章基因工程二

第二十章基因工程第一节自然界的基因重组一、转化作用二、转导作用三、转位（转座）一、Transformation转化作用InsertionCrossingover二、Transduction转导作用转导Transduction:

由病毒介导的DNA由一个细胞向另一个细胞转移的现象。随后DNA会整合到受体细胞的基因组中。三、基因重排将一个基因从远离启动子的地方移到距它很近的位点从而启动转录，这种方式被称为基因重排。通过基因重排调节基因活性的典型例子是免疫球蛋白结构基因和T－细胞受体基因的表达。在所有物种中，胚系Ig基因的构成基本上相同。Ig重链和轻链(λ和κ链)基因座都由多个编码V区(可变区）和C区（恒定区）蛋白质的基因组成，并被非编码的DNA（连接区，J区）所分隔。V、C、J区在胚胎期细胞中相距较远，细胞发育分化时，免疫球蛋白重链基因DNA重排，大量间隔序列被切除，使位于J-Cμ之间的增强子序列得以发挥作用，增强基因转录。四、（转位））转座能将自身插入入基因组新位位置的DNA序列。1转座子子的定义（1）含短的的末端反向重重复序列;（2）含编码码转座酶的基基因;（3）靶位点点存在5-9bp的的短正向重重复序列。第二节基基因克隆的工工具酶识别DNA的的特异序列，，并在识别位位点或其周围围切割双链DNA的一类类内切酶，与与相伴的甲基基化酶共同构构成细菌防御御机制——限限制修饰体系系（限制外源源DNA，保保护自身DNA）HindⅢ流感噬血杆菌菌种属d株第第三种种内切酶限制性核酸内内切酶命名：：属名、种种名、株名限制性核酸内内切酶（restrictionendonuclease）切割DNA后后有粘端与平端之分或产生平末端识别位点常为为4-6个碱碱基对、具有有回文结构的的DNA片段段AATGAATTCGTACCGTTACTTAAGCATGGC限制性核酸内内切酶5’---NGAATTCN---3’3’---NCTTAAGN---5’5’---NGAATTCN---3’3’---NCTTAAGN---5’粘末端(Cohensiveendorstickyend）5’突出端EcoR15’---NCAG

CTGN---3’3’---NGTC

GACN---5’5’---NCAGCTGN---3’3’---NGTCGACN---5’平末端Pvu2（bluntend）错位切割垂直切割限制性核酸内内切酶的切割割频率DNA分子中中核苷酸序列列是随机排列列的，一个识识别四个核苷苷酸序列的内内切酶平均每每隔256bp（44）出现一次该该酶的识别切切割位点。那么，识别6或8核苷酸酸序列的内切切酶的切割频频率是多少？基因工程其他他常用的工具具酶酶的种类功能能DNA连接酶酶催化DNA中中相邻的5'磷酸基和3'羟基末端端之间形成磷磷酸二酯键，，使DNA切切口封合或使使两个DNA分子或片段段连接DNA聚合酶酶I①合成双链cDNA的第第二条键②缺口平移制制作高比活探探针③DNA序列列分析④填补3'末末端反转录酶以RNA为模模板合成cDNA第一链链多聚核苷酸激激酶催化多聚核苷苷酸5'羟基基末端磷酸化化，或标记探探针末端转移酶在3'羟基末末端进行同质质多聚物加尾尾切除末端磷酸酸基团碱性磷酸酶TaqDNA聚合酶PCR扩增第三节基因因克隆的载体体载体（vector）是是由在细胞中中能够自主复复制的ＤＮＡＡ分子构成的的一种遗传成成分，通过实实验手段可使使其它ＤＮＡＡ片段(外源源基因)连接接在它的上面面，进行扩增增或表达。理想载体应具具备的几个条条件能在宿主细胞胞内携带目的的基因复制扩扩增，具有有较高拷贝数数。有多个限制性性内切酶单一一位点，便便于外源基因因的插入。有易检测的遗遗传筛选标记记，如抗生素素抗性基因，，用于阳性克克隆的筛选。。分子量量小，，允许许插入入外源源基因因的容容量较较大。。载体分分类（（按功功能分分）克隆载载体：：用于于外源源DNA的的克隆隆和扩扩增。。表达载载体：：用于于外源源基因因的表表达（（转录录翻译译生成成蛋白白质））一、克克隆载载体质粒载载体噬菌体体载体体病毒载载体（一））质质粒粒（plasmid）载载体质粒是是一种种独立立于染染色体体外的的小分分子环环状DNA，一一般大大小约约106~108D，可可自身身复制制和表表达，，有的的质粒粒还带带有可可做为为选择择性标标记的的抗药药性基基因，，所以以质粒粒经过过适当当改选选后便便可成成为良良好的的载体体。作作为为载体体的质质粒大大多是是由天天然质质粒经经人工工适当当改造造而成成的，，目前前已有有多种种经改改造的的良好好的质质粒载载体。。