免疫组织化学

免疫组织化学第一页，共六十页，2022年，8月28日1.1概念

免疫组织化学（immunohistochemistry）:

将化学反应中呈色反应与免疫学抗原抗体反应结合起来，用标记的特异性抗体（或抗原）对细胞及组织内抗原（或抗体）的分布进行组织或细胞内原位检测的一门技术。第一节概述

第二页，共六十页，2022年，8月28日1.2与组织化学的关系

从广义上理解：免疫组织化学为组织化学的分支。不同点：

组织化学的局限性：只能识别细胞或组织中核酸、蛋白质、酶、多糖、脂肪等，对免疫活化的大分子不能特异识别；方法上繁锁，不易掌握。第三页，共六十页，2022年，8月28日

免疫组化的优点：能识别细胞或组织中蛋白质、脂、多糖类及小分子肽类。只要理论上具有抗原性，可以制备出相应抗体，就可以示踪定位，因此其待检物质广泛；方法上“一通百通”。1.3免疫组化在生物学中的应用

第四页，共六十页，2022年，8月28日第二节

免疫组织化学的理论基础

第五页，共六十页，2022年，8月28日2.1抗原2.1.1定义抗原(antigen，Ag)是一类在合适条件下，能刺激机体免疫系统发生免疫应答，并能与免疫应答产生的效应物质（包括抗体和效应细胞）在体内和（或）体外发生特异性结合反应的物质，它具有免疫原性和反应原性。第六页，共六十页，2022年，8月28日免疫原性指的是它能刺激机体免疫系统产生免疫应答；反应原性指的是它能与抗体或致敏淋巴细胞特异性地结合而发生反应。第七页，共六十页，2022年，8月28日2.1.2分类

完全抗原:兼有免疫原性和反应原性的物质称完全抗原。大多数蛋白质是良好的完全抗原。

半抗原:只有反应原性而无免疫原性的物质称半抗原或不完全抗原，绝大多数低分子量的多糖和所有的类脂均属半抗原。第八页，共六十页，2022年，8月28日2.1.3抗原的特异性抗原具有与相应抗体或致敏淋巴细胞发生反应的特异性。这是由抗原分子表面具有化学活性的基团—抗原决定簇的性质、数目和空间构型决定的。抗原决定簇能被免疫活性细胞所识别，能与相应抗体的可变区结合。

第九页，共六十页，2022年，8月28日2.1.4抗原的异物性

抗原化学结构必须与宿主自身物质的化学结构相异。

①异种物质。如鸭血清蛋白对于兔为强抗原，对于鸡则为弱抗原。②同种异体物质。如人类的ABO血型的抗原物质；③自身抗原。如被血——睾屏障所严密封闭的精子所含的物质。

第十页，共六十页，2022年，8月28日2.2抗体

2.2.1定义抗体(antibody)是机体在抗原物质刺激后，通过体液免疫应答，由浆细胞合成并分泌的仅与该抗原发生特异性地结合的球蛋白，称免疫球蛋白(immunoglobulin,Ig)，存在于血液、淋巴液和组织液中。第十一页，共六十页，2022年，8月28日2.2.2结构抗体的基本结构由四条肽链对称排列组成，即两条相同的重链和两条相同的轻链。可变区与稳定区第十二页，共六十页，2022年，8月28日第十三页，共六十页，2022年，8月28日

抗原与抗体的结合具有高度特异性，抗体结合抗原的不同特异性，取决于轻链和重链的可变区氨基酸的种类和顺序的不同。2.2.3特异性第十四页，共六十页，2022年，8月28日2.2.4抗体的分类目前，根据制备的原理和方法可分为多克隆抗体、单克隆抗体及基因工程抗体三类。

第十五页，共六十页，2022年，8月28日

多克隆抗体（第一代抗体）

将一种天然抗原经各种途径免疫动物，由于抗原性物质具有多种决定簇，故可刺激产生多种抗体形成细胞克隆，合成和分泌抗各种决定簇的抗体分泌到血清中，故在其血清中实际上是含多种抗体的混合物，称这种用体内免疫法所获得的免疫血清为多克隆抗体（多数抗血清系由家兔制得）。第十六页，共六十页，2022年，8月28日

单克隆抗体（第二代抗体）

由识别一种抗原决定簇的细胞克隆所产生的均一性抗体，称为单克隆抗体，具有特异性强、纯度高的特点。应用杂交瘤技术可获得几乎所有抗原的单克隆抗体（多数单克隆抗体由小鼠制备）。第十七页，共六十页，2022年，8月28日

基因工程抗体（第三代抗体）

将对基因结构与功能的了解与DNA重组技术相结合，根据研究者的意图在基因水平对分子进行切割、拼接或修饰，甚至是人工全合成后导入受体细胞表达，产生新型抗体。第十八页，共六十页，2022年，8月28日第三节

