基因工程抗体和抗体工程

第五节抗体工程抗体研究进展3个阶段：①1890年白喉抗毒素，多克隆抗体；②1975年杂交瘤技术单克隆抗体；③1994年基因工程抗体；Cgenescodefortheconstantregionsofimmunoglobulinproteinchains.

Vgeneissequencecodingforthemajorpartofthevariable(N-terminal)regionofanimmunoglobulinchain.Immunoglobulingenesareassembledfromtheirpartsinlymphocytes

Figure24.4Heavyandlightchainscombinetogenerateanimmunoglobulinwithseveraldiscretedomains.ImmunoglobulingenesareassembledfromtheirpartsinlymphocytesFigure24.4Heavyandlightchainscombinetogenerateanimmunoglobulinwithseveraldiscretedomains.ImmunoglobulingenesareassembledfromtheirpartsinlymphocytesTable24.1EachimmunoglobulinfamilyconsistsofaclusterofVgeneslinkedtoitsCgene(s).Immunoglobulingenesareassembledfromtheirpartsinlymphocytes

FamilyVGenesCGenesManMouseManMouseLambda<3002>64Kappa<300~100011Heavy~300>100098Figure24.5ThelambdaCgenesegmentisprecededbyaJsegment,sothatV-Jrecombinationgeneratesafunctionallambdalight-chaingene.ImmunoglobulingenesareassembledfromtheirpartsinlymphocytesFigure24.6ThekappaCgenesegmentisprecededbymultipleJsegmentsinthegermline.V-JjoiningmayrecognizeanyoneoftheJsegments,whichisthensplicedtotheCgenesegmentduringRNAprocessing.ImmunoglobulingenesareassembledfromtheirpartsinlymphocytesFigure24.7Heavygenesareassembledbysequentialjoiningreactions.FirstaDsegmentisjoinedtoaJsegment;thenaVgenesegmentisjoinedtotheDsegment.ImmunoglobulingenesareassembledfromtheirpartsinlymphocytesFigure24.8ThelambdafamilyconsistsofVgenesegmentslinkedtoasmallnumberofJ-Cgenesegments.Thediversityofgermlineinformation

Figure24.9ThehumanandmousekappafamiliesconsistofVgenesegmentslinkedto5JsegmentsconnectedtoasingleCgenesegment.Thediversityofgermlineinformation

Figure24.10Asinglegeneclusterinmancontainsalltheinformationforheavy-chaingeneassembly.ThediversityofgermlineinformationFigure24.12Consensussequencesarepresentininvertedorientationateachpairofrecombiningsites.Onememberofeachpairhasaspacingof12bpbetweenitscomponents;theotherhas23bpspacing.RecombinationbetweenVandCgenesegmentsgeneratesdeletionsandrearrangementsFigure24.13Breakageandreunionatconsensussequencesgeneratesimmunoglobulingenes.RecombinationbetweenVandCgenesegmentsgeneratesdeletionsandrearrangementsFigure15.8Reciprocalrecombinationbetweendirectrepeatsexcisesthematerialbetweenthem;eachproductofrecombinationhasonecopyofthedirectrepeat.RecombinationbetweenVandCgenesegmentsgeneratesdeletionsandrearrangementsFigure15.9Reciprocalrecombinationbetweeninvertedrepeatsinvertstheregionbetweenthem.一、噬菌体抗抗体库技术的的