质粒（（plasmid））是存在在于细细菌染染色体体外的的小型型环状状双链链DNA分子。。大小小约为为数千碱碱基对对。常常有1~3个个抗药药性基因因，以以利于于筛选。。质粒载载体克隆的的质粒粒载体体允许外外源的的DNA插插入，，储存存。主主要是是DNA水水平上上的操操作。。基因表表达的的质粒粒载体体允许外外源DNA的插插入、、储存存和表表达。。质粒的的生物物学特特性：：1、质粒DNA的构构型：：SC型型共共价价闭合合环形形DNA（（cccDNA）OC型型开开环DNA（ocDNA）L型型线线性DNA（cDNA））2、不不同质质粒的的分子子量大大小差差异相相当显显著：：106~108D3、作作为载载体的的质粒粒都含含有三三种共共同的的组分分：复制基基因（（replicator）、、选择择性记记号、、克隆隆位点点LOCSC质粒DNA的复复制类类型：：低拷贝贝的质质粒（（1～～十几几个））：严严紧型型复制制控制制的质质粒高拷贝贝的质质粒（（几十十~几几百个个）：：松弛弛型复复制控控制的的质粒粒重要的的大肠肠杆菌菌质粒粒载体体1、pBR322质质粒载载体；；2、pUC质粒粒载体体；以Ampr和Tetr为选择择性标标记，，克隆隆位点点在这这两个个选择择性标标记的的单酶酶切位位点上上。（4363bp）oripBR322的的结构构来源源pBR322质质粒载载体的的特点点：1、、具具有有较较小小的的分分子子量量；；它的的分分子子量量为为4363bp。。克克隆隆载载体体的的分分子子量量大大小小不不要要超超过过10kb。。2、、具有有两两种种抗抗菌菌素素抗抗性性基基因因可可供供作作转转化化子子的的选选择择记记号号。。pBR322DNA分分子子中中总总共共有有24种种核核酸酸内内切切酶酶只只具具有有单单一一的的酶酶切切识识别别位位点点。。其其中中7种种内内切切酶酶的的识识别别位位点点在在四四环环素素抗抗性性基基因因内内部部，，2种种识识别别位位点点在在于于这这个个基基因因的的启启动动区区内内，，所所以以9个个限限制制酶酶切切位位点点插插入入外外源源片片断断可可以以导导致致tetr基因因的的失失活活；；另另外外有有3种种限限制制酶酶在在氨氨苄苄青青霉霉素素抗抗性性基基因因有有单单一一的的识识别别位位点点，，Example:a.在在pBR322质质粒粒的的BamH或SalⅠ位点点插插入入外外源源DNA片片断断，，切切断断了了tetr基因因编编码码序序列列的的连连续续性性，，使使之之失失去去活活性性，，产产生生出出AmprTets表型的重组pBR322质粒，转化入入AmpsTets的大肠杆菌细细胞。先涂布布在含氨苄青青霉素的选择择培养基上，，筛选出具Ampr菌落，再将它它们涂布于含含四环素的选选择性培养基基上。插入外外源片断的重重组质粒不能能在这种培养养基上生长。。b.在PstⅠ或ScaⅠ识别位点插入入外源片断会会导致Ampr基因的失活，，产生AmpsTetr表型的质粒。。转化大肠杆杆菌之后，获获得的重组子子可以比较快快的检测出来来。其依据是是Ampr表型的细胞可可以合成β––内酰胺酶酶，它能使青青霉素转变成成青霉酮酸，，而这种青霉霉酮酸能与碘碘结合。在含含有可溶性淀淀粉和四环素素的富裕培养养基上选择转转化子，经37度培养过过夜后，在此此平板上加入入少量的碘指指示剂溶液产产生青霉素ββ–内酰胺胺酶Ampr的菌落，其周周围的碘指示示剂溶液变得得明亮，而Amps菌落无此反应应。3、具有较高高的拷贝数，，而且经过氯霉素扩增之后每个细胞胞中可积累1000~3000个拷拷贝。pUC质粒载载体人们应用多克克隆位点技术术，在pBR322的基基础上，组入入了一个在其其5’-端带带有一段多克克隆位点的lacZ’基基因，而发展展的具有双功功能检测特性性的新型质粒粒载体系列。。一种典型的pUC系列的的质粒载体，，包括以下四四个部分：1、来自pBR322质质粒的复制起起点（ori）；2、氨苄青霉霉素抗性基因因（ampr）,但它的DNA核苷酸酸序列已经发发生了变化，，不在含有原原来的核酸内内切限制酶的的但识别位点点。

