公开课讲课用微生物的实验室培养

公开课讲课用微生物的实验室培养第一页，共七十页，2022年，8月28日到目前为止，几十项Nobel生理学和医学奖，化学奖都与微生物学有关第二页，共七十页，2022年，8月28日微生物的类群原生生物：原核生物:真菌:病毒:如酵母菌单细胞的动植物如草履虫、单细胞藻类等无细胞结构真核细胞细菌、蓝藻原核细胞◆微生物的共同特点：个体微小、结构简单第三页，共七十页，2022年，8月28日1.细菌的形态第四页，共七十页，2022年，8月28日拟核，大型环状DNA质粒(小型环状DNA，含抗生素等抗药性和固氮的基因)其成分为肽聚糖2.细菌的结构特殊结构第五页，共七十页，2022年，8月28日细菌主要是以二分裂的方式进行增殖（如右图）3.细菌的繁殖第六页，共七十页，2022年，8月28日芽孢

有些细菌在一定的条件下，细胞里面形成一个椭圆形的休眠体，叫做芽孢。芽孢的壁很厚，对干旱、低温、高温等恶劣的环境有很强的抵抗力。（抗逆性极强）注：不是繁殖体第七页，共七十页，2022年，8月28日例如，有的细菌的芽孢，煮沸3小时以后才死亡。芽孢又小又轻，可以随风飘散。当环境适宜（如温度、水分适宜）的时候，芽孢又可以萌发，形成一个细菌.第八页，共七十页，2022年，8月28日

真菌是通过产生大量的孢子来繁殖后代的，霉菌的直立菌丝顶端生有孢子，蘑菇的菌褶处也生有孢子，孢子随风飘散，在适宜的环境条件下，能发育成一个新个体。单细胞的酵母菌还可进行出芽生殖。孢子生殖和出芽生殖都是无性生殖。

第九页，共七十页，2022年，8月28日课题1微生物的实验室培养专题2:微生物的培养与应用第十页，共七十页，2022年，8月28日培养微生物需要解决的两个问题是什么？1、为其提供合适的营养条件和环境条件2、防止杂菌的入侵培养基、培养条件无菌技术(获得纯净培养物）思考:第十一页，共七十页，2022年，8月28日1.何为培养基？3.不同的培养基有不同的配方，但是其基本成分都相同，都包括哪些营养元素？有何作用？请举例说明。阅读教材P14~15相关内容，回答以下问题：

2.按照不同的培养基划分标准，培养基有哪些种类、配制特点及其应用？一、培养基第十二页，共七十页，2022年，8月28日（一）培养基

培养基（培养液）是人们按照微生物对营养物质的不同需求，配制出供其生长繁殖的营养基质1.培养基概念

第十三页，共七十页，2022年，8月28日2.培养基的种类液体培养基半固体培养基固体培养基据物理性质分天然培养基合成培养基据化学成分分选择培养基鉴别培养基基础培养基据用途分常用于工业生产常用于观察微生物的运动、鉴定菌种用于微生物的分离、计数用化学成分不明确的天然物质配成如加入血清血浆等根据细胞生存所需要的种类和数量用人工方法模拟合成在培养基中加入（或缺少）某种化学物质，以抑制不需要的微生物的生长，促进所需要的微生物的生长。例如，在培养基中加入青霉素，以抑制细菌、放线菌的生长，从而分离到酵母菌和霉菌。又如，在培养基中加入高浓度的食盐可以抑制多种细菌的生长，但不影响金黄色葡萄球菌的生长。根据微生物的代谢特点，在培养基中加入某种指示剂或化学药品配制而成，用以鉴别不同种类的微生物。例如，在培养基中加入伊红和美蓝，可以用来鉴别饮用水和乳制品中是否存在大肠杆菌等细菌：如果有大肠杆菌，其代谢产物就与伊红和美蓝结合，使菌落呈深紫色，并带有金属光泽。含有一般微生物生长繁殖所需要的基本营养物质（牛肉膏蛋白胨培养基）第十四页，共七十页，2022年，8月28日液体培养基：表面生长均匀混浊生长沉淀生长第十五页，共七十页，2022年，8月28日半固体培养基：无动力有动力(弥散)第十六页，共七十页，2022年，8月28日固体培养基：菌落第十七页，共七十页，2022年，8月28日单个或少数菌体2.特征：大小、形状、光泽度、颜色、透明度等。3.功能：1.定义：菌落鉴定菌种的重要依据固体培养基上大量繁殖子细胞群体第十八页，共七十页，2022年，8月28日几种菌落及其形态第十九页，共七十页，2022年，8月28日几种菌落及其形态第二十页，共七十页，2022年，8月28日3.基本成分：思考：微生物“吃”什么？碳源、氮源、水、无机盐⑴碳源无机碳源：有机碳源：CO2、CO32-、HCO3-糖类等含碳有机物质

