免疫学技术第九讲优秀课件

免疫学技术第九讲第一页，共三十六页，2022年，8月28日免疫学技术：利用抗原、抗体特异性反应的原理建立的各种检测与分析技术，以及建立在这些技术之上的各种制备方法。一般将涉及到抗原、抗体、免疫细胞、细胞因子等相关技术都称为免疫技术。第二页，共三十六页，2022年，8月28日分类1、免疫血清学技术2、细胞免疫技术3、免疫制备技术4、分子免疫学技术第三页，共三十六页，2022年，8月28日免疫学技术的应用1、疾病诊断。2、生物活性物质的超微定量。3、物种鉴定（血清型、亚型分析等）。4、微生物检测。5、开发研制免疫增强药物、饲料添加剂、疫苗等。6、分子生物学领域。第四页，共三十六页，2022年，8月28日主要内容一免疫血清学技术二主要血清学技术三细胞免疫技术四主要细胞免疫技术专题一：免疫血清学技术第五页，共三十六页，2022年，8月28日一、免疫血清学技术1、血清学技术：简单地说指体外的抗原与抗体反应，由于抗体多来自于血清故称血清学。2、分类：（1）凝聚性反应：凝集反应；沉淀反应（2）标记抗体技术：荧光抗体，本酶标抗体，放射性标记抗体（3）补体参与的反应：补体结合反应；（4）中和反应：病毒中和试验（5）免疫转印：WestenBlotting第六页，共三十六页，2022年，8月28日一、免疫血清学技术3、特点：（1）特异性和交叉性如猪瘟病毒抗体只能与猪瘟病毒结合，说明具有特异性；牛痘病毒来预防人的天花和猪瘟疫苗预防牛的病毒性腹泻病的例子说明具有交叉性。第七页，共三十六页，2022年，8月28日一、免疫血清学技术3、特点：（2）最适比和带现象带现象指因抗原或抗体过多而出现的抑制可见反应的现象，抗体过多易出现前带反应；抗原过多易出现后带现象。第八页，共三十六页，2022年，8月28日一、免疫血清学技术3、特点：（3）反应的两阶段性第一阶段为抗原与抗体的特异性结合，反应快，几秒钟至几分钟；第二阶段为抗原与抗体的可见现象阶段。第九页，共三十六页，2022年，8月28日一、免疫血清学技术3、特点：（4）反应的可逆性抗原与抗以弱的非共价键结合，受物理化学热力学法则制约。在0-40度内，PH4-9范围易结合；如果温度超过60度或PH降至3度以下，抗原抗体复合物又可重新解离。第十页，共三十六页，2022年，8月28日一、免疫血清学技术3、特点：（5）反应的敏感性可用于定性，还可以检测极微量的抗原或抗体，其灵敏度大超过了常规的化学方法。第十一页，共三十六页，2022年，8月28日一、免疫血清学技术4、影响血清学反应的因素电解质：一般用NaCl作稀释液；标记抗体常用PBS磷酸盐缓冲溶液。温度：一般较高温度可增加抗原与抗接触的机会，超过60度易解离。酸碱度：PH6-8较合适。第十二页，共三十六页，2022年，8月28日二、主要血清学技术（一）凝集反应1、概念：颗粒性抗原（如细菌、红细胞）与相应抗体，在电解质存在下，发生凝集的反应。2、分类：直接凝集反应、间接凝集反应、反向间接凝集反应、协同凝集反应等。3、用途：如血型鉴定、牛布病检测、鸡白痢诊断等。第十三页，共三十六页，2022年，8月28日第十四页，共三十六页，2022年，8月28日二、主要血清学技术（二）沉淀反应1、概念：可溶性抗原（细菌外毒素、内毒素，菌体、裂解液、血清、组织浸出液）与相应抗体，在电解质存在下，发生凝集的反应。2、分类：单向琼脂扩散、双向琼脂扩散、对流免疫电泳、火箭电泳等。3、用途：如炭疽、小鹅瘟诊断等。第十五页，共三十六页，2022年，8月28日AscoliAgAb对流免疫电泳第十六页，共三十六页，2022年，8月28日第十七页，共三十六页，2022年，8月28日二、主要血清学技术（三）免疫标记技术1、概述：抗原与抗体能特异性结合，但抗体抗原分子小，含量低时，形成的复合物是不可见的。如果将超微量的物质标记（荧光素、酶、放射性同位素）就可检测出微量的抗原与抗体复合物，其特异性与敏感性远远超过常规血清学方法，被广泛用于病原微生物鉴定，传染病诊断及基因表达产物分析等。第十八页，共三十六页，2022年，8月28日二、主要血清学技术（三）免疫标记技术2、分类：（1）免疫荧光技术（2）免疫酶技术（3）放射免疫测定法（4）免疫印迹法（5）免疫金标技术（6）免疫PCR第十九页，共三十六页，2022年，8月28日第二十页，共三十六页，2022年，8月28日小鼠脾脏免疫荧光图像第二十一页，共三十六页，2022年，8月28日免疫酶技术第二十二页，共三十六页，2022年，8月28日3、免疫酶技术（1）原理：通过化学方法将酶与抗体或抗抗体结合，形成酶标记物，这些酶标记物仍保持免疫学活性和酶的活性，然后将它与相应的抗体或抗原起反应，形成酶标记的抗原-抗体复合物，结合在免疫复合物上的酶在遇到相应的底物时，而显色。第二十三页，共三十六页，2022年，8月28日3、免疫酶技术（2）分类：免疫酶组化法免疫酶测定法酶标记抗体法抗酶抗体法液相测定法固相测定法间接法双抗体夹心法竞争法免疫酶技术第二十四页，共三十六页，2022年，8月28日3、免疫酶技术（3）特点：灵敏度高，检测能力可达毫微克水平。应用范围广，既能测抗体又能检测抗原，既能定性又能定量、定位及抗原分析。标本可长期保存。酶标记物有效时间较长，一般低温保存可达一年以上。不需要特殊设备。第二十五页，共三十六页，2022年，8月28日（4）操作过程：第二十六页，共三十六页，2022年，8月28日二、主要血清学技术（四）补体结合技术第二十七页，共三十六页，2022年，8月28日专题二：细胞免疫技术1、概述：细胞免疫检测主要包括T细胞及亚群的计数、T细胞活性测定、各种淋巴因子的检测、K细胞、NK细胞活性试验，以及皮肤过敏试验等。2、用途：（1）测定疾病个体的细胞免疫状态及水平；（2）筛选免疫增强剂或免疫抑制药物；（3）测定淋巴因子活性等第二十八页，共三十六页，2022年，8月28日细胞免疫技术3、分类：E花环试验淋巴细胞转化试验白细胞移动抑制试验白细胞介素测定酸性α醋酸萘酯酶测定第二十九页，共三十六页，2022年，8月28日主要细胞免疫技术（一）E玫瑰花环试验1、原理：人、猪、牛、羊等的T细胞膜上的CD2是绵羊红细胞受体，马、猪的T细胞膜上的CD2是豚鼠红细胞的受体。2、用途：区分T淋巴细胞第三十页，共三十六页，2022年，8月28日主要细胞免疫技术（二）淋巴细胞转化试验1、原理：PHA+T细胞（有PHA受体）转化大的淋巴母细胞