3、、大肠杆菌β-半乳糖基基因（lacZ）的启动动子及编码αα-肽链的DNA序列，，此结构称之之为lacZ’基因；4、位于于lacZ’’基因中的靠靠近5’-端端的一段多克克隆位点（MCS）区段段。但它并不不破坏该基因因的功能。AmproripUC18(3kb)MCS(Multiplecloningsites,多克隆位点））LacpromoterlacZ’MCS(Multiplecloningsites,多克隆隆位点）：指人工合成的的含有多种限限制性内切酶酶单一识别切切割位点的DNA序列。。乳糖操纵子结结构与调控模模式图pUC质粒载载体的优点第一，具有有较小的分子子量和更高的的拷贝数;仅仅保留了pBR322的氨苄青霉霉素抗性基因因和复制起点点；在操作过过程中复制起起点内部发生生了自发突变变造成了基因因rop的缺缺失，它是控控制质粒的特特殊因子，从从而使拷贝数数增加，平均均每个细胞500~700个拷贝。。第二，适用于于组织化学检检测重组体；；具有来自大肠肠杆菌lac操纵子的lacZ’基基因，所编码码的α-肽链链可参与α-互补作用用，用X-gal显色对对重组子进行行鉴定，而pBR322质粒的重组组子要进行两两步的选择。。第三，具有多多克隆位点MCS区段．．方便具有不同同粘性末端的的外源片断的的插入。穿梭质粒载体体（shuttleplasmidvector）是指一类由人人工构建的具具有两种不同同复制起点和和选择记号，，因而可在两两种不同的寄寄主细胞存活活和复制的质质粒载体。早期发现的大大肠杆菌-枯枯草杆菌穿梭梭质粒载体大肠杆菌-酿酿酒酵母穿梭梭质粒载体大肠杆菌-牛牛乳头瘤病毒毒迄今还没有发发展出适用的的大肠杆菌-植物细胞穿穿梭载体。（二）噬噬菌体体载体（Bacteriophage，简称phage）噬菌体的生命命周期噬菌体的溶菌生命周期只具有溶菌生生长周期的噬噬菌体颗粒叫叫烈性噬菌体体。烈性噬菌体溶溶菌生长的基基本过程：1、吸附吸吸附到位于于感染细胞表表面的特殊接接受器上。2、注入噬噬菌体DNA穿过细胞胞壁注入寄主主细胞。3、转变被被感染的细细胞成为制造造噬菌体颗粒粒的场所。4、合成大大量合成噬噬菌体特有的的核酸和蛋白白质。5、组装包包装了DNA头部和尾尾部组装成噬噬菌体的颗粒粒。6、释放合合成的子代代噬菌体颗粒粒从寄主细胞胞内释放出来来。噬菌体的生命命周期噬菌体的溶源生命周期是指在感染过过程中没有产产生出子代噬噬菌体颗粒，，噬菌体的DNA是整合合到寄主细胞胞染色体DNA上，成为为它的一个组组成部分。现知道只有双双链DNA的的噬菌体才具具有溶源周期期温和噬菌体：：既能进入溶溶菌生命周期期又能进入溶溶源生命周期。。溶源性细菌：：具有一种完完整的噬菌体体基因组的细细菌溶源化：用用温和噬菌体体感染细菌培培养物使之形形成溶源性细菌的过过程整合：噬菌菌体的DNA是被包容在在寄主细胞染染色体DNA中原噬菌体：在在溶源细菌内内存在的整合合的或非整合合的噬菌体超感染免疫性性：溶源性细细菌不能够被被头一次感染染并使之溶源化的的同种噬菌体体再感染。λ噬菌体载体体λ噬菌体基因组长48.5kb基因组可为线线状和环状两两种形式(cosends)溶菌阶段溶源阶段5‘-CGGGGCGGCGACCTCG-3’3’-GCCCCGCCGCTGGAGC-5’剪切连连接(包装过程)(侵侵染细菌细胞胞后)GGGCGGGCGACCTCG-3’5’-CG+GC-5’3’-GCCCCGCCGCTGGAThephagecosends环状线状AWBCDEFZUVGHMLKIJb2cIcrocIIOPQSRattintxisgamredcIIINCOSCOS头部基因尾尾部基基因功功能能不明区溶源化重重组早早期控制制阻阻遏DNA合成溶溶菌生长非必须区区段cI基因：溶源过过程控制基因因。λ噬菌体的基基因组结构体外包装λ噬菌体DNA体外重组组后，一般必必须经过体外外包装，然后后以噬菌体感感染的方式将将重组DNA导入E.coli细胞内。这是是因为以感染方式导入细胞胞的频率可达达106~108/μgDNA，λ噬菌体的包装限制为野生噬菌体体DNA（约约48.5kb）的75%~105%。

由于λ噬菌体包装时，当DNA的长度短于野生型的78%或超过105%时，噬菌体的活性就急剧下降。因此只包装它的野生型DNA（48.5KB）的75%~105%左右的ＤＮＡ，要求λ载体DNA和外源DNA长度之和在39～53kb之间。DNAProteincoatcoscosNonessentialregionLong(left)armshort(right)armExogenousDNA(~20-23kb)λphage12bpλ噬菌体载体体的主要类型型1.插入式载体一种只具有一一个可供外源源DNA插入入的克隆位点点的派派生载体。2.替换型型载体（取代代型载体）具有成对的克克隆位点，在在这两个位位点之间的λDNA区段段可以被外源源插入的DNA片段所取取代。插入式载体：：cI基因插入入失活：如λgt10等载体体，在cI基基因上有EcoRI及HindIII的的酶切位点。。外源基因插插入后将导致致cI基因的的失活。cI基因失活后后将导致噬菌菌体不能溶原原化，产生清清晰的噬菌斑斑。相反，产产生混浊的噬噬菌斑。