免疫比浊分析

免疫比浊分析第一页，共四十三页，2022年，8月28日免疫比浊分析是将液相内的沉淀反应与现代光学仪器和自动分析技术相结合的一项分析技术。第二页，共四十三页，2022年，8月28日第二节自动化免疫比浊分析第一节免疫比浊的原理一、透射免疫比浊法二、散射免疫比浊法三、免疫胶乳比浊法四、免疫比浊分析的影响因素和临床应用第三页，共四十三页，2022年，8月28日第一节免疫浊度分析原理

抗原、抗体在特定的电解质溶液中反应，形成小分子免疫复合物（<19S），在增浊剂（如PEG、NaF等）的作用下，迅速形成免疫复合物微粒（>19S），使反应液出现浊度。这种浊度可用仪器检测，用吸光度表示。第四页，共四十三页，2022年，8月28日第一节免疫浊度分析原理

在抗体稍微过量且固定的情况下，形成的免疫复合物量随抗原量的增加而增加，反应液的浊度亦随之增大，即待测抗原量与反应溶液的浊度呈正相关。

第五页，共四十三页，2022年，8月28日免疫比浊技术分类：透射免疫比浊法（turbidimetricimmunoassay）散射免疫比浊法（nephelometryimmunoassay）速率散射比浊法终点散射比浊法第六页，共四十三页，2022年，8月28日第七页，共四十三页，2022年，8月28日一定波长的入射光线通过抗原抗体反应后的溶液时，由于溶液中的免疫复合物微粒对光线的吸收、反射和折射而使透射光减少，可用吸光度表示。在一定范围内，吸光度与免疫复合物量呈正相关，而形成的免疫复合物量与参与反应的抗原和抗体的量呈函数关系。一、免疫透射比浊法（一）原理：第八页，共四十三页，2022年，8月28日抗原抗体反应曲线第九页，共四十三页，2022年，8月28日1.将待检标本和抗原参考品作适当稀释。（二）操作方法2.将待测标本和标准抗原溶液（5个浓度抗原标准品）与适当过量的抗血清混合，在一定条件下，抗原抗体反应完成后，在340nm处测定各管吸光度。

3.按log-logit转换或y=ax3+bx2+cx+d方程进行曲线拟合，制备剂量-反应曲线，由计算机处理，计算出抗原浓度。第十页，共四十三页，2022年，8月28日待测的抗原抗体复合物分子量足够大。抗原抗体复合物数量足够多。具有充分的反应时间，只能测定抗原抗体反应的第二阶段。高亲和力的抗体，并保证抗体过量。（三）技术要求

第十一页，共四十三页，2022年，8月28日（四）方法评价

优点:灵敏度高，稳定性好，操作简便，结果准确

不足:

①抗体用量较大；②溶液中存在的抗原－抗体复合物分子应足够大③透射比浊测定在抗原－抗体反应的第二阶段，检测需在抗原抗体反应达到平衡后进行，耗时较长。

第十二页，共四十三页，2022年，8月28日粒子对光线的散射作用是溶液中的微粒子受到光线照射后，微粒子对光线产生反射和折射而形成散射光。悬浮微粒对光散射形成的散射光强度与微粒的大小、数量、入射光的波长和强度、测量角度等因素密切相关。二、免疫散射比浊法(一)原理第十三页，共四十三页，2022年，8月28日不同大小的微粒形成的散射光分布不同。当微粒直径小于入射光的波长的十分之一时，散射光的强度在各个方向的分布均匀一致，称Rayleighae散射。当微粒直径大于或等于入射光的波长时，前向散射光远远强于后向散射光，称Mile散射。第十四页，共四十三页，2022年，8月28日第十五页，共四十三页，2022年，8月28日其中光线偏转的角度与发射光的波长和抗原抗体复合物的大小和多少密切相关。当固定检测角度与发射光的波长时，散射光的强度与复合物的含量成正比，即待测的抗原越多，形成的复合物越多，散射光就越强。第十六页，共四十三页，2022年，8月28日

应选择适当的光源强度、反应时间、测量角度及光源的波长。另外，要注意保证抗原浓度合适。此外，还要选择适宜的离子强度、pH值等。(二)技术要求第十七页，共四十三页，2022年，8月28日速率散射比浊法是抗原抗体结合反应的一种动态测定方法。所谓速率是指抗原抗体反应在单位时间内形成免疫复合物的量（不是免疫复合物累积的量），连续测定各时间复合物形成的速率与其产生的散射光信号联系在一起，形成动态的速率散射比浊法，每项检测仅1～2min即可完成。

(三)速率散射比浊法（ratenephelometry）第十八页，共四十三页，2022年，8月28日累计时间复合物产生总量产生速率510152025303540455055608132560150230300360415450480500—512359080706055453020

抗原抗体复合物形成时间与速率的关系第十九页，共四十三页，2022年，8月28日当抗体的浓度固定于一定范围时，复合物形成的速率峰值的高低与抗原的含量成正比，随着时间的延长，免疫复合物的量逐渐增多，抗原抗体结合速度的峰值在一定的时间出现。通过微机处理即可得到待测蛋白成份的含量。第二十页，共四十三页，2022年，8月28日第二十一页，共四十三页，2022年，8月28日