自养微生物异养微生物⑵氮源无机氮源：有机氮源：NH4＋、NO3-、N2

、NH3牛肉膏、蛋白胨、酵母膏、尿素等注：有机C源为异养型微生物提供碳源和能源含CHON的有机物是异养型微生物的碳源、氮源、能源N2（固氮微生物的唯一氮源）NH3（既是硝化细菌的氮源又是能源）硝酸盐、铵盐几乎所有微生物能利用

不同的微生物往往需要采用不同的培养基配方第二十一页，共七十页，2022年，8月28日特殊营养物质：生长因子(3)常见的生长因子：(1)概念：(2)作用：微生物生长不可缺少的微量有机物。酶和核酸的组成成分。维生素、氨基酸、嘌呤、嘧啶等。

一些天然物质如酵母膏、蛋白胨、动植物组织提取液等可为微生物提供生长因子（4）来源：第二十二页，共七十页，2022年，8月28日注意：最常用的碳源是糖类，尤其是葡萄糖最常用的氮源是铵盐、硝酸盐对异养生物而言，含C、H、O、N的化合物既是碳源，又是氮源，如蛋白质之所以补充生长因子，是由于缺少合成这些物质的酶或合成能力有限第二十三页，共七十页，2022年，8月28日此外，还需要满足微生物生长对pH、特殊营养物质（如:生长因子)以及氧气等的要求。第二十四页，共七十页，2022年，8月28日牛肉膏蛋白胨培养基是一种应用最广泛和最普通的细菌基础培养基。1000ml牛肉膏蛋白胨培养基的配方H2O定容至1000mlNacl5g蛋白胨10g牛肉膏5g琼脂20.0g分析营养构成？第二十五页，共七十页，2022年，8月28日

牛肉膏是用新鲜牛肉经过剔除脂肪、消化、过滤、浓缩而得到的一种棕黄色至棕褐色的膏状物。牛肉膏主要含有肌酸、肌酸酐、多肽类、氨基酸类、核苷酸类、有机酸类、矿物质类及维生素类的水溶性物质。此外含硫氨酸较多，而且含有更多的细菌生长需要的维生素和其它生长因子，是生物制药发酵及和种培养基制备的基础原材料。

蛋白胨是有机化合物。蛋白胨是将肉、酪素或明胶用酸或蛋白酶水解后干燥而成的外观呈淡黄色的粉剂，具有肉香的特殊气息。蛋白胨富含有机氮化合物，也含有一些维生素和糖类。它可以作为微生物培养基的主要原料，在抗生素、医药工业、发酵工业、生化制品及微生物学科研等领域中的用量均很大。第二十六页，共七十页，2022年，8月28日选择培养基加入青霉素的培养基加入高浓度食盐的培养基

不加氮源的无氮培养基不加含碳有机物的无碳培养基分离酵母菌、霉菌等真菌（抑制细菌、放线菌的生长）分离金黄色葡萄球菌分离固氮菌分离自养型微生物第二十七页，共七十页，2022年，8月28日4.配制原则