LacZ基基因插入失活活：如charon16A载体，在非非必须区段引引入lacZ基因，在在lacZ基因上有EcoRI位点，，插入失活后后利用X-gal法筛选选（兰白筛选选）。cIEcoRILA32.7RA10.6λgt10lacZLA19.9RA21.9EcoRICharon16Aλ替换型载载体（取代型型载体）外源DNA取取代噬菌体染染色体中对于于噬菌体的感感染和复制非非必需的片段段(约20kb)这些载体是用用Lac5（乳糖操纵纵子的大部分分系列，包括括完整的LacZ）替替换入噬菌体体的中间区段段，同时将Lac5作作为选择标记记，使用时用用EcoRⅠ水解，去去掉中间的片片段，再与欲欲克隆片段在在体外进行重重组、包装。。而后，感染染E.coli使之在E.coli内繁殖，并裂裂解E.coli，形成空斑。。如EMBL系列Lac5EcoRIEcoRIEcoRIBanHISalISalIBamHIEcoRIMCSMCSCharon4AEMBL3/4Charon40替换型载体克克隆外源DNA的步骤1.应用用适当的核酸酸内切酶消化化λ载体，除去可取代的的DNA片段段；2.将上上述所得的λDNA载体体臂同外源DNA片段的的连接；3.对重重组体的λDNA分子进进行包装和增增殖，以得到有有感染性的λλ重组噬菌体体（左右臂连接接）（（三段自自身连接）（（插插入片段）根据噬菌斑的的透明度或颜颜色来进行重重组子的筛选选（黏性质粒））柯斯质粒载载体柯斯质粒载体体cosmid载体：也称粘粒、、柯斯载体。。这是一类用于于克隆大片段段DNA的载载体，它是由由λ噬菌体的cos（cohesivesite）末端及质粒（plasmid）重组组而成的载体体。cosmid载体带有质质粒的复制起起点、克隆位位点、选择性性标记以及λλ噬菌体用于于包装的cos末端等，，因此该载体体在体外重组组后，可利用用噬菌体体外外包装的特性性进行体外包包装，利用噬噬菌体感染的的方式将重组组DNA导入入受体细胞。。但它不会产产生子代噬菌菌体，而是以以质粒DNA的形式存在在于细胞内。。设计构建的柯斯质粒一般长4～6kb。其上的cos位点的一个重要作用是识别噬菌体的外壳蛋白。凡具有cos位点的任何DNA分子只要在长度相当于噬菌体基因组，就可以同外壳蛋白结合而被包装成类似噬菌体λ的颗粒。因此，插入柯斯质粒的外源DNA可大于40kb。重组的柯斯质粒可象噬菌体λ一样感染大肠杆菌，并在细菌细胞中复制。柯斯质粒载体体的特点具有λ噬菌体体的特性；具有质粒载体体的特性；具有较高容量量的克隆能力力(40Kb)；柯斯质粒pHC79系由质粒pBR322和噬菌体λ的cos位点的一段DNA构成全长4.3kb单链DNA噬噬菌体载体(M13)M13噬菌体体载体M13是一种种含单链（+）DNA（（ssDNA）的丝状大大肠杆菌噬菌菌体，其基因因组大小为6.4kb。。这类载体主主要用来获得得大量的单链链ＤＮＡ片段段，这种单链链ＤＮＡ片段段在遗传学研研究中主要用用来测定ＤＮＮＡ序列（sanger双脱氧法））、基因的定定点突变研究究、异源双链链DNA的分分析等。RFDNAM13载载体体具有有多多克克隆隆位位点点(MCS)，，方方便便克克隆隆。。许许多多M13载载体体的的多多克克隆隆位位点点与与质质粒粒载载体体pUC序序列列的的多多克克隆隆位位点点是是相相同同的的，，在在克克隆隆位位点点选选择择上上更更为为方方便便。。可以以定定向向地地克克隆隆DNA片片段段，，克克隆隆在在M13RFDNA分分子子上上的的双双链链DNA片片段段，，到到了了子子代代噬噬菌菌体体便便成成了了单单链链的的形形式式。。所所以以如如果果要要同同时时分分离离ＤＤＮＮＡＡ分分子子中中的的双双链链，，则则需需要要两两种种独独立立的的克克隆隆。。Blue-whiteselectionM13载载体体系系列列的的优优点点1.在在这这类类载载体体的的基基因因组组中中有有一一条条饰饰变变的的ββ-半半乳乳糖糖苷苷酶酶基基因因片片段段，，其其中中插插入入了了一一段段具具有有密密集集的的多多克克隆隆位位点点的的序序列列；；2.M13载载体体系系列列是是应应用用基基因因工工程程技技术术成成对对构构建建的的，，可可有有效效地地克克隆隆双双链链DNA分分子子中中的的每每一一条条链链。。M13克克隆隆载载体体分分子子结结构构图图噬菌菌粒粒载载体体噬菌菌粒粒载载体体由质粒粒载体体和和单链链噬噬菌菌体体载体体结结合合而而成成的的新新型型的的载载体体系系列列。。