免疫组化染色方法及原理

第十九页，共六十页，2022年，8月28日3.1.1标记抗体法（荧光素标抗体法或酶标抗体法。1941年Coons建立了荧光素标记肺炎双球菌粘多糖抗体。60年代Nakane建立了酶标记抗体技术第二十页，共六十页，2022年，8月28日3.1.1.1直接标记法

直接用荧光素或辣根过氧化物酶标记特异性抗体，与组织切片中相关抗原结合，用荧光/普通显微镜识别荧光所在的部位或酶显色的部位，以确定抗原所在的部位。该方法简单，但购买标记特异性抗体较困难，目前已经较少使用。

第二十一页，共六十页，2022年，8月28日第二十二页，共六十页，2022年，8月28日直接标记法第二十三页，共六十页，2022年，8月28日3.1.1.2间接标记法

将未标记的特异抗体（第一抗体）与组织中抗原相结合，为了观察其结合部位，用荧光素或HRP标记第二抗体即标记在抗第一抗体的免疫球蛋白上再与第一抗体结合，如第一抗体为兔血清，第二抗体必须为其他动物抗兔的免疫球蛋白抗体。第二十四页，共六十页，2022年，8月28日

间接标记法第二十五页，共六十页，2022年，8月28日优点：只要不同的第一抗体均来自同一种属，同标记的第二抗体结合就能用来显示其不同特异性抗原的存在，这样可避免了直接法中标记每一种第一抗体的麻烦，并且提高了方法的敏感度。缺点：酶与抗体间的共价连结可损害部分抗体和酶的活性、抗血清中的非特异性抗体被酶标记后，与组织成分结合，可致背景染色等。第二十六页，共六十页，2022年，8月28日第二十七页，共六十页，2022年，8月28日第二十八页，共六十页，2022年，8月28日3.1.2非标记抗体酶法70年代Sternberger改良并建立了辣根过氧化物酶---抗过氧化物酶复合物法（PAP）技术。

第二十九页，共六十页，2022年，8月28日

辣根过氧化物酶（HRP）是从辣根中提取的，分子量为40000，等电点3～9，最适PH为5，它的底物是3，3ˊ-二氨基联苯胺（DAB），HRP使DAB氧化形成棕黄色产物，可在光镜和电镜下观察。

HRPDAB+H2O2棕黄色产物第三十页，共六十页，2022年，8月28日PAP法基本原理:

第三十一页，共六十页，2022年，8月28日3.1.3亲和免疫细胞化学技术卵白素（Avidin）:又称抗生物素、亲和素，具有4个与生物素亲和力极强的结合点。链霉亲和素（streptavidin）是一种从链霉菌培养物中提取的蛋白质，和亲和素一样，也有4个生物素结合位点。生物素（Biotin）:维生素H，是一种小分子的维生素。第三十二页，共六十页，2022年，8月28日抗生物素具有4个与生物素亲和力极强的结合点，这种亲和力较抗原抗体的亲和力高100万倍，而且不影响彼此的生物学活性，同时生物素与抗生物素都具有与其他示踪物质如荧光素、铁蛋白和HRP相结合能力，由此建立了抗生物素－生物素免疫染色系统，包括抗生物素－生物素－过氧化酶复合物技术（ABC）及链霉亲合素—生物素－过氧化酶（或碱性磷酸酶）合复技术（SABC）。第三十三页，共六十页，2022年，8月28日3.1.3.1ABC法：亲合素-生物素-过氧化物酶复合物法

第三十四页，共六十页，2022年，8月28日3.1.3.2BRAB法：桥连抗生物素－生物素法：第三十五页，共六十页，2022年，8月28日3.1.3.3LSAB法：

标记链霉抗生物素－生物素法，又称链霉亲合素酶结合法（strepavidinperoxidaseconjgatedmethod,S-P法）,即采用生物素标记的第二抗体与链霉抗生物素蛋白连接的过氧化物酶来测定细胞和组织中的抗原。第三十六页，共六十页，2022年，8月28日第三十七页，共六十页，2022年，8月28日第四节

免疫组织化学的基本技术（1）

第三十八页，共六十页，2022年，8月28日4.1组织材料的处理

固定液的选择及固定的时间长短对实验结果有很大的影响。一般采用10%中性福尔马林液（石蜡切片）和丙酮（冰冻切片）固定。组织材料的处理是获得良好免疫组化结果的前提，必须保证要检测的细胞或组织取材新鲜，固定及时，形态保存完好，抗原物质的抗原性不丢失，不扩散和不被破坏。第三十九页，共六十页，2022年，8月28日4.2切片前的准备工作

4.2.1载玻片、盖玻片处理

清洁液浸泡24小时后依次自来水、双蒸馏水洗，95%酒精浸泡2小时，擦拭干净。防脱片处理：将干燥、干净的玻片放入多聚赖氨酸溶液中浸泡5分钟，60℃烤箱烘烤一小时或室温过夜干燥备用。第四十页，共六十页，2022年，8月28日4.2.2常用试剂配制

