基因工程和蛋白质工程

第十六章基因工程与蛋白质工程第一节生物工程概述第二节基因工程第三节蛋白质工程第一节生物工程概述一、生物工程概念及研究技术二、在现代工、农、医领域中的应用一、生物工程的概念及研究技术1.基因工程——在分子水平的遗传操作技术2.细胞工程——遗传物质在细胞间的转移4.生化工程——生物工程产品的最终取得手段3.酶工程——酶的改造和设计基因工程是指在微观领域（分子水平）中，根据分子生物学和遗传学原理，设计并实施一项把一个生物体中有用的目的DNA(遗传信息)转入另一个生物体中，使后者获得新的需要的遗传性状或表达所需要的产物，最终实现该技术的商业价值。基因工程基因工程与建筑工程基因工程操作水平：DNA分子水平目的：定向改变遗传物质或获得基因产物。2、基因工程的理论基础1）物质基础——脱氧核苷酸2）结构基础——规则的双螺旋结构3）中心法则，共用一套遗传密码细胞工程1、细胞工程的概念

利用细胞融合技术把含有不同遗传物质的细胞合成杂种细胞。并使之分裂生长成为杂种生物。 它包括体细胞融合、核移植、细胞器摄取和染色体片段的重组等。细胞工程操作水平：细胞整体水平或细胞器水平目的：定向改变遗传物质或获得细胞产品。2、细胞工程的理论基础——细胞全能性依据——生物体的每一个干细胞都包含有该物种所特有的全套遗传物质。异种植物细胞杂种细胞转基因植物异种动物细胞动物细胞群重组细胞体细胞细胞核早期胚胎受精卵去核卵细胞克隆动物试管婴儿动物细胞融合植物体细胞杂交植物组织培养动物细胞培养核移植胚胎移植体外受精3、主要技术植物组织培养植物体细胞杂交动物细胞培养动物细胞融合单克隆抗体技术胚胎移植核移植植物细胞工程技术动物细胞工程技术酶工程 酶工程是利用酶的特异催化功能，在常温长压下将一种物质转化为另一种物质，以获得高纯度的适用之物。 该技术包括各种酶的开发和生产。酶的分离和纯化技术等。酶工程用于食品工业很有效。啤酒、酱油、葡萄糖等都可用酶工程生产。二、生物工工程在现代代工、农、、医领域中中的应用1.化工及冶金金工业2.轻工和食品品工业4.农业和畜牧牧业3.医药工业5.环保和能源源工业稀少珍贵的的蛋白质药药物1982年，美国食食品与药物物管理局批批准了首例例基因工程程产品—人胰岛素投投放市场——它标志了基基因工程产产品正式进进入到商业业化阶段。。人生长激素素、表皮生生长因子、、肿瘤坏死死因子、a-干扰素、纤纤维素酶、、抗血友病病因子、红红细胞生成成素、尿激激酶原、白白细胞介素素-2、集落刺激激因子、乙乙肝疫苗等等等畜牧业中的的应用动物疫苗、、生长激素素等例：从转基因羊羊的羊奶中中提取出治治疗心脏病病的药物tPA（组织溶解酶酶原激活剂剂）。种植业中的的应用用携带外源源基因的农农杆菌Ti质粒转化植植物原生质质体，使外外源DNA与植物染色色体DNA整合，通过过原生质体体的培养分分化成愈伤伤组织，最最后发育成成具有新性性状的完整整植株—转基因植物物基因工程包包括DNA重组技术和和其他使基基因结构得得以定向改改造的技术术。本节主主要介绍DNA重组技术，，大体上包包括下列5个步骤。基因工程是1973年由美国斯斯坦福大学学科恩和旧旧金山大学学医学院的的博耶创立立的概念第二节基基因工程程DNA重组的技术路路线ForeignDNAtobeinsertedPlansmidvectorJoiningRecombinantDNAmolecule

Introductionintohostcellsbytransformation

HostchromatemeSlectionforcellscoteiningarecombinantDNAmoleculeCloning+1、目的基因因的制备2、载体的构建3、目的基因因与载体的的重组4、重组体体导入宿主细胞进进行扩增5、克隆基因的的鉴定一、目的基基因的获得得二、基因载载体三、重组DNA的筛选及表表达一、目的基基因的获得得1.限制酶——特异性切割割DNA的手术刀2.取得目的基基因的方法法——分离法及合合成法1.限制性内切切酶DNA重组即是将两种种DNA分子经过切切割，选择择适合的片片段连接起起来的过程程实现这一步步，是在限限制性内切切酶发现以以后才实现现的限制性内切切酶：一类类核酸内切切酶，可以以将外源DNA在特定位点点切割降解解。