基因的重组与转移

外源DNA载体DNA重组分子原核细胞真核细胞扩增或表达表达连接转化或转导电穿孔或显微注射受体细胞第六章

基因的重组与转移

一、粘性末端的连接DNA连接酶把相互靠近的5’端磷酸与3’-OH连到一起。第一节DNA片段的体外连接1.两段DNA的连接依靠粘性末端2.DNA片断与载体的连接依靠粘性末端ligasenick二、齐平末端（bluntend）的连接5’端与3’端并列靠近的时间太短，不容易被连接酶连接。1.直接连接T4DNA连接酶虽然能连接平末端，但效率很低，只有粘性末端的1%。5’

5’

5’

5’

3’

3’

3’

3’

-OH-OH-P-PP-P-HO-HO-5’

3’

-OH-PP-HO-5’

3’

1972年，斯坦福大学的P.Labban和P.Kaiser提出。（1）同聚加尾

法

2.人工加尾形成“粘性末端”

DNA末端转移酶能在没有模板的情况下给DNA的3’-OH端加上脱氧核苷酸。①原理：分别给载体和插入片断加上互补的核苷酸。②加尾—碱基互补④缺点：③优点：能把任何片段段连接起来不能把插入片片段再切下来来。非酶切位点用T4DNA连接酶连到平平端DNA上，然后再用用酶切，形成成一个人工粘粘性末端。（2）衔接物(linker)连接①linker用化学合成法法合成的一段段10-12bp的特定限制性性内切酶识别别位点序列的的平端双链。GGAATTCCCCTTAAGGEcoRIlinker：②linker的作用④缺点：1）可以用内切切酶把插入片片段切下来。。如果插入片段段内部也有该该酶位点，不不能切下完整整的插入片段段2）能给载体连连接上Polylinker:③优点：（3）DNA接头(adapter)连接法1978年康内尔大学学的吴瑞教授授发明。5‘p-GATCCCGG-OH3’GGCC-p5’BamHIadapter用T4DNA连接酶连到DNA分子的两端，，直接成为人人工粘性末端端。①adapter一头平末端、、另一头粘性性末端（某种种酶切位点序序列）。②adapter的作用Blunt-endedDNA5’p-GATCCCGG-OH3’HO-GGCC-p5’’BamHIadapterP--P5‘p-GATCCCGG-GGCC--CCGG-GGCCCTAG-P5’5‘p-GATCCCGG-GGCC-CCGGGGCCCTAG-P5’CCGGGATCCCGG-OHGGCCCTAGGGCC-P5’接头自我连接接接头与接头会会彼此以粘性性末端接在一一起，影响与与DNA片段的连接。。③优点：连上后就能用用。④缺点：先用小牛肠碱性磷酸酶（CIP）处理接头，，水解掉其5’端的磷酸，防防止自我连接接。（以后再用T4多核苷酸激酶酶加上磷酸。））⑤防止自我连连接5‘p-GATCCCGG-OHHO-GGCC-PP-CCGG-OHHO-GGCCCTAG-P5’CCGGGATCCCGG-OHHO-GGCCCTAGGGCC5’’接头之间不能能形成磷酸二二酯键自我连连接！5‘GATCCCGG-OHHO-GGCC5’5’CCGG-OHHO-GGCCCTAG5’CIP处理-OHHO-Blunt-endedDNA5’p-GATCCCGG-OH3’’HO-GGCC-p5’’BamHIadapterP--P5‘GATCCCGG-HO-GGCCCCGG-OH-GGCCCTAG5’5’GATCCCGG-OH3’’HO-GGCC5’’缺口口缺口口HO--OHCIP处理理T4ligase虽然然有有缺缺口口，，但但仍仍然然能能与与DNA片片断断连连接接。。三、、PCR产物物的的连连接接1.在引物的5’端设计酶切切位点符合载体的的多克隆位位点；（1）设计原则则（2）带酶切位位点的引物物的结构3’端15~20bp与模板互补补；5’端6~10bp是某个内切切酶的识别别序列。（5’端多多余的3~5bp属属保护碱基）避免与所扩扩增的DNA片断内内部酶切位位点重复。。