基因工程的基本操作程序五

1.2基因工程的基本操作程序基因工程的基本操作程序

主要包括四个步骤：（1）目的基因的获取（2）（3）将目的基因导入受体细胞（4）目的基因的检测与鉴定基因表达载体的构建一、目的基因的获取2、获取方法：（1）从基因文库中获取目的基因；（2）利用PCR技术扩增目的基因；（3）通过DNA合成仪用化学方法直接人工合成。1、目的基因：主要指的是编码蛋白质的基因，也可以是一些具有调控作用的因子。（一）从基因文库中获取目的基因1.什么叫基因文库？基因文库

基因组文库部分基因文库（如cDNA文库）将含有某种生物不同基因的许多DNA片断，导入到受体菌的群体中，各个受体菌分别含有这种生物的不同基因，称为基因文库。（1）基因组文库的构建模式图通过对受体菌的培养而储存基因以目的基因转录成的信使RNA为模板，再反转录酶的催化下反转录成互补的单链DNA，然后在DNA聚合酶的作用下合成双链DNA，即cDNA，从而获得所需的基因。（2）cDNA构建方法-----反转录法基因组DNA文库cDNA文库（3）基因组DNA文库与cDNA文库的构建补：原核细胞的基因结构非编码区非编码区编码区编码区上游编码区下游与RNA聚合酶结合位点启动子终止子

RNA聚合酶能够识别调控序列中的结合位点，并与其结合。转录开始后，RNA聚合酶沿DNA分子移动，并以DNA分子的一条链为模板合成RNA。转录完毕后，RNA链释放出来，紧接着RNA聚合酶也从DNA模板链上脱落下来。启动子：位于基因首端的一段特殊的DNA片断，它是RNA聚合酶识别和结合的部位，有了它才能驱动基因转录出mRNA，最终获得蛋白质。终止子：是位于基因尾端的一段特殊的DNA片断，能终止mRNA的转录。①不能转录为信使RNA，不能编码蛋白质。：能转录相应的信使RNA，能编码蛋白质编码区非编码区原核细胞的基因结构②有调控遗传信息表达的核苷酸序列，在该序列中，最重要的是位于编码区上游的RNA聚合酶结合位点。非编码区非编码区编码区编码区上游编码区下游启动子终止子补：真核细胞胞的基因结构构编码区非编码区非编码区与RNA聚合酶结合位点内含子外显子能够编码蛋白白质的序列叫叫做外显子不能够编码蛋蛋白质的序列列叫做内含子子启动子终止子编码区上游编码区下游内含子：外显子：真核细胞的基基因结构构编码区非编码区外显子：能编编码蛋白质的的序列内含子：不能能编码蛋白质质的序列：有调控作用的核核苷酸序列，包括位于编码码区上游的RNA聚合酶结合位位点。非编码序列：：包括非编码区区和内含子结构基因外显子内含子转录、加工修修饰mRNA原核细胞真核细胞不同点编码区是_____的编码区是间隔的、_____的相同点都由能够编码蛋白质的______和具有调控作用的______

区组成的原核细胞与真真核细胞的基基因结构比较较连续不连续编码区非编码基因组文库和和部分基因文文库的比较文库类型cDNA文库基因组文库文库大小基因中启动子基因中内含子基因多少物种间基因交流小大无有无有某种生物的部部分基因某种生物的全全部基因可以部分基因可以以基因表达的计计算在真核生物中中，对应的是是的碱基数DNAmRNA蛋白质转录翻译6 31氨基酸数碱基数？补充资料基因中外显子子思考：如何从基因文文库中得到所所需要的基因因？依据：目的基基因的有关信信息。如：根据基因因的核苷酸序序列；基因的功能；；基因在染色体体上的位置；；基因的转录产产物mRNA；基因翻译产物物蛋白质等特特性。注意：基因文库中不是直接保保管相应基因因，而是保存受体菌，菌中含基因因。（1）鸟枪法：供体细胞中的的DNA许多DNA片段运载体限制酶与载体连接受体细胞产生特定性状状导入外源DNA扩增目的基因分离(直接分离法)多用于原核生生物①概念：PCR全称为_______________，是一项在生物____复制___________的核酸合成技技术。