它具具有有质质粒粒的的复复制制起起点点、、选选择择性性标标记记、、多多克克隆隆位位点点等等，，方方便便DNA的的操操作作，，可可在在细细胞胞内内稳稳定定存存在在；；又又具具有有单单链链噬噬菌菌体体的的复复制制起起点点，，在在辅助助噬噬菌菌体体的存存在在下下，，可可进进行行噬噬菌菌体体的的繁繁殖殖，，产产生生单单链链的的子子代代噬噬菌菌体体。。常用用的的噬噬菌菌粒粒载载体体pUC118和和pUC1191.具具有有较较小小分分子子量量的的共共价价、、闭闭合合、、环环形形的的基基因因组组DNA，，可可克克隆隆10kb的外外源源DNA片片段段，，并并易易于于进进行行分分离离与与操操作作；；2.编编码码一一个个ampr基因因作作为为选选择择记记号号，，因因此此只只有有携携带带pUC118或或pUC119噬噬菌菌粒粒载载体体的的大大肠肠杆杆菌菌转转化化子子细细胞胞，，才才能能够够在在含含有有氨氨苄苄青青霉霉素素的的培培养养基基中中生生长长，，便便于于转转化化子子的的选选择择；；3.拷拷贝贝数数含含量量高高，，每每个个寄寄主主可可高高达达500个个，，所所以以只只要要用用少少量量的的大大肠肠杆杆菌菌细细胞胞培培养养物物，，便便可可制制备备出出大大量量的的载载体体DNA；；4.存存在在着着一一个个多多克克隆隆位位点点区区，，因因此此许许多多种种不不同同类类型型的的外外源源DNA片片段段，，不不经经修修饰饰便便可可直直接接插插入入到到载载体体分分子子上上；；5.由由于于多多克克隆隆位位点点区区阻阻断断了了大大肠肠杆杆菌菌lacZ基基因因的的5’’-端端编编码码区区，，可可按按照照IPTG组组织织化化学学显显色色反反应应试试验验，，筛筛选选重重组组子子；；6.lacZ基基因因是是置置于于lac启启动动子子的的控控制制之之下下，，这这样样插插入入的的外外源源基基因因便便会会以以融融合合蛋蛋白白质质的的形形式式表表达达；；7.含含有有质质粒粒的的复复制制起起点点，，在在没没有有辅辅助助噬噬菌菌体体的的情情况况下下，，克克隆隆的的外外源源基基因因可可以以像像质质粒粒一一样样按按常常规规的的方方式式，，复复制制形形成成大大量量的的双双链链DNA分分子子8.带带有有一一个个M13噬噬菌菌体体的的复复制制起起点点，，在在有有辅辅助助噬噬菌菌体体感感染染的的寄寄主主细细胞胞中中，，可可以以合合成成出出单单DNA拷拷贝贝，，并并包包装装成成噬噬菌菌体体颗颗粒粒分分泌泌到到培培养养基基中中；；9.在在pUC118和和pUC119这这两两个个载载体体中中，，多多克克隆隆位位点点区区的的核核苷苷酸酸序序列列取取向向是是彼彼此此相相反反的的，，于于是是它它们们当当中中的的一一个个可可转转录录克克隆隆基基因因的的正正链链DNA，，另另一一个个则则可可转转录录出出负负链链DNA；；10.可以以直接对克隆隆的DNA片片断进行核苷苷酸的序列测测定，免去了了从质粒载体体到噬菌体的的这一烦琐的的亚克隆步骤骤。pBluescript噬菌粒载体体基本结构：1.在多克克隆位点的两两侧，有一对对T3和T7噬菌体的启启动子，可以以定向指导外外源基因的转转录活动；2.同时时具有一个单单链噬菌体M13或f1的复制起点点和一个来自自ColE1质粒的复制制起点，在不不同的情况下下，可以采取取不同的复制制形式，分别别合成单链或或双链的DNA；3.编码码有一个氨苄苄青霉素抗性性基因，供作作转化子记号号；4.含有lacZ基因，，可用Xgal-IPTG组织显色色反应法筛选选噬菌粒载体体。T7T3用于体外转录录（三）其他载载体酵母人工染色色体载体（yeastartificialchromosome,YAC）细菌人工染色色体（bacterialartificialchromosome,BAC）动物病毒DNA改造的载载体（如腺病病毒、腺病毒毒相关病毒、、逆转录病毒毒）人基因组十分分庞大，约含含3×109bp，建立和和筛选人的基基因组文库，，要求有容量量更大的载体体，酵母人工工染色体（yeastartificialchromosome,YAC）载体应运运而生。YAC含有酵母母染色体端粒粒（telesome））、着丝点(centromere)及复制起起点等功能序序列，可插入入长度达200-500kb的外源源DNA，导导入酵母细胞胞可以随细胞胞分裂周期复复制繁殖供作作克隆，成为为人基因组研研究计划的重重要载体。正常酵母人工工染色体含有有：*四膜虫端端粒（tel)*酵母自主主复制序列（（ARS)*酵母着丝丝点(CEN)*酵母的选选择标记(TRP1、、URA1)YAC载体质粒和噬菌体载体只能在细菌中繁殖，不能满足真核DNA重组需要。感染动物的病毒可改造用作动物细胞的载体。由于动物细胞的培养和操作较复杂、花费也较多，因而病毒载体构建时一般都把细菌质粒复制起始序列放置其中。使载体及其携带的外来序列能方便地在细菌中繁殖和克隆，然后再引入真核细胞。目前病毒载体常用者有改造来自猴肾病毒SV40（SimianVirus40）、逆转录病毒和昆虫杆状病毒等，使用这些病毒载体的目的多为将目的基因或序列放入动物细胞中表达或试验其功能、或作基因治疗等。