基本方法法⒈获取目的基基因⒉抗体库技术术的载体⒊淘筛⒋表达与鉴定定它是在PCR技术和PhageDisplay的基础上上实现的。其其过程是把用用PCR法得得到的抗体基基因插入丝状状噬菌体的DNA，与噬噬菌体外壳蛋蛋白的基因相相连，在辅助助噬菌体的帮帮助下，噬菌菌粒包装成丝丝状噬菌体，，抗体分子通通过与PⅢⅢ或PⅧ相连连，在噬菌体体表面的一端端或分散分布布，然后可直直接对噬菌体体表面的抗体体分子进行筛筛选。噬菌菌体体抗抗体体库库技技术术1990年年McCafferty等等成成功功地地建建立立了了噬噬菌菌体体表表面面展展示示系系统统，，通通过过将将抗抗溶溶菌菌酶酶单单链链抗抗体体基基因因克克隆隆于于fd噬噬菌菌体体基基因因3的的下下游游，，使使ScFv以以融融合合蛋蛋白白的的形形式式展展示示于于噬噬菌菌体体表表面面，，利利用用亲亲和和层层析析，，两两轮轮富富集集达达106倍。该技技术的成成功给抗抗体基因因的筛选选工作带带来了革革命性的的变革。。噬菌体表表面展示示系统(phagesurfacedisplaysystem)噬菌体表表面展示示文库技技术的要要点:外源基因因表达多多肽以融融合蛋白白形式展展示在外外壳蛋白白N端将基因组组合文库库插入噬噬菌体编编码膜蛋蛋白的基基因g3或g8的的先导系系列的紧紧靠下游游随机克隆隆入相应应载体形形成组合合文库从免疫或或未被免免疫的B细胞中中PCR扩增抗抗体全套套基因片片段用固相化化抗原经经“亲和和结合一一洗脱一一扩增””数个循循环直接接、方便便、简捷捷、高效效地筛选选出表达达特异性性好、亲亲和力强强的抗体体噬菌体体库。使翻译译出的的抗体体分泌泌到细细菌的的质周周腔内内，形形成游游离的的抗体体片段段，经经过纯纯化即即可获获得目目的抗抗体。。筛选到到的噬噬菌体体再将将基因因g3或g8切切除后后，转转入大大肠杆杆菌，，该项技技术的的优点点:将抗体的的基因因型和和表型型紧密密联系系起来;可绕过过杂交交瘤技技术，，不需需要复复杂的的基因因工程程技术术;抗体基基因筛筛选的的范围围广;技术稳稳定、、可靠靠、生生产周周期短短;可可规模模化生生产;适用范范围广广，既既可用用于抗抗体制制备，，也适适用于于其它它蛋白白如激激素、、酶、、药物物、随随机多多肽等等的生生产。。噬菌体体抗体体库技技术的的发展展具有有很大大优越越性。。它简简单易易行，，筛选选容量量大，，效率率高，，绕过过了细细胞融融合及及免疫疫等步步骤，，而且且在表表型一一基因因型的的统一一和识识别一一增殖殖过程程上模模拟了了B细细胞的的成熟熟过程程，从从而在在实际际应用用上具具有很很大意意义。。二、噬噬菌体体抗体体库技技术的的特特点⒈模拟拟天然然全套套抗体体库⒉避开开了人人工免免疫和和杂交交瘤技技术⒊可获获得高高亲和和力的的人源源化抗抗体单克隆隆抗体体噬噬菌体体抗体体杂杂交交瘤技技术展展示示技术术宿主细细胞:杂杂交瘤瘤细细菌菌筛选范范围:~103107109时间:几几个个月几几周周操作:繁繁杂杂相相对简简单免疫:必必须可可避避免人源抗抗体:+费用:高高低低生产量量:有有限限无无限基因获获取:再再克隆隆直直接应用前前景:有有限不不可估估三、基因工工程抗体表表达⒈原核细胞胞表达⒉真核细胞胞表达⒊转基因植植物表达⒋转基因动动物表达第六节抗抗体诊断断试剂一、血清学学鉴定用的的抗体类试试剂⒈鉴定病原原菌的抗体体试剂⑴常用诊断断血清的品品种和用途途①沙门氏菌菌属诊断血血清②志贺氏菌菌属诊断血血清③病原性大大肠埃希氏氏菌诊断血血清⑵诊断血清清的制备步步骤①制备细菌菌抗原②免疫动物物和制备抗抗体血清⑶诊断血清清诊断方法法⒉乙型肝炎炎病毒表面面抗原的反向被动血血凝诊断试试剂⒊妊娠诊断断试剂⒋抗ABO血型系统统血清二、免疫标标记技术用用的抗体类类试剂⒈