+

细菌在呈色底物

5-溴-4-

氯-3-

吲哚-β-半乳糖苷（

X-gal

）和引诱剂异丙基硫代-β-D-半乳糖苷（IPTG）存在下形成蓝色菌落。当外源DNA插入到质粒的多克隆位点后，以致产生无α互补能力的氨基端片段。所以，带有重组质粒的细菌形成白色菌落。经过呈色反应即可初步鉴别可能带有重组质粒的菌落。经过小量制备质粒DNA进行限制酶切分析，即可确立这些质粒的结构。【试剂】1．X-gal（20mg／ml）：将20mgX-gal溶于lml二甲基甲酰胺中，-20℃避光保留。2．IPTG（200mg／ml）：将1gIPTG溶于4ml去离子双蒸水中，定容至5ml，用0.22μm过滤器除菌，-20℃保存备用。【操作步骤】1．制备含相应抗生素的琼脂平板。2．于平板表面加X-gal40μl和IPTG4μl，并用无菌玻璃涂布器将试剂平均涂布于整个平板表面。37℃静置lh。3．将100μl转变的菌液涂布于平板表面，置37℃培育箱20min后，倒置平板连续培育12～16h。4．中断培育后，将平板静置4℃4h，使蓝色充分显现，平皿上显示蓝色和白色两种菌落。5．挑取白色菌落置2mlLB（含相应抗生素）液体培育基中，37℃摇床培育8～12h。6．提取质粒，以限制性酶切分析进一步判断。3．重组质粒的判断方案一菌落PCR(1制备PCR混杂液：(2用经灭菌的10μl枪头（不用牙签）挑去白色菌落，迅速地使挑取物溶在上述混杂液中。(3盖上离心管得盖子，在开水上温育10min。(4将步骤⑶的样品冷却至室温，离心数秒，此后于管中加入TaKaRarTaq酶0.25ul。(5按以下条件进行PCR反应：94℃预变性3min；此后进行30个循环反应，其温度循环条件为：94℃变性1min，57℃退火1min，72℃延长1min；循环结束后72℃再延长5min。(6取5μlPCR产物在1%琼脂糖凝胶进步行电泳检测。方案二质粒PCR1.碱裂解法少许制备质粒DNA(1用离心管采集4ml在LB培育基（含Amp）中培育过夜的菌液，14000rpm离心30秒，弃尽上清。(2用250μl已加入RNaseA1的BufferS1充分悬浮细菌积淀。(3加入250μlBufferS2，平和但充分地上下翻转混杂4-6次，此步骤不宜超出5min。*BufferS2使用后应马上盖紧瓶盖，省得空气中的CO2中和BufferS2中的NaOH，降低溶菌效率。(4加入400μlBufferS3，平和地上下翻转8-10次，室温静置2min，14000rpm离心10min。*若离心后凝结块未积淀到离心管底部，应再上下翻转数次，12000g离心3min。(5将DNA-prepTube置于2-mlMicrofugeTube中，将步⑷中的混杂液移入DNA-prepTube中，5500rpm离心1min。(6弃滤液，将DNA-prepTube置回到原2-mlMicrofugeTube中，加入500μlBufferW1，5500rpm离心1min。(7弃滤液，将W2，5500rpm

DNA-prepTube置回到原2-mlMicrofugeTube中，加入700μl已加无水乙醇的离心1min，以相同的方法再用700μl已加无水乙醇的Buffer

BufferW2冲刷一次。一般有三种判断方法

:1阳性克隆培育