质粒*受体细胞结构插入片断举例E.coli环状〈8*pUC18/19,T-载体pGEM-3z等λ噬菌体E.coli线状9-24kbEMBL系列，Λgt系列丝状噬菌体及噬菌粒E.coli环状〈10kbM13mp系列粘粒载体E.coli环状35-45kbpJB8,c2RB,pcoslEMBL,pWE15/16,pCVBAC(BacterialArtificialChromosome)E.coli环状≈300kbPeloBAC系列PAC(P1-derivedArtificialchromosome)E.coli环状100-2000kbPCYPAC1YAC(YeastArtificialchromosome)酵母细胞线性染色体100-2000kbMAC(MammalianArtificialChromosome)哺乳类细胞线性染色体〉1000kb病毒载体动物细胞环状SV40载体，昆虫杆状病毒载体穿梭载体动物细胞和细菌环状pSVK3质粒，PBV,Ti质粒载体的种类和和特征质粒λ噬菌体柯斯质粒单链噬菌体克隆DNA大片段±*++-构建基因组文库-++-构建DNA文库+---常规的亚克隆化+---构建新型的DNA结构+---序列分析+--+单链探针+**--+外源基因在大肠杆菌中的表达+---四种常用载体的比较*外源DNA如超过10kb，则重组质粒的转化率和DNA得率都非常低**已有个别材料可用于此目的二表达载体大肠杆杆菌（（原核核）表表达载载体表达载载体：：按按特殊殊设计计构建建的，，能使使克隆隆在其其中特特定位位点的的外源源真核核基因因的编编码序序列，，在大大肠杆杆菌细细胞中中正常常转录录并转转译成成相应应蛋白白质的的克隆隆载体体。表达载载体除除了具具有克克隆载载体所所具备备的复复制起起始位位点，，抗性性基因因和多多克隆隆位点点外，，还需需具备备转录录和翻翻译所所必需需的元元件。。如：具有功功能（（强））启动动子；；具有核核糖体体结合合位点点；转录终终止序序列。。核糖体体结合合位点点启动子子转录终终止子子复制起点PL启动子子的表表达载载体是一种种最广广泛使使用大大肠杆杆菌表表达载载体的的启动动子之之一。。λ噬菌菌体的的阻遏遏物－－操作作系统统cI基基因存存在一一个温温度敏敏感突突变等等位基基因。。42度度时，，阻遏遏蛋白白失活活；28-30度时时，PL启动子子完全全被阻阻遏蛋蛋白抑抑制。。通过改改变温温度来来控制制PL启动子子的开开闭真核表表达载载体真核表表达载载体的的构建建有：：原核生生物的的序列列，来来自质质粒的的复制制起始始序列列、抗抗生素素抗性性标记记基因因。真核生生物表表达调调控的的元件件，包包括启启动子子，增增强子子、转转录终终止和和polyA加加尾信信号。。真核细细胞的的复制制起始始序列列，可可筛选选标记记基因因等。。真核表表达载载体主要包包括质质粒载载体和和病毒毒载体体，使使用的的调控控表达达元件件最初初多来来源于于病毒毒SV40病病毒载载体逆转录录病毒毒载体体腺病毒毒载体体腺相关关病毒毒载体体第四节节基基因克克隆的的一般般过程程基因克克隆的的基本本过程程1．载载体的的选择择和制制备2．制制备目目的基基因片片段3．目目的基基因和和载体体间的的重组组连接接4．重重组DNA导入入受体体细胞胞5．重重组组子的的筛选选和鉴鉴定6．重重组子子的扩扩增或或表达达一、目的的基因的的获取1.用用PCR技术获获取基因因2.用用RT-PCR（逆转转录-PCR））获得基基因3.从从基因组组文库或或cDNA文库库中获取取基因4．人工工合成基基因是根据DNA半半保留复复制和DNA聚聚合酶的的特性建建立起来来的体外外复制扩扩增DNA片段段的技术术1.用PCR技技术获取取基因（聚合酶链链式反应应,polymerasechainreaction）KaryB.Mulis1985年发发明,获获1993年诺诺贝尔化化学奖可将微量量的目的的DNA在体外外扩增100万万倍以上上PCR技技术2.用RT-PCR（（逆转录录-PCR）获获得基因因以mRNA为模模板，先先进行逆逆转录得得到cDNA（（complementaryDNA，，cDNA），，再进行行的PCR反应应模板为mRNA需逆转录录酶产物为cDNART-PCR与与PCR区别3.