荧光抗体体诊断试剂剂⑴荧光抗体体的制备⑵免疫荧光光测定方法法⒉免疫酶抗抗体诊断试试剂⑴免疫酶染染色法用抗抗体诊断试试剂⑵酶免疫测测定用抗体体诊断试剂剂①HBsAg酶标诊诊断试剂②HBeAg酶标诊诊断试剂③HAVAg（甲型型肝炎病毒毒抗原）酶标诊断试试剂④测定HIV（人免免疫缺陷病病毒）抗原的酶标抗抗体诊断试试剂⑤甲胎蛋白白（AFP）酶标抗抗体诊断试剂⑥癌胚抗原原（CEA）的酶标标抗体诊断试剂⒊放射免疫疫用抗体诊诊断试剂放射免疫技技术是将放放射性核素素分析的高高度灵敏性性与抗原抗抗体反应的的特异性结结合起来建建立的检测测技术。放射性核素素标记抗体体的方法：：①氯胺-T法②Iodogen氏氏法抗原的测定定有：①夹心法②间接法③竟争法3.竞争法法Ag※Ag※Ab+AbAg(标本本)(定定量)AgAbEE终止液标本酶标抗体底物显色显色固相固相标本酶标二抗底物1.夹心法2.间接法①HBsAg放射性核素素标记抗体诊断试剂②HBeAg放射性核素素标记抗体诊断试剂③HAV抗原原放射性核素素标记抗体诊断试剂④AFP放射射性核素标记记抗体诊断试剂⑤CEA放射射性核素标记记抗体诊断试剂常用标记抗体体试剂有：三、导向诊断断药物放射性核素标标记抗体肿瘤放射免疫疫显像放射免疫显像像优点：①在体内确切切肿瘤定位作作用，准确性性达90%，，灵敏度达100%。②在体内可检检出0.5cm大小的病病灶，并可检检出肺脑的转转移灶。③小分子抗体体易到达肿瘤瘤部位，可显著提高N/NT值。。④抗体体在肿肿瘤部部位可可保留留6～～9日日⑤能观擦擦抗体体在血血中的的半衰衰期和和可能出出现的的不良良反应应。放射免免疫显显像定定位技技术将抗肿肿瘤单单克隆隆抗体体（Ab））与二二乙基基三胺胺五乙乙酸（（DTPA）在在体外外偶联联成Ab-DTPA，再再注入入体内内后，，就能能与体体内组组织相相结合合。由由于抗抗体分分子量量大，，需3天完完成。。3天天后注注入放放射性性核素素In-113M（（半衰衰期100m）），因因DTPA是重重金属属离子子络合合剂，，所以以In-113M可可以结结合到到DTPA分子子上，，使肿肿瘤组组织显显像。。这一一过程程在2小时时内可可完成成。建立预定定位技术术需解决决3个问问题：①抗体在在肿瘤组组织滞留留要7天天以上。。②②Ab-DTPA偶偶联物比比较稳定定；③内源性性金属离离子对DTPA的封闭闭作用要小小。第六节抗抗体体治疗药药物以抗体为为载体的的导向治治疗药物物，还不不成熟。。一、放射射性核素素标记的的抗体治治疗药物物抗体作为为放射性性核素的的导向载载体，标标记操作作简便用用量小。。放射性性核素标标记的抗抗体对肿肿瘤细胞胞杀伤较较大。二、抗癌药药物偶联的的抗体药物物⒈常用的抗抗癌药物氨甲喋呤（（MTX））、阿霉素素（ADM）、丝裂裂霉素（MMC）等等。以人血血浆白蛋白白作为中间间载体，可可明显提高高每分子抗抗体所携带带的MTX量，使体体外细胞毒毒性体高二二倍。⒉抗体类药药物逆转耐耐药性肿瘤细胞对对抗原药物物可产生多多药耐药性性（MDR）。MDR是由由基因调控控的，其编编码蛋白称称为P糖蛋蛋白，其中中P170是与肿瘤瘤耐药相关关的主要蛋蛋白，由Mdr1基基因编码，，1280氨基酸残残基，分子子量170K。认为P蛋白白是ATP酶依赖性性药泵，药药物进入细细胞后与P蛋白结合合，利用ATP水解解释放的能能量将药物物泵出胞外外，使胞内内药物蓄积积减少，因因而产生耐耐药性。三、毒素素偶联的的抗体药药物⒈免疫毒毒素及其其换代制制品在导向向药物物中，，毒素素和抗抗体的的交联联物称称为免免疫毒毒素。。第一代代免疫疫毒素素是包包含有有A、、B链链完整整毒素素和抗抗体的的交联联物，，其中中B链链非特特异性性结合合，使使其仅仅在体体外应应用。。第二代代