⑴目的明确：⑵营养全面、浓度适宜、比例恰当⑶适宜的pH值：有机碳源异养型：根据微生物的种类、培养目的选择原料自养型：不加碳源加入缓冲剂细菌偏碱，真菌偏酸（CO2碳源）生产科研第二十八页，共七十页，2022年，8月28日C课堂练第二十九页，共七十页，2022年，8月28日２.自养型微生物与异养型微生物的培养基的主要差别是()A．碳源B．氮源C．无机盐D．特殊营养物质A课堂练第三十页，共七十页，2022年，8月28日1.何为无菌技术？无菌技术包括哪些方面？2.什么是消毒？灭菌？两者有何区别？3.常用的消毒与灭菌的方法有哪些？有何要求？4.请说出干热灭菌法和高压蒸汽灭菌法的操作步骤。二、无菌技术阅读教材P15-P16相关内容，回答以下问题：

第三十一页，共七十页，2022年，8月28日获得纯净培养物的关键是什么？二、无菌技术防止外来杂菌污染1.目的：2.方法：消毒与灭菌消毒与灭菌的概念和区别？第三十二页，共七十页，2022年，8月28日

（１）消毒定义：利用较为温和的化学或物理方法，杀死大部份致病微生物的过程。

2.消毒与灭菌的概念及两者的区别

第三十三页，共七十页，2022年，8月28日

（2）灭菌的定义：

以强烈的化学剂或物理方法消灭所有微生物，包括所有细菌的繁殖体、芽孢、霉菌及病毒，而达到完全无菌之过程。灭菌与消毒技术是微生物有关工作中最普通也是最重要的技术。第三十四页，共七十页，2022年，8月28日1、煮沸消毒法:100℃煮沸5-6min2、巴氏消毒法：70-75℃下煮30min

或80℃下煮15min3、化学药剂消毒法:用70%酒精、新洁尔灭等进行皮肤消毒;氯气消毒水源4、紫外线消毒……(1)消毒的方法：3.常用的消毒与灭菌的方法第三十五页，共七十页，2022年，8月28日1、灼烧灭菌(2)灭菌的方法：第三十六页，共七十页，2022年，8月28日2、干热灭菌：160-170℃下加热1-2h。3、高压蒸汽灭菌：100kPa、121℃下维持15-30min.第三十七页，共七十页，2022年，8月28日

最常用的灭菌方法是高压蒸汽灭菌，它可以杀灭所有的生物，包括最耐热的某些微生物的休眠体，同时可以基本保持培养基的营养成分不被破坏。有些玻璃器皿也可采用高温干热灭菌。为了防止杂菌，特别是空气中的杂菌污染，试管及玻璃烧瓶都需采用适宜的塞子塞口，通常采用棉花塞，也可采用各种金属、塑料及硅胶帽，它们只可让空气通过，而空气中的其他微生物不能通过。培养基分装完毕以后，在管口上加一个棉塞。棉塞能防止杂菌污染，保证通气良好，加棉塞时，应使棉塞长度的2／3在试管口内，如上图所示。加棉塞第三十八页，共七十页，2022年，8月28日第三十九页，共七十页，2022年，8月28日高压蒸气灭菌的原理是（）A．高压使细菌DNA变性B．高压使细菌蛋白质凝固变性C．高温烫死细菌D．高温使细菌DNA变性B第四十页，共七十页，2022年，8月28日关于灭菌和消毒的不正确的理解是A．消毒和灭菌实质上是相同的B．灭菌是指杀死环境中的一切微生物的细胞、芽孢和孢子C．接种环用烧灼的方法灭菌D．常用灭菌方法有加热法、过滤法、红外线法、化学药品法A第四十一页，共七十页，2022年，8月28日1.无菌技术除了用来防止实验室的培养物被其他外来微生物污染外，还有什么目的？2.请你判断以下材料或用具是否需要消毒或灭菌。如果需要，请选择合适的方法。（1）培养细菌用的培养基与培养皿（2）玻棒、试管、烧瓶和吸管（3）实验操作者的双手答：无菌技术还能有效避免操作者自身被微生物感染。答：（1）、（2）需要灭菌；（3）需要消毒。旁栏思考第四十二页，共七十页，2022年，8月28日2.无菌范围：实验操作空间消毒操作者的手、衣着消毒实验用具灭菌实验操作过程二.无菌技术：防止外来杂菌的污染1.消毒与灭菌：酒精灯旁操作超净工作台第四十三页，共七十页，2022年，8月28日三、实验操作（大肠杆菌的纯化培养）（一）制备牛肉膏蛋白胨培养基（用于培养细菌）第四十四页，共七十页，2022年，8月28日1．计算、称量2．溶化3．调pH：pH7．6