从基基因组文文库或cDNA文库中中获取基基因基因组文文库（genomicDNAlibrary）含有某种种生物体体全部基基因片段段的重组组DNA克隆群群体cDNA文库（（cDNAlibrary）含有某一一组织细细胞中的的全部mRNA信息基因文库库genelibrary文库构建建提取染色色体DNA↓DNA片片段↓插入适当当的克隆隆载体↓转入受体体菌扩增增↓基因组文文库基因组文文库的构构建机械法或或限制性性内切酶酶切割细胞总mRNA↓反转录酶酶cDNA↓插入合适适载体↓转入受体体菌↓cDNA文库cDNA文库的的构建基因文库库构建示示意图4．人工工合成基基因已知目的的基因的的碱基序序列可用用DNA合成仪仪合成基基因片段段，然后后用其他他反应将将基因片片段连接接起来优点可修饰基因

可在基因两端设计接头可选择各种宿主生物偏爱的密码子二、克隆隆载体的的选择与与制备1.根根据克隆隆片段的的大小。。2.根根据实验验目的（（表达或或扩增））等等三、目的的基因与与克隆载载体的连连接（一）粘粘性末端端连接1.利用用相同的的酶切位位点———单酶单单切点用同一种种酶分别别切割目目的基因因/载体体，然后后进行连连接。优点：二者产生生相同的的粘性末末端，彼彼此很易易按碱基基配对退退火，在在ligase作用下下生成DNA分分子重组组体。如：geneEcoRⅠvectorEcoRⅠⅠ问题与解解决办法法：（1）自自身环化化粘性末端端自发形形成双链链，连接接产物含含大量的的目的基基因和载载体自身身环化的的假重组组体－>若转化化则出现现假阳性性克隆。。解决办法法是用高浓度度的DNA（目目的基因因：载体体为3：：1）和和碱性磷磷酸酶（（AP：：BIP/CIP）处处理载体体，去除除5’－－P使之之不能自自身环化化，缺口口在宿主主内可得得到修复复。（2）不能定定向克隆/插插入由于是单一位位点，目的基基因可以以不不同方向插入入载体。对于于克隆扩增问问题不大，因因为克隆上去去的基因再重重组时又要切切下来；对于于表达载体目目的基因必须须按5‘－3’方向克隆隆在启动子下下游而不能反反之。2.利利用用相相同同的的酶酶切切位位点点————双双酶酶双双切切点点（（定定向向克克隆隆））优点点（（1））避避免免载载体体/目目的的基基因因的的自自身身环环化化，，提提高高连连接接效效率率；；（（2））可可控控制制外外源源基基因因插插入入方方向向。。构建建表表达达载载体体时时最最好好使使用用双双酶酶双双切切点点，，这这样样方方式式也也称称定定向向克克隆隆。。如：：目目的的基基因因和和载载体体都都有有EcoRⅠⅠ，，PstⅠⅠ酶酶切切位位点点，，产产生生各各自自互互补补粘粘端端，，分分别别配配对对连连接接。。3.通通过过同同聚聚物物加加尾尾连连接接同聚聚物物加加尾尾是是指指用用末末端端脱脱氧氧核核苷苷酸酸转转移移酶酶将将某某种种脱脱氧氧核核苷苷酸酸加加到到目目的的基基因因的的3’’末末端端的的羟羟基基上上（（polydC)，，又又将将与与之之互互补补的的脱脱氧氧核核苷苷酸酸（（polydG)加加到到载载体体3’’末末端端的的羟羟基基上上，，制制造造出出粘粘性性末末端端。。dC：：dG同同源源多多聚聚尾尾是是连连接接DNA片片段段克克隆隆cDNA的的有有效效方方法法。。4.加加人人工工接接头头连连接接人工工接接头头（（linker，，接接头头））是指指人人工工合合成成的的，，连连接接目目的的基基因因两两端端的的含含有有某某些些限限制制酶酶位位点点的的寡寡核核苷苷酸酸片片段段，，如如含含EcoRⅠⅠ的的linker与与目目的的基基因因的的连连接接图图（（p371））。。5.聚聚合合酶酶链链反反应应特特异异引引物物连连接接利用用PCR技技术术，，将将PCR引引物物的的5’’端端加加上上限限制制性性内内切切酶酶的的切切点点。。6.T载载体体（（A/T克克隆隆法法））在克隆PCR产产物cDNA时时可采用用这一方方法。（1）cDNA末端添添加AA利利用Taqpol延延伸活性性，以不不依赖模模板的方方式在已已完成延延伸的PCR产产物的3’端添添加AA（利用用DNApol活性性可成））。（2）末末端为TT的线线性化的的T载体体可用下下述2种种方法得得到：①MbcⅡ、XcmⅠⅠ或HphⅠ酶酶切产生生单个T突出末末端；②将T加加到酶切切产生的的平端的的载体上上；T载体已已商品化化。（二）平平头末端端的连接接平端的4个来源载体目的基因连接或克隆策略①少数限制酶如HaeⅡ对称切产生平端√√cDNA①目的基因载体平端平端连接②机械剪切DNA产生平端√√cDNA②加人工接头连接（cDNA/vector）③逆转录生成cDNA是平端√cDNA③用衔接接头取代人工接头连接（cDNA/vector）④5’端突出，用酶切平，或用酶填平3’端；3’端突出只能切平，不能填平产生平端√√cDNAcDNA④通过同聚尾连接(cDNA/vector)（一）序序言1.