引物1GCAGAATTC互补序列模板EcoRI位点5’--3’GCAGAATTC互补序列5’--3’3’模板GCAGAATTC互补序列PCR产物5’--3’3’复性延伸模板模板3’3’GCTAGCCGG互补序列模板BamHI位点-5’3-’5’复性延伸模板模板3’3’GCTAGCCGG互补序列-5’3’-模板5’GCTAGCCGGPCR产物互补序列-5’3’-引物2带酶切位点点的PCR产物GCAGAATTCPCR产物5’--3’GCTAGCCGGPCR产物-5’3’-CGTCTTAAGCGATCGGCCEcoRI位点BamHI位点AATTCPCR产物5’--3’GCTAGPCR产物-5’3’-GCEcoRIBamHI两头各有一一个粘性末末端！2.与T载体直接连连接（1）PCR产物两个3’端一般都有有一个ATaqDNA聚合酶的特特性：在DNA双链的3’端再加上一一个多余的的核苷酸（（优先加A）。（2）T载体的两个个3’端人为地各各加一个T利用TaqDNA聚合酶，当当原料中只只有dTTP时，被迫在在平端载体体上添加T！AAdNTPTTdTTPTaqDNA聚合酶载体PCR产物TATA四、DNA体外连接应应注意的事事项插入片断与与载体的酶酶切位点互互补相同的粘性性末端才能能有效地连连接。尽量避免平平端连接。。决不能进行行非粘性末末端连接。。EcoRIEcoRIEcoRI（1）用相同的的酶切（2）用同尾酶酶切BamHI、BclI、BglII、Sau3AI、XhoII都产生GATC4个碱基的粘粘性末端。。2.DNA插入的方向向正确（1）用双酶切切由于产生的的粘性末端端不同，只只能以固定定方向连接接。EcoRIBamHIEcoRIBamHIEcoRIBamHI3.插入基因的的开放阅读读框（ORF）正确（1）DNA定向插入（2）起始密码码尤其当载体上有ATG起始密码的的时候，更更要注意。。ATGGAATTC载体ATGCGGAATTCT插入片断EcoRIEcoRIATGGAATTCT重组但移码突变变！4.防止载体自自身环化连连接（1）提高插入入片断的用用量连接反应体体系中，插插入片断比比载体多10倍以上。（2）用碱性磷磷酸酶处理理载体载体切口的的5’磷酸被除去去，不能自自我连接。。但可以与与插入片断断以单链连连接。5’3’载体插入入片片断断1.载体体自自身身环环化化连连接接（（能能存存活活））2.载体之间间互相连连接（能能存活））3.插入片段段互相连连接（不不能存活活）4.一个载体体与几个个插入片片段重组组（能存存活）五、载体体和外源源DNA插入片段段的连接接结果5.几个载体体与一个个插入片片段重组组（能存存活）171.目的增加受体体菌细胞胞膜的通通透性。。第二节重组体导导入细菌菌细胞一、感受受态大肠肠杆菌的的制备使用丧失失了限制体系系的大肠杆杆菌。如如K12系列的大大肠杆菌菌。2.菌种用CaCl2处理大肠肠杆菌，，能增加加膜的通通透性。。3.制备原理理4.制备过程程培养大肠肠杆菌OD600至Onice5-10min4℃离心收收集菌用冰冷的的60mMCaCl2重悬4℃离心收收集菌4℃离心收收集菌分装、-70℃冻存用冰冷的的60mMCaCl2重悬Onice30min用冰冷的的60mMCaCl2重悬二、重组组DNA导入大肠肠杆菌（1）转化（（transformation)大肠杆菌菌捕获质粒DNA的过程。。（2）转染（（transfection)大肠杆菌菌捕获噬菌体DNA的过程。。1.外源DNA导入细菌菌的几种种方法（3）转导（（transduction)借助噬菌体把外源DNA导入细菌菌的过程程。每gDNA转化成功功的细菌菌克隆数数。3.转化方法法2.转化率简单，但转化化效率不不高（106-108/gDNA）。（1）热休休克法法（heatshock）转化效效率高高（高高于109/gDNA）。