4．分装：分装过程中注意不要使培养基沾在管口或瓶口上，以免沾污棉塞而引起污染。5．加塞6．包扎操作步骤第四十五页，共七十页，2022年，8月28日包器材第四十六页，共七十页，2022年，8月28日包器材第四十七页，共七十页，2022年，8月28日7．灭菌:

将装有培养基的三角锥瓶，塞上棉花塞，包上牛皮纸，再放入高压蒸气灭菌锅，在压力为100kPa、温度为121℃，灭菌15～30min。将培养皿用旧报纸包裹，放入干热灭菌箱内，在160～170℃下灭菌2h。

8．倒平板:

待培养基冷却到50℃左右时，在酒精灯附近倒平板。（倒平板操作见课本）2d后观察平板，无杂菌污染才可用来接种.9．无菌检查：

将灭菌的未接种（或者接种无菌水）的培养基放入37℃的温室中培养24—48小时，以检查灭菌是否彻底。第四十八页，共七十页，2022年，8月28日第四十九页，共七十页，2022年，8月28日（二）纯化大肠杆菌接种方法有：平板划线法和稀释涂布平板法微生物的接种技术：原理：想方设法在培养基上得到由一个细菌繁殖而来的肉眼可见的菌落，即获得较纯的菌种。第五十页，共七十页，2022年，8月28日涂布器接种环接种针第五十一页，共七十页，2022年，8月28日三.大肠杆菌的纯化培养：㈠制备牛肉膏蛋白胨固体培养基㈡纯化大肠杆菌（目的）⑴平板划线法：菌种划3个平板1个不划线1.接种：接种环防止划破培养基（重复实验）（空白对照）第五十二页，共七十页，2022年，8月28日问题讨论

1.为什么在操作的第一步以及每次划线之前都要灼烧接种环？在划线操作结束时，仍然需要灼烧接种环吗？为什么？

答：操作的第一步灼烧接种环是为了避免接种环上可能存在的微生物污染培养物；每次划线前灼烧接种环是为了杀死上次划线结束后接种环上残留的菌种，使下一次划线时，接种环上的菌种直接来源于上次划线的末端，从而通过划线次数的增加，使每次划线时菌种的数目逐渐减少，以便得到单个菌落。划线结束后灼烧接种环，能及时杀死接种环上残留的菌种，避免细菌污染环境和感染操作者。第五十三页，共七十页，2022年，8月28日2.在灼烧接种环之后，为什么要等其冷却后再进行划线？答：以免接种环温度太高，杀死菌种。3.在作第二次以及其后的划线操作时，为什么总是从上一次划线的末端开始划线？答：划线后，线条末端细菌的数目比线条起始处要少，每次从上一次划线的末端开始，能使细菌的数目随着划线次数的增加而逐步减少，最终能得到由单个细菌繁殖而来的菌落。第五十四页，共七十页，2022年，8月28日6支试管，分别加入9ml无菌水1ml1011ml1021ml1031ml1041ml1051ml106⑵稀释涂布平板法：a.梯度稀释菌液：菌液第五十五页，共七十页，2022年，8月28日第五十六页，共七十页，2022年，8月28日⑵稀释涂布平板法：a.梯度稀释菌液：b.涂布平板：不超过0.1ml各梯度分别涂布3个平板1个不涂布作空白对照滴灼冷涂稀释103倍稀释104倍稀释105倍第五十七页，共七十页，2022年，8月28日问题讨论涂布平板的所有操作都应在火焰附近进行。结合平板划线与系列稀释的无菌操作要求，想一想，第2步应如何进行无菌操作？