导导入目的的（1）克克隆扩增增rDNA导入宿宿主细胞胞，利用用宿主的的生理条条件，克克隆扩增增，克隆隆片段随随着载体体（如质质粒）一一起扩增增获得扩扩增DNA片段段（如细细菌分裂裂繁殖））。（2）克克隆表达达利用宿主主的生理理条件，，生产基基因工程程产品或或开展基基因治疗疗。受体细胞胞接接受rDNA分分子的细细胞称作作受体细细胞或宿宿主细胞胞。（1）原原核细胞胞既既可以复复制扩增增，也可可以基因因表达。。（2）真真核细胞胞一一般只用用作基因因表达系系统。四、重组组DNA（rDNA））导入受受体细胞胞2.受受体细胞胞的基本本条件(1)易易接纳rDNA分子；；(2)对载体体复制扩扩增无严严格限制制；(3)不降降解，不不修饰外外源DNA分子子。3.转转化和转转染（transformation/transfection）rDNA导入原原核细胞胞的过程程称转化化，导入入真核称称转染。。（二）rDNA导入大大肠杆菌菌1.氯氯化钙转转化法感受态细细胞2.电电穿孔法法转化效率率高于方方法13.体体外包装装感染法法适用于λ载体和和柯斯质质粒（二）rDNA导入哺哺乳动物物细胞1.DNA-磷酸钙钙共沉淀淀2.病病毒感染染法3.显显微注射射法4.脂脂质体介介导法五、转化化菌的筛筛选（一）λλ噬菌感感染E.coli可以以溶菌生生长，形形成很亮亮的噬菌菌斑，溶源生长长多少也也有溶菌菌，形成成噬菌斑斑挑选噬噬菌斑即即可分析析鉴定转转化子。。（二）质质粒转化化E.coli可可用含含抗生素素的平板板筛选，，挑选阳阳性克隆隆分析鉴鉴定转化化子（图图8-3）。六、DNA重组组体的筛筛选转化子不不一定就就是重组组子。转化菌中中有一部部分是重重组子，，质粒载载体就是是粘端基基因的重重组体，，含有载载体抗生生素抗性性基因，，可在含含抗生素素平板上上存活。。而酶切不不完全或或酶切后后载体未未与目的的基因重重组而自自身环化化导入host中去的的另一部部分就可可能不是是的，但但因含抗抗生素抗抗性基因因也可在在抗生素素平板上上生长，，所需要要rDNA筛选选。确定定外源DNA片片段是否否插入并并与载体体连接。。五重组组体的筛筛选与鉴鉴定（一）遗遗传学方方法1.抗抗生素抗抗性筛选选（插入入失活））此法适用用于带有有抗生素素抗性标标记基因因的克隆隆载体，，将外源DNA插插入到其其一抗抗生素基基因序列列内，该该基因就就失活，，据此特特性，设设计一套套药物平平板，可可筛选出出重组子子。插入失活活应用举举例1.PBR322含含Ampr和tetr,后者含含BamHI和和SalI2个单一一限制酶酶切点，，具有Ampr和tetr表型。（（双抗））2.在tetr任何一个个酶切点点插入外外源基因因片断，，都会导导致tetr失活。3.将含含有插入入外源基基因的PBR322的细菌菌先涂布布于含Amp的的琼脂板板上，存存活者必必定是转转化子。。（Ampr）4.将存存活菌复复印在tet的的琼脂板板上，对对照2个个平板，，凡在Amp平平板上生生长而在在tet上不生生长的菌菌落，必必定是带带有外源源基因的的重组子子。五重组组体的筛筛选与鉴鉴定（一）遗遗传学方方法2.遗遗传标记记补救筛筛选A二氢叶酸酸还原酶酶（DHFR)标记基基因用于外源源基因导导入哺乳乳动物细细胞后阳阳性克隆隆的筛选选。B.αα－互补补（蓝白白菌落筛筛选或称称x－gal筛选）⒈载体Puc系系列（PUC18/19）带有E.coliDNA的的短区段段，含：：(1)Lacz(N)即编编码β－－半糖苷苷酸N端端的146个个AA信信息也称称α－多肽肽；(2)编编码区插插入一个个MCS并不破破坏阅读读框，使使少数几几个AA插入到到该酶酶的N端而不不影响其其功能；；(3)Plac可以启启动Lacz的的转录录，表达达，但受受阻pr.阻遏遏，IPTG（（异丙基基硫代ββ－半乳乳糖苷））能够去去阻遏。。⒉JM103受受体菌含含lacz(c)可以以编码ββ－半乳乳糖苷酶酶的C端部分分⒊α－互补当当载载体转入入JM103lacz(n)与lacz(c)α互互补，编编码具有有活性酶酶pr→→使底物物X-gal生生色（5溴4氯氯3吲哚哚β－半半乳糖苷苷产生兰兰菌落））。⒋当MCS插入入外源gene片断时时，几乎乎无一例例外产生生无α－互补能能力的氨氨基酸酸片段（（插入酶酶失落））导致白白菌落产产生。PUC19PlacLacZ(N)MCSJM103外源基因因片段插插入白菌落I