（2）电转转化法法10ng载体DNA100L感受态态菌Onice混合，，静置置10分钟42ººC1分钟加入1mLLB培养基基37℃摇1小时10-100L转化液液涂含含抗菌菌素的的平板板吸附DNA摄入DNA（1）热休休克法法LB培养受受体菌菌至OD600冰浴15分钟，，2°C离心集集菌冰冷的的水重重悬菌菌体2°C离心集集菌冰冷的的水重重悬菌菌体2°C离心收收集菌菌体少量冰冰冷的的水重重悬分装成成50-300L电转仪仪调为为2.5kV,25F脉冲控控制器器200-4000.5g质粒DNAOnice混合加入1mLSOC培养液液37°C中速震震荡60分钟10-100L转化液液涂含含抗菌菌素的的平板板转化（2）电转转化法法4.平板培培养基基培养养细菌菌10-100L转化液液涂于含含抗菌菌素的的平板板37℃过夜夜环形重重组质质粒质粒自自我连连接线性载载体或或DNA片片断进进入细细菌会会被降降解。。①环形质质粒数数（1）重组组质粒粒5.影响转转化率率的因因素①生长长状态态制备感感受态态菌必必须使使用对对数生生长期期的菌菌。②必须须在冰冰冷的的条件件下制制备。。要充分分，使使细菌菌细胞胞膜失失去一一些蛋蛋白。。④储存存感受受态菌菌要在在-70℃以下下③CaCl2处理⑤使用用感受受态菌菌时必必须迅迅速融融化融化后后一般般不能能再次次冻存存使用用。（2）感受受态细细胞（competentcells)把重组组的噬噬菌体体DNA或Cosmid质粒DNA包装成成具有有感染染能力力的噬菌体体颗粒粒。6.体外包包装的的噬菌菌体的的转导导（1）体外外包装装（invitropackaging）（2）转导导（transduction）通过受体菌菌细胞表面面的DNA接受器位点点（receptorsite)，使带有外外源基因的的重组体DNA注入受体大大肠杆菌进进行扩增。。cI857基因是个温温度敏感性性阻遏蛋白白基因，感感染细菌后后，在32℃下培养养细菌时时能够保保持溶源源性。但当当温温度度升升高高到到44℃—45℃时时，，就就会会导导致致cI基因因编编码码的的阻阻遏遏蛋蛋白白失失活活，，DNA复制制、、外外壳壳蛋蛋白白合合成成。。便便于于提提取取外外壳壳蛋蛋白白。。（3）cI857基因突突变的的噬菌体体但由于于该噬噬菌体体的S基因上上有一一个突突变，，所以以细菌菌还不不裂解解。cI857其它基基因溶源状状态（（DNA不转录录、不不翻译译）DNA阻遏蛋白阻遏蛋白44℃—45℃DNA转录、、翻译译合成成外壳壳蛋白白32℃噬菌体体1外壳蛋蛋白基基因E发生了了无义义突变变，不能合合成头头部蛋蛋白，但能能合成成其它它外壳壳蛋白白（尾尾部蛋蛋白））。在cI857基因突突变的的噬菌体体的基基础上上，选选择两两种外外壳蛋蛋白的的突变变型噬菌体体。（4）互补型型噬菌菌体外壳蛋蛋白基基因D发生了了无义义突变变，不能合合成头头部的的包装装识别别蛋白白，但能能合成成其它它外壳壳蛋白白（头头部、、尾部部蛋白白）。。噬菌体体2(5)体外包包装过过程体外包包装好好的重重组噬噬菌体体感染染受体体菌，，使受受体菌菌发生生溶菌菌，形形成噬噬菌斑斑。（（每gDNA能形成成106噬菌斑斑）。。（6）转导转化率率高的的菌株株；有突变变的菌菌株（（与导导入的的载体体基因因互补补）；；不育的的菌株株（不不会与与其他他酵母母接合合）。。第三节节外源基基因导导入真真核细细胞一、导导入酵酵母细细胞1.菌株选选择如：ura3-52,trp1-289,leu2-3,leu2-112,his31（1）利用用原生生质球球进行行转化化2.酵母的的转化化方法法酵母原生质质体感受态态酶去壁壁CaCl2、PEG插入外外源基基因的酵母母载体体PEG（聚聚乙二二醇））使细胞壁壁具有通通透性性，允允许DNA进入入。CaCl2使细胞膜膜具有通通透性性，允允许DNA进入入。转化酵母0.1mol/LLiCl处理插入外外源基基因的的酵母母载体体感受态态40%PEG4000（2）利用用Li+盐进行行转化化叶盘消毒切取土壤农农杆菌菌浸泡泡看护培培养基基愈伤组组织分化幼幼苗二、导导入植植物细细胞1.