应从操作的各个细节保证“无菌”。例如，酒精灯与培养皿的距离要合适、吸管头不要接触任何其他物体、吸管要在酒精灯火焰周围等等。第五十八页，共七十页，2022年，8月28日⑴平板划线法：三.大肠杆菌的纯化培养：㈠制备牛肉膏蛋白胨固体培养基㈡纯化大肠杆菌：1.接种：⑵稀释涂布平板法：2.培养：将接种后的培养基和一个未接种的培养基放入37℃恒温箱中培养12h～24h后，观察并记录第五十九页，共七十页，2022年，8月28日接种方法的判断？？？第六十页，共七十页，2022年，8月28日四.菌种的保藏：1.临时保藏：试管固体斜面培养基上4℃2.长期保存：菌种易被污染、变异甘油管藏1ml甘油＋1ml菌液－20℃第六十一页，共七十页，2022年，8月28日本课题知识小结:第六十二页，共七十页，2022年，8月28日【典例解析】例:关于微生物营养物质的叙述中，正确的是()A.是碳源的物质不可能同时是氮源

B.凡碳源都提供能量

C.除水以外的无机物只提供无机盐

D.无机氮源也能提供能量解析：不同的微生物，所需营养物质有较大差别，要针对微生物的具体情况分析。对于A、B选项，它的表达是不完整的。有的碳源只能是碳源，如二氧化碳；有的碳源可同时是氮源，如NH4HCO3；有的碳源同时是能源，如葡萄糖；有的碳源同时是氮源，也是能源，如蛋白胨。对于C选项，除水以外的无机物种类繁多，功能也多样。如二氧化碳，可作为自养型微生物的碳源；NaHCO3，可作为自养型微生物的碳源和无机盐；而NaCl则只能提供无机盐。对于D选项，无机氮源提供能量的情况还是存在的，如NH3可为硝化细菌提供能量和氮源。D第六十三页，共七十页，2022年，8月28日例2：下面对发酵工程中灭菌的理解不正确的是()A.防止杂菌污染

B.消灭杂菌

C.培养基和发酵设备都必须灭菌

D.灭菌必须在接种前解析：灭菌是微生物发酵过程的一个重要环节。A说的是灭菌的目的，因为发酵所用的菌种大多是单一的纯种，整个发酵过程不能混入其他微生物（杂菌），所以是正确的；B是错误的，因为灭菌的目的是防止杂菌污染，但实际操作中不可能只消灭杂菌，而是消灭全部微生物。C是正确的，因为与发酵有关的所有设备和物质都要灭菌；发酵所用的微生物是灭菌后专门接种的，灭菌必须在接种前，如果接种后再灭菌就会把所接菌种也杀死。B第六十四页，共七十页，2022年，8月28日编号成分含量①粉状硫10g②（NH4）2SO40.4g③K2HPO44.0g④MgSO49.25g⑤FeSO40.5g⑥CaCl20.5g⑦H2O100ml例3．右表是某微生物培养基成分，请据此回答：（1）右表培养基可培养的微生物类型是

。（2）若不慎将过量NaCl加入培养基中。如不想浪费此培养基，可再加入

.（提示：金黄色葡萄球菌具耐盐性）自养型微生物

含碳有机物

第六十五页，共七十页，2022年，8月28日（3）若除去成分②，加入（CH2O），该培养基可用于培养

。（4）表中营养