以以后从细菌菌中分别分分离出了I型和Ⅱ型两两类限制性性内切酶。。限制性内切切酶的命名名用细菌同名名的第一个个字母（大大写）和种种名的前两两个字母（（小写）构构成酶的基基本名称。。若酶是从从其中一种种特殊菌株株来，还在在基本名称称后加上菌菌株名称符符号。名称称后的罗马马数字，表表示在该特特殊菌株中中发现此酶酶的先后次次序。如HaeII是从（Haemophilusaegypticus）中提取的，，并且是从从中发现的的第二个酶酶。限制性内切切酶切割DNA的方式a.从识别序列列的中间切切开b.在识别序列列对称轴的的左右两方方进行切割割c.在识识别别序序列列对对称称轴轴的的右右边边（（5’-3’链））和和对对称称轴轴左左边边（（3’-5’链））切切开开a.从识识别别序序列列的的中中间间切切开开从识识别别序序列列的的中中间间切切开开产产生生平平齐齐末末端端（（bluntends）），，如HaeⅢⅢb.在识识别别序序列列对对称称轴轴的的左左右右两两方方进进行行切切割割即分分别别在在5’-3’链和和3’-5’链对对称称轴轴的的左左右右方方切切开开，，形形成成带带有有凸凸出出的的5’磷酸酸基基团团的的粘粘性性末末端端（（Cohesiveends）），，如EcoRⅠⅠc.在识识别别序序列列对对称称轴轴的的右右边边（（5’-3’链））和和对对称称轴轴左左边边（（3’-5’链））切切开开形成成带带有有凸凸出出的的3’羟基基的的粘粘性性末末端端，，如如pstI2.取得得目目的的基基因因的的方方法法———分离离法法及及合合成成法法（1）DNA片段段的的直直接接提提取取（2）用用噬噬菌菌体体或或质质粒粒直直接接从从宿宿主主细细胞胞中中将将目目的基基因因携携出出（3）使使用用相相应应的的mRNA分离离基基因因二、、基基因因载载体体1.质粒粒———染色色体体以以外外的的遗遗传传单单元元2.噬菌菌体体———感染染细细菌菌的的病病毒毒质粒粒是是一一种种环环状状双双链链的的DNA分子子。。自自身身在在细细菌菌细细胞胞中中能能不不断断复复制制繁繁殖殖。研究究比比较较深深入入的的质质粒粒有有大大肠肠杆杆菌菌的的性性因因子子（（F因子子））、、大大肠肠杆杆菌菌素素因因子子和和抗抗药药因因子子等等抗药药因因子子（（质质粒粒））在在其其DNA上编编码码有有某某些些酶酶的的基基因因，，表表达达产产生生的的酶酶对对链链霉霉素素、、氯氯霉霉素素、、磺磺胺胺、、青青霉霉素素、、四四环环素素、、卡卡那那霉霉素素等等药药物物能能产产生生生生物物化化学学修修饰饰，，使使之之钝钝化化而而失失效效1.质粒粒———染色色体体以以外外的的遗遗传传单单元元质粒粒的的作作用用质粒粒DNA能从从细细菌菌中中提提出出来来，，又又能能再再转转入入细细菌菌。。这这个个过过程程称称转转化化。。转转入入的的质质粒粒DNA仍能进行复制制，这种性能能为DNA重组技术提供供了重要的条条件，即将一一种外源基因因与质粒重组组后，再转入入细菌中去复复制繁殖，使使外源基因得得以增殖。质粒自身的某某些抗药基因因成为从转化化的细菌中筛筛选它们的一一种标记。除除质粒外，噬噬菌体、病毒毒也能通过“感染”将外源基因带带入细菌并进进行复制。目前所使用的的质粒目前实验中所所使用的质粒粒、噬菌体和和病毒载体种种类很多。但但都是经过了了人工改造，，更适宜运用用于DNA重组技术。它它们既保留了了转化和感染染活细胞的能能力，又具有有多处携带外外源DNA的酶切位点，，并含有特殊殊的筛选标记记这些载体中有有些只能复制制扩增带入的的外源基因；；有些可以使使外源基因复复制、转录和和翻译出基因因的蛋白质产产物，这种载载体称为表达达载体pBR322质粒的结构以噬菌体或病病毒为载体，，将所需基因因或含有此基基因的DNA片段转移给受受体细胞的过过程，称为转转导。我们常常采用用噬菌体作为基基因工程的载载体，其一它它的遗传结构构与功能知道道得比较清楚楚；其二是易易于使细胞感感染，易于使使外源DNA导入宿主细胞胞。2.