叶盘法法（leafdisk)植物细细胞原生质质体纤维素素酶和和果胶胶酶DNA混合入入电击击缓冲冲液1-2kV,3-25F电击愈伤组组织幼苗分化2.电击法法（electroporation)又称高速微微型子子弹射射击法法（High-velocitymicroprojectiles)DNA1.2m钨弹头头吸附特制手手枪射击植植物装入3.基因枪枪法（（genegun）4.脓杆菌菌（agrobacterium）介导导农杆菌菌:usedextensivelyforgeneticengineeringofplants.包含Ti质粒Tumorinducingplasmid(bacterialplasmid)T-DNA(Transferred-DNA),可可以转转移进入入植物基基因组.TumorinducedbyA.tumefaciens农杆菌（agrobacterium）A、Ti质质粒介导导的整合合转化程程序几乎所有有的双子子叶植物物尤其是是豆科类类植物的的根部常常常会形形成根瘤瘤，这是是由于植植物根部部被一种种革兰氏氏阴性土土壤杆菌菌农杆根瘤菌（（A.tumefaciens）感染所致致，其致致瘤特性性是由该该菌细胞胞内的野生型质质粒Ti（Tumor-inducing）介导的。。（1）Ti质质粒的结结构与功功能TiPlasmidT-DNAregionLeftborderRightbordervirgenesori已知农杆杆菌附着着到植物物细胞后后，只留留在细胞胞间隙中中。T-DNA首先在在细菌中中被加工工、剪切切、复制制，然后后转入植植物细胞胞。auxinTi质粒粒是根癌癌农杆菌菌染色体体外的遗遗传物质质，为双双股共价价闭合的的环状DNA分分子，其其分子量量为95～156×106D,约约有200kb组成。。根据其诱诱导的植植物冠瘿瘿瘤中所所合成的的冠瘿碱碱种类不不同，Ti质粒粒可以被被分成四四种类型型：章鱼碱型型(octopine)胭脂碱型型(nopaline)农杆碱型型（agropine）农杆菌素素碱型（（agrocinopine）或称称琥珀碱碱型(succinamopine)Ti质粒粒的遗传传特性及及类型a、Ti质粒粒的图谱谱整个质粒粒160-240kb其中T-DNA12-24kbtms的编码产产物负责责：合成吲哚哚乙酸tmr的编码产产物负责责：合成植物物分裂素素tmt的编码产产物负责责：合成氨基基酸衍生生物冠瘿碱b、Ti质粒粒致瘤的的分子机机制损伤的植植物根部部会分泌泌出乙酰酰丁香酸酸和羟基基乙酰丁丁香酸，，它们能能诱导Ti质粒粒上的vir基因以及及根瘤菌菌染色体体上的一一个操纵纵子表达达。vir基因产物物将Ti质粒上上的T-DNA单链切切下，而而根瘤菌菌染色体体上的操操纵子表表达产物物则与单单链T-DNA结合形形成复合合物，后后者转化化植物根根部细胞胞。c、T-DNA的染色色体整合合机制T-DNA的染染色体整整合机制制d、Ti质粒粒的改造造除去T-DNA上的生生长素（（tms）和分裂素素（tmr）生物合成成基因，因因为大量的的生长素和和分裂素会会抑止细胞胞再生长为为整株植物物；除去T-DNA上的的有机碱生生物合成基基因（tmt）；因为有有机碱的合合成大量消消耗精氨酸酸和谷氨酸酸，影响植植物细胞的的生长；安装大肠杆杆菌复制子子，使其能能在大肠杆杆菌中复制制，以利于于克隆操作作；安装植物细细胞的筛选选标记，如如neor基因，使用用植物基因因的启动子子和polyA化信信号序列；；安装多聚人人工接头以以利于外源源基因的克克隆。除去Ti质粒上上的其它非非必需序列列，最大限限度地缩短短载体的长长度；共整合转化化程序二元整合转转化程序将外源基因因克隆在大大肠杆菌-农杆菌穿穿梭质粒的的T-DNA区内；；重组质粒直直接转化农农杆菌株，，该菌株携携带只含vir区不含T-DNA区区的Ti辅辅助质粒；；以上述重组组农杆菌感感染植物细细胞。