多聚合酶链式式反应体外特定DNA片段②原理：__________DNA复制③前提条件：：_______________________；有一段已知基基因的核苷酸酸序列（二）利用PCR技术扩增目的的基因变性、退火、、延伸三步曲曲变性：加热至90～95℃双链DNA解链成为单链链DNA退火：冷却至55～60℃部分引物与模模板的单链DNA的特定互补部部位相配对和和结合延伸：加热至70～75℃以目的基因为为模板，合成成互补的新DNA链变性退火延伸（二）利用PCR技术扩增目的的基因③过程：a、DNA变性（90℃-95℃）：双链DNA模板在_____作用下，_____断裂，形成___________b、退火（复性55℃-60℃）：系统温度度降低，引物物与DNA模板结合，形形成局部________。c、延伸（70℃-75℃）：在Taq酶的作用下，，从引物的5′端→3′端延伸，合成成与模板互补补的________。氢键单链DNA双链DNA链高温④原料：___________、___________、__________________、________________。⑤方式：：以_____方式扩增增，即____（n为扩增循循环的次数数）⑥结果：：四种脱氧氧核苷酸酸DNA引物热稳定DNA聚合酶指数2n使目的基基因的片片段在短时间内内大量扩扩增模板DNAPCR的基本反反应步骤骤变性90-95˚C延伸70-75˚C退火55-60˚CPCR总结：PCR技术扩增增与DNA复制的比比较PCR技术DNA复制相同点原理原料条件不同点解旋方式场所酶结果碱基互补补配对四种脱氧氧核苷酸酸模板、能能量、酶酶DNA在高温下变性解旋解旋酶催催化体外复制细胞核内内热稳定的的DNA聚合酶细胞内的的DNA聚合酶大量的DNA片段形成整个个DNA分子根据已知知蛋白质质的氨基基酸序列列，推测测出相应应的mRNA序列，然然后按照照碱基互互补配对对原则，，推测出出它的结结构基因因的核苷苷酸序列列，再通通过化学学方法，，以单核苷苷酸为原原料合成成目的基基因。蛋白质的的氨基酸酸序列mRNA的核苷酸酸序列结构基因因的核苷苷酸序列列推测推测目的基因因化学合成成（三）化化学方法法人工合合成目的的基因人工合成成(基因比较较小，核核苷酸序序列已知知)DNA合成仪从基因文文库中获获取利用PCR技术术扩增利用化学学方法人人工合成成归纳：获获取目的的基因的的方法用一定的的_________切割质粒，使使其出现现一个切切口，露出出____________。用_____________切割目的基因，，使其产产生_______________________。将切下的的目的基基因片段段插入质质粒的______处，再加入适适量___________，形成了了一个重重组DNA分子（重重组质粒粒）限制酶黏性末端端或平末末端同一种限限制酶相同的黏黏性末端端或平末末端切口DNA连接酶1.过程:二、构建建表达载体——核心质粒DNA分子限制酶处处理一个切口口两个黏性性末端两个切口口获得目的的基因DNA连接酶重组DNA分子（重重组质粒粒）同一种过程:2.构建基因表达达载体的的目的（1）使目的的基因在在受体细细胞中稳定存在在并可以遗传给下下一代；（2）使目的的基因能能够表达和发发挥作用。科学家在在培育抗抗虫棉时时，经历历了多次次失败，，才获得得成功。。起初把苏苏云金芽芽孢杆菌菌的抗虫基因因插入载体体质粒中中，然后后导入棉棉花的受受精卵中中，结果果抗虫基基因在棉棉花体内内没有表表达。然后在插插入抗虫虫基因的的质粒中中插入启动子(抗虫基因因首端)，导入棉棉花受精精卵，长长成的棉棉花植株株还是没没有抗虫虫能力。。科学家家又在有有启动子子、抗虫虫基因的的质粒中中插入终止子(抗虫基因因末端)，导入棉棉花受精精卵，结结果成长长的植株株，有了了抗虫能能力。资料:3.基因表达达载体的的组成：：它们有什什么作用用？a、目的基基因b、启动子子c、终止子子d、标记基基因思考1：：表达载体体为什么么一定要要有启动动子？（1）生生物之间间进行基基因交流流，只有使用受体生物物自身基因因的启动动子才能能有利于于基因的的表达；；（2）通通过cDNA文库获得的目的基因因没有启启动子，只将编编码序列列导入受受体细胞胞无法转录录。是为了鉴鉴别受体体细胞中中是否含含有目的的基因，，从而将有目的的基因的的细胞筛筛选出来。