噬菌体——感染细菌的病病毒以噬菌体为载体体进行DNA克隆DNA用限制性内切切酶除去中间间一段与外源DNA连接重组载体的体体外包装带有外源DNA的噬菌体太小不能被包包装头部前体多联体DNAA蛋白COSCOSCOS成熟的颗粒在宿主细胞内进行DNA的装配过程三、重组DNA的筛选及表达达1.转化——带有目的基因因的载体进入入受体细胞2.筛选——从大量受体细细胞选出带有有重组体的细细胞3.表达——外源DNA在受体细胞的的转录和翻译译1.转化——带有目的基因因的载体进入入受体细胞由质粒作载体体形成的克隆隆，转入细菌菌时细菌预先先要在低温条条件下用氯化化钙处理，形形成“感受态”细胞。即增加加细胞膜的通通透性才能实实现转化。由噬菌体作载载体的克隆，，转入细胞的的过程称为“侵染”。因噬菌体具具有自动侵入入的功能。细细菌不用预先先处理。噬菌体感染大大肠杆菌的途途径2.筛选——从大量受体细细胞选出带有有重组体的细胞（1）插入失活法法（2）放射性探针针检测法（3）R-环检测法（4）免疫测定法法（1）插入失活法法在现在的基因因工程操作中中，所使用的的载体通常是是经过加工改改造的衍生物物，它们要么么带有一个或或几个可供选选择的遗传标标记，要么具具有被选择的的遗传功能，，这就使带有有目的基因与与不带目的基基因的细菌有有明显区别，，便于筛选。。pBR322质粒结构如果外源DNA插入，氨卞青青霉素抗性基基因失活如果外源DNA插入，四环素素抗性基因失失活（2）放射性探针针检测法利用mRNA可与相应的DNA段落杂交，来来检测有外源源DNA插入的重组体体，是一种快快速而灵敏的的方法。（3）R-环检测法在有利于形成成R-环的条件下，，使待检测的的纯化的质粒粒DNA，在含有mRNA的缓冲液中局局部变性。如如若质粒DNA存在着与mRNA探针互补的序序列，mRNA就会取代DNA中一条链，与与另一条链形形成双链杂交交分子，从而而形成R-环结构，在电电子显微镜下下观察，可直直接观察到R-环。这样可检检出重组体质质粒DNA。（4）免疫测定法法免疫法测定只只能是所转移移外源DNA必须表达后才才能进行，而而且必须具备备有效的特异异性抗体。Southern和Western印迹法DNAfrangmentElectrophoresisTransferofDNAbyblotting32P-labledDNAprobeAutoradiographyAgarrosegelAutoradiogramNitrocellulosesheetAutoradiogramPolymersheetSDS-PolyacrylamidegelTransferproteinAddradiolabledspesficantibody,WashtoremoveunboudantibodyProteinbanddetectedbyspecificantibodyAutoradiography3.表达——外源DNA在受体细胞中中的转录和翻翻译带有目的基因因的载体转移移到受体细胞胞成功并筛选选出来后，最最终目的是要要目的基因在在受体细胞中中得以表达，，产生具有功功能性的蛋白白质或肽。第三节蛋蛋白质工程一、蛋白质工程的的概念二、蛋白质工程的的一般技术三、蛋白质工程的的应用一、蛋白质工工程的概念蛋白质工程(proteinengineering)：：通过改造与蛋蛋白质相应的的基因中的碱碱基顺序，或或设计合成新新的基因，将将它克隆至受受体细胞中，，通过基因表表达而获得具具有新的特性性的蛋白质技技术1、基因定点点突变——定定做新蛋白质质2、蛋白质设设计——对天天然蛋白质的的修饰蛋白质工程举举例：定点突变技术术：已知丝丝氨酸酸是由由TCT编码，，只要要把C改为G，就变成成半胱胱氨酸酸的密密码TGT。于是用用人工工合成成一段段寡聚聚核苷苷酸引引物，，引物物里含含有TGT外，其其余均均与基基因部部分互互补。。打开开含有有被突突变蛋蛋白质质基因因的质质粒的的双条条链成成单链链模板板，用用引物物与之之互补补链退退火（（假如如退火火在适适宜温温度下下进行行，约约15个碱碱基中中，有有一个个碱基基错配配是可可以容容忍的的）。。然后后由DNA聚合酶酶延伸伸引物物，由由DNA连接