速率散射比浊法峰值出现的时间与抗体浓度及纯度直接相关，需选用抗体纯度及亲和力交高的试剂。此外，要保证待测样本血清的性状符合要求，如严重脂血等即为不合格样本。技术要求第二十二页，共四十三页，2022年，8月28日(三)方法评价散射比浊法是目前临床应用较多的一种方法，本法自动化程度高，具有快速、灵敏、准确、精密等优点。采用抗原过量检测方法，保证了结果的准确性。但仪器和试剂价格比较贵,对抗体的质量要求很高。第二十三页，共四十三页，2022年，8月28日用抗体致敏的大小适中、均匀一致的胶乳颗粒（一般为0.2μm），在遇到相应抗原时，胶乳颗粒上的抗体与抗原特异结合，引起胶乳颗粒凝聚

，使透射光和散射光即出现显著变化。三、免疫胶乳比浊法（一）原理：第二十四页，共四十三页，2022年，8月28日三、免疫胶乳比浊法（一）原理：第二十五页，共四十三页，2022年，8月28日第二节自动化免疫比浊分析第二十六页，共四十三页，2022年，8月28日（一）BN特种蛋白分析测定系统该系统的测定方法是透射免疫比浊法的一种改良。以发光二极管作为光源，检测前向角13～24度的散射光，然后利用硅化光电二极管接收散射光信号，经过微电脑处理，与标准曲线进行比较，最后转换成待检物质的浓度。一、主流免疫比浊设备概况1.测定原理第二十七页，共四十三页，2022年，8月28日系统由分析仪、计算机、条码读取器、打印机四部分组成，其中分析仪是主要组成部分，包括散射测浊仪、自动加样系统、运输装置和比色杯装置。

2.仪器基本组成第二十八页，共四十三页，2022年，8月28日BNⅡ、BN100特种蛋白分析分析系统第二十九页，共四十三页，2022年，8月28日本系统属于速率散射比浊分析法，在抗体过量的前提下，光束通过抗原抗体复合物时所产生的散射光速率变化大小与抗原浓度成正比。速率的峰值通过电脑处理系统转换成待测抗原的浓度。1.测定原理（二）ARRAY分析系统第三十页，共四十三页，2022年，8月28日ARRAY系统由分析仪、电脑处理系统、打印机构成，其主要构成部分为分析仪，由加液系统、散射测浊仪、40孔样本转盘、20孔试剂转盘、软盘驱动器等组成。2.仪器基本组成第三十一页，共四十三页，2022年，8月28日Array360、IMMAGE特种蛋白分析分析系统第三十二页，共四十三页，2022年，8月28日二、免疫比浊分析的主要影响因素1．抗原抗体比例抗原抗体比例要适当。2．抗体的纯度与效价诊断试剂应尽可能选择高纯度与高效价的抗体。3．免疫复合物的大小及稳定性溶液中免疫复合物颗粒的分散度尽可能相同，颗粒应该不容易相互聚集。第三十三页，共四十三页，2022年，8月28日4．增聚剂利用增聚剂破坏抗原抗体的水化层，促进反应的进行。5.离子强度PBS是较好的反应液。返回章目录第三十四页，共四十三页，2022年，8月28日抗原过量检测

(1)抗体适当过量

(2)对抗原过量进行阈值限定第三十五页，共四十三页，2022年，8月28日第三十六页，共四十三页，2022年，8月28日

免疫比浊分析法主要用于特定蛋白系列检测。如免疫球蛋白IgG、IgA、IgM、κ链、λ链、免疫球蛋白亚类；补体C3、C4；血浆蛋白如前白蛋白(PAB)、白蛋白(ALB)、α1-抗胰蛋白酶(α1-AT)、β2-微球蛋白(β2-MG)、转铁蛋白(TRF)、铜蓝蛋白(CER)、结合珠蛋白(HP)、，C-反应蛋白(CRP)、载脂蛋白ApoAI、ApoB、脂蛋白(a)、类风湿因子(RF)、尿微量蛋白系列和某些治疗性药物浓度等。

三、临床应用第三十七页，共四十三页，2022年，8月28日小结

经典的免疫沉淀反应通常是在抗原抗体反应的终点进行结果判断，存在操作繁琐、费时、敏感度低及难以自动化等缺陷。自动化免疫比浊分析仪器的问世解决了以上的诸多问题。第三十八页，共四十三页，2022年，8月28日目前，透射免疫比浊法和散射免疫比浊等方法已常规运用于临床特定体液蛋白质的检测，相关仪器已广泛应用于国内各级医院，成为临床免疫检测的重要手段之一。返回章目录第三十九页，共四十三页，2022年，8月28日思考题

1.名词解释：透射免疫比浊法、散射免疫比浊法2.免疫比浊分析的基本原理是什么？有哪些类型？3.简述免疫比浊分析的主要影响因素。第四十页，共四十三页，2022年，8月28日一、选择题1.速率散射比浊法之所以能比传统的沉淀反应试验大大地缩短时间，主要是因为A.在抗原抗体反应的第一阶段判定结果B.不需复杂的仪器设备C.使用低浓度的琼脂或琼脂糖D.反应的敏感度高第四十一页，共四十三页，2022年，8月28日2.透射免疫比浊法A.测定光线通过反应混合液时，被其中IC反射的光的强度B.测定光线通过反应混合液时，被其中IC折射的光的强度C.测定光线通过反应混合液时，被其中IC吸收的光的强度D.测定光线通过反应混合液时，透过的光的强度3.散射免疫比浊法检测的原理A.测定光线通过反应混合液时，被其中IC反射的光的强度B.测定光线通过反应混合液时，被其中IC折射的光的强度C.测定光线通过反应混合液时，被其中IC吸收的光的强度D.测定光线通过反应混合液时，透过的光的强度第四十二页，共四十三页，2