思考3：标记基因因有什么么作用？？①载体与表达载体体的区别：：二者都都有标记记基因和和复制原原点两部部分DNA片段。表表达载体体在载体体基础上上增加了了目的基基因、启启动子、、终止子子三部分分结构。。注意②用到的工工具酶：：既用到限制酶切割载体体，又用用到DNA连接酶将目的基基因和载载体拼接接，两种种酶作用用的化学学键都是是磷酸二二酯键。。③启动子、、终止子子对于目的的基因表表达必不不可少。。④目的基因因不能单单独进入入受体细细胞，必需以表表达载体体的方式式携带进进去。三、将目目的基因因导入受受体细胞胞常用的受受体细胞胞：有大肠杆杆菌、枯枯草杆菌菌、土壤壤农杆菌菌、酵母母菌和动动植物细细胞等。。（一）转转化：目的基因因进入_________内，并且且在受受体细细胞内维维持_____和_____的过程受体细胞胞稳定表达（二）方方法将目的基基因导入入植物细胞胞将目的基基因导入入动物细胞胞将目的基基因导入入微生物细细胞农杆菌转转化法（（最多）基因枪法法花粉管通通道法——显微注射射法——Ca2+处理法1.将目目的基因因导入植植物细胞胞农杆菌转转化法基因枪法法花粉管通通道法（1）农杆菌菌转化法法特点：①易感染染双子叶叶植物和和裸子植植物，对对大多数数单子叶叶植物没没有感染染能力②Ti质粒上的T-DNA可以转移到受受体细胞，并并整合到受体细胞染染色体的DNA上。③转化过程:Ti质粒目的基因构建表达载体导入植物细胞插入植物细胞染色色体DNA表达新性状转入农杆菌基因枪法又称称微弹轰击法，是利用压缩气体体产生的动力力，将包裹在金金属颗粒表面面的表达载体体DNA打入受体细胞胞中，使目的基因因与其整合并并表达的方法法。（2）基因枪法适用于单子叶植物（3）花粉通道法法植物花粉在柱柱头上萌发后后，花粉管要要穿过花柱直直通胚囊。花花粉管通道法法就是在植物物受粉后，花花粉形成的花花粉管还未愈愈合前，剪去去柱头，然后后，滴加DNA（含目的基因因），使目的的基因借助花花粉管通道进进入受体细胞胞。适用于被子植物2.将目的基基因导入动物物细胞（1）方法：：显微注射法法（将基因表达达载体提纯，，用显微仪注注射到受精卵中）思考：为什么么要用受精卵卵而不用体细细胞？（2）操作程序:提纯含目的基基因表达载体体取受精卵显微注射移植到子宫受精卵发育新性状动物常用法：常用菌：微生物作受体体细胞原因：：过程：Ca2+处理大肠杆菌菌感受态细胞表达载体与感感受态细胞混混合感受态细胞吸吸收DNA3.将目的基基因导入微生生物细胞思考：为什么么要用Ca2+处理受体细胞胞？用Ca2＋处理，增加细细菌细胞膜的的通透性Ca2+处理大肠杆菌繁殖快、多为为单细胞、遗遗传物质相对对少一定温度重组表达载体体DNA溶于缓冲液受体生物植物动物微生物受体细胞导入方法受精卵体细胞受精卵细胞/个体农杆菌转化法法基因枪法花粉管通道法法显微注射技术用Ca2+处理成感受态态细胞归纳：四、目的基因因的检测与鉴鉴定分子检测:是否插入目的的基因是否转录是否翻译鉴定:个体生物学水水平鉴定1、检测转基因因生物染色体体的DNA上是否插入了了目的基因①首先取出出转基因生物物的基因组DNA；（1）方法:DNA分子杂交（DNA-DNA)（2）过程:②将含目的基因因的DNA片段用放射性性同位素等作作标记,以此做探针；③使探针和基因组DNA杂交,若显示出杂交交带,表明目的基因因已插入染色色体DNA中。（一）检测2、检测目的基基因是否转录录出了mRNA3、检测目的基基因是否翻译译成蛋白质①方法:分子杂交交(mRNA-DNA)①方法:抗原-抗体杂交②过程:用上述探针和和转基因生物物的mRNA杂交,若出现杂交带带,表明目的基因因转录出了mRNA。②过程:从转基因生物物中提取蛋白白质，用相应的抗体进行抗原-抗体杂交，若若出现杂交带带,表明目的基因因已形成蛋白白质产品。若不能表达，，要对抗虫基基因再进行修饰。怎样检验抗虫虫基因在棉细细胞内是否表表达呢？没有抗虫基因因的棉植株有抗虫基因的的棉植株棉铃虫虫没有死虫被杀死没有表达目的基因表达达（二）鉴定（（个体生物学学水平）抗虫鉴定、抗抗病鉴定、活活性鉴定等类型步骤检测内容方法结果显示分子检测第一步是否成功显示出杂交带第二步是否成功显示出杂交带第三步是否成功显示出杂交带个体水平鉴定