显微镜观察计算转化率转化率=(过渡型细胞+母细胞)/200个淋巴细胞×100%2、用途：淋巴细胞计数，监测免疫机能3、特点：简便、准确性差形态学法第三十一页，共三十六页，2022年，8月28日第三十二页，共三十六页，2022年，8月28日3H胸腺嘧啶核苷（3H-T）掺入法原理：试验管对照管

PHA+T细胞+3H-TdRPHA+T细胞转化转化淋巴母细胞淋巴母细胞（掺入3H-TdR）（无3H-TdR掺入）

液体闪烁仪测掺入测CPM

3H-T的脉冲数CPM

计算转化刺激指数SI=试验管CPM/对照管CPM特点：准确，需昂贵的闪烁仪第三十三页，共三十六页，2022年，8月28日原理：PHA、ConA+T细胞（受体）

转化分裂、增殖

脱氢酶

甲氮唑盐（MTT）

甲簪（formazan）

酶标仪（595nm）测OD值特点：敏感、准确MTT比色法第三十四页，共三十六页，2022年，8月28日主要细胞免疫技术（三）酸性α醋酸萘酯酶测定1、原理：T淋巴细胞浆内含有的酸性α醋酸萘酯酶，在弱酸性条件下，能使底物酸性α醋酸萘酯水解成醋酸和α萘酚，后者与六偶氮副品红偶联，生成不溶性