binaryTivectorsystemB农农杆菌菌介导导的遗遗传转转化：：转化方方法研研究及及宿主主范围围的拓拓展;转化机机制研研究;大片段段的DNA转移移;植株原原位转转化（（inplantatransformation).转化方法研研究及宿主主范围的拓拓展农杆菌有严严格的宿主主范围，它它比较易浸染双双子叶植植物，对单子叶叶植物不不敏感。但近年年来有一一定进展展，农杆杆菌在一定条条件下同样可可以感感染单单子叶叶植物物。利利用农农杆菌菌介导导分别别从水水稻、、小麦麦、玉玉米、、甘蔗蔗等获获得了了转基基因植植株。。下面面几个个因素素使农农杆菌菌介导导转化化单子子叶植植物获获得进进展：：使用酚酚类物物质诱诱导vir基因表表达。。首先发发现AS（（乙酰酰丁香香酮））和HO-AS能诱导导vir基基因表表达，，后来来发现现邻苯二二酚40多多类酚酚类物物质对virG有诱诱导活活性。。多种种酚类类复合合物比比单一一酚类类物质质的诱诱导活活性更更高。。此外外，较低的的pH、低低于280C的温温度、、较高高的渗渗透压压、一些些糖类类等均均能诱诱导vir基因表表达。。转化方方法研研究及及宿主主范围围的拓拓展广寄主主范围围农杆杆菌菌菌株的的筛选选。主要是是在农农杆菌菌菌株株的筛筛选、、质粒粒载体体的构构建及及菌株株与载载体的的互作作等方方面进进行了了大量量工作作。使用单单子叶叶植物物特异异启动动子（（如Actin,Ubiquione,andα-Amylase的的启动动子代代替35S启动动子）和利利用分分生组组织与与农杆菌菌共培培养。。目前已已清楚楚决定定农杆杆菌与与玉米米的亲亲和性性的是是农杆杆菌的的virA基因，对该基基因进行改造造可望提高农农杆菌对单子子叶植物的亲亲和性。生长和分裂旺旺盛的胚性愈愈伤组织被认认为是获得单单子叶植物转转化成功的关关键因素之一一。转化机制研究究T-DNA整整合进植物基基因组的机制制比较复杂，，对其进行研研究有助于建建立转基因新新方法。插入入T-DNA区的基因本本身与T-DNA的转移移无关，仅两两侧的25bp同向重复序列列是必须的,而且右边界界更重要。其其中14bp是保守的。。整合进植物基基因组的T-DNA会有有一定程度的的缺失、重复复、填充和超超界发生，甚甚至有整个质质粒整合进基基因组的报道道。T-DNA转转移主要与vir区各基基因的协调作作用有关。大片段DNA的转移通常转移的基基因都是一个个或几个功能能基因，片段段比较小（<30kb)。可是，植植物的一些性性状，如抗病病、抗虫、抗抗逆境、高产产优质等均为为数量性状，，或者相关的的基因往往成成簇排列。这这些性状的改改造需要一个个能将大片段段DNA转入入植物细胞并并稳定表达的的体系。最近构建了一一种新型载体体，它具有细细菌人工染色色体（BACs)和农杆菌双元载载体的特点，能转转移大片段DNA。即BiBAC载体，目前在在主要农作物物的改良中应应用还比较困困难，但在水水稻中可以有有效应用。功能基因组的的研究要求创创造很多突变变体，需要寻寻求简单的转转基因方法。。主要在拟南南芥中应用，，大量的植株株抽真空20分钟，使细细菌进入植物物细胞间隙，，或者将花朵朵抽真空让细细菌进入，这这种方法避免免了细胞培养养过程，但转转化效率不高高。植株原位转化化（inplantatransformation)SAAT:sonication-assistedAgrobacterium-mediatedtransformationTransgenicResearch6,329-336.超声波生物作作用机制：超声波的概念念：频率高于于人类听觉上上限频率(约约20000赫)的声波波，称为超声声波，或称超超声。利用低声强脉脉冲超声波的的物理作用，，击穿细胞膜膜造成通道，，使外源DNA进进入细胞，，直接转化细胞胞，包括有细胞胞壁的植物细细胞。利用超声波给给植物转化受受体创造大量量的，分布均均匀