包括抗虫、抗病的接种实验，以确定是否有抗性以及抗性的程度；基因工程产品与天然产品的活性比较，以确定功能是否相同等。目的基因的表表达和检测转基因生物的的DNA上是否插入目目的基因DNA分子杂交（DNA和DNA之间）目的基因是否否转录出mRNA分子杂交技术术（DNA和mRNA之间））目的基基因是是否翻翻译出出蛋白白质抗原—抗体杂杂交提示：：①DNA分子杂杂交技技术首首先提提取转转基因因生物物的DNA，然后后高温温或提提高pH解成单单链，，再与与同位位素标标记的的DNA探针杂杂交；②抗原－－抗体体杂交交所用用到的的抗体是是用表表达出出的蛋蛋白质质注射射动物物进行行免疫疫，产产生相相应的的抗体体，并并提取取出来来的。。归纳:基因工工程的的基本本操作作程序序获取目目的基基因从基因因文库库利用PCR化学方方法人人工合合成构建基基因表表达载载体目的基基因、、启动动子、、终止止子、、标记记基因因将目的的基因因导入入受体体细胞胞Ca2+处理（微生生物））、农杆菌菌转化化法（植物物）、、显微注注射法法（动物物）目的基基因的的检测测与鉴鉴定检测：：是否否插入入、转转录、、翻译译个体生生物学学水平平的鉴鉴定思考：：作为基基因工工程表表达载载体，，只需需含有有目的的基因因就可可以完完成任任务吗吗？为为什么么？不可以以。因为目目的基基因在在表达达载体体中得得到表表达并并发挥挥作用用，还需要要有其其他控控制元元件，如启启动子子、终终止子子和标标记基基因等等。必须构构建上上述元元件的的主要理理由是：（1）生生物之之间进进行基基因交交流，，只有有使用用受体生生物自自身基基因的启动动子才才能比比较有有利于于基因因的表表达；；（2）通通过cDNA文库获获得的的目的的基因因没有有启动动子，，只将将编码码序列列导入入受体体生物物中无无法转转录；；（3）目目的基基因是是否导导入受受体生生物中中需要要有筛筛选标标记；；（4）为为了增增强目目的基基因的的表达达水平平，往往往还还要增增加一一些其其他调调控元元件，，如增增强子子（增强基基因启启动子子工作作效率率的顺顺式作作用序序列，，能够够在相相对于于启动动子的的任何何方向向和任任何位位置(上游游或或下下游游)上都都发发挥挥作作用用。。）等；；（5）有有时时需需要要确确定定目目的的基基因因表表达达的的产产物物存存在在于于细细胞胞的的什什么么部部位位，，往往往往要要加加上上可可以以标标识识存存在在部部位位的的基基因因（（或或做做成成目目的的基基因因与与标标识识基基因因的的融融合合基基因因）），，如如绿绿色色荧荧光光蛋蛋白白基基因因等等。。1、、为为什什么么要要构构建建基基因因文文库库？？直直接接从从含含有有目目的的基基因因的的生生物物体体内内提提取取不不行行吗吗？？构建建基基因因文文库库是是获获取取目目的的基基因因的的方方法法之之一一，，并并不不是是唯唯一一的的方方式式。。如如果果所所需需要要的的目目的的基基因因序序列列已已知知，，就就可可以以通通过过PCR方式从含含有该基基因的生生物的DNA中，直接接获得，，也可以以通过反反转录，，用PCR方式从mRNA中获得，，不一定定要构建建基因文文库。但如果所所需要的的目的基基因的序序列完全全不知，，或只知知道目的的基因序序列的一一段，或或想从一一种生物物体内获获得许多多基因，，或者想想知道这这种生物物与另一一种生物物之间有有多少基基因不同同，或者者想知道道一种生生物在个个体发育育的不同同阶段表表达的基基因有什什么不同同，或者者想得到到一种生生物的全全基因组组序列，，往往就就需要构构建基因因文库。。2根据据农杆菌菌可将目目的基因因导入双双子叶植植物的机机理,你能分析析出农杆杆菌不能能将目的的基因不不能导入入单子叶叶植物的的原因吗吗?若将一个个抗病基基因导入入小麦中中,理论上讲讲你应该该怎样做做?①要选择择合适的的农杆菌菌菌株，，因为不不是所有有的农杆杆菌菌株株都可以