0.05%-0.1%胰蛋白酶取0.05g或0.1g胰蛋白酶加入到100ml0.05%或0.1%PH7.8的无水氯化钙水溶液中，溶解即可。4%胃蛋白酶取4g胃蛋白酶加入到100ml0.1mol/LHCL即可。第四十一页，共六十页，2022年，8月28日0.01mol/LPH6.0柠檬酸缓冲液取柠檬酸三钠(C6H5Na3O7.2H2O)10g、柠檬酸（C6H8O7.2H2O）1.5g，加双蒸馏水至1000ml即可。10%中性福尔马林固定液

40%甲醛与0.01mol/LPH7.4PBS按1：9配制。DAB（3，3-二氮联苯胺）染色液取DAB2.5mg充分溶解于5mlPBS后过滤，使用前加入3%H2O215μl即可。第四十二页，共六十页，2022年，8月28日0.01mol/LPH7.4磷酸盐缓冲液(PBS)

原液:

A液:0.2mol/LNa2HPO4.12H2O取72g加双蒸馏水至1000ml即可。

B液:0.2mol/LNaH2PO4.2H2O取15.6g加双蒸馏水至500ml即可。工作液：取A液415ml、B液85ml、NaCL85g加双蒸馏水至10000ml,用0.1N的NaOH调PH值至7.4即可。第四十三页，共六十页，2022年，8月28日4.2.3石蜡切片免疫组化染色步骤(S-P法)

石蜡切片脱蜡至水。3%H2O2室温孵育5～10分钟，以消除内源性过氧化物酶的活性。蒸馏水冲洗，PBS浸泡5分钟，（如需采用抗原修复，可在此步后进行）。5～10%正常山羊血清（PBS稀释）封闭，室温孵育10分钟。倾去血清，勿洗，滴加适当比例稀释的一抗或一抗工作液，37℃孵育1~～2小时或4℃过夜。

第四十四页，共六十页，2022年，8月28日PBS冲洗，5分钟×3次。滴加适当比例稀释的生物素标记二抗或二抗工作液，37℃孵育10~30分钟；

PBS冲洗，5分钟×3次。滴加适当比例稀释的辣根酶标记链霉卵白素或工作液，37℃孵育10~30分钟；PBS冲洗，5分钟×3次。显色剂显色（DAB）。自来水充分冲洗，复染，封片。第四十五页，共六十页，2022年，8月28日4.2.4冰冻切片免疫组化染色步骤

冰冻切片4～8μm，室温放置30分钟后，入4℃丙酮固定10分钟，PBS洗，5分钟×3次。用3%过氧化氢孵育5～10分钟，消除内源性过氧化物酶的活性。PBS洗，5分钟×2次。下接免疫组化染色操作步骤。第四十六页，共六十页，2022年，8月28日4.2.5抗原修复

4.2.5.1蛋白酶消化

胰蛋白酶：一般使用浓度为0.05%～0.1%，消化时间为37℃、10～40分钟，主要用于细胞内抗原的显示。胃蛋白酶：一般使用浓度为0.4%，消化时间为37℃、30～180分钟，主要用于细胞间质抗原的显示。第四十七页，共六十页，2022年，8月28日4.2.5.2抗原热修复可根据实验室的具有条件，选用微波炉抗原修复、高压锅抗原修复或水浴高温抗原。第四十八页，共六十页，2022年，8月28日

石蜡切片微波炉抗原修复：切片脱蜡至水后，3%H2O2处理10分钟，蒸馏水洗2分钟×3。将切片放入盛有柠檬酸缓冲液的容器中，置微波炉内加热使容器内液体温度保持在92℃～98℃之间并持续10～15分钟。取出容器，室温冷却10～20分钟（注意：不可将切片从缓冲液中取出冷却，以便使蛋白能够恢复原有的空间构型）。PBS洗，下接免疫组化染色步骤。第四十九页，共六十页，2022年，8月28日第五节

免疫组织化学的基本技术（2）

第五十页，共六十页，2022年，8月28日5.1免疫组化结果的判断

免疫组化的呈色深浅可反映抗原存在的数量，可作为定性、定位和定量的依据。

第五十一页，共六十页，2022年，8月28日5.1.1阳性反应的染色特征

阳性反应染色分布有四种类型：细胞间质、胞浆、细胞核、细胞膜表面。

阳性细胞分布呈灶性和弥漫性。由于细胞内含抗原量不同，所以染色强度不一。如果细胞之间染色强度相同，常提示其反应为非特异性。阳性细胞染色定位于单个细胞，且与阴性细胞相互交杂分布；而非特异性染色常不限于单个细胞，而是累及一片细胞。切片边缘、刀痕或皱褶区域，坏死或挤压的细胞区，常表现为相同的阳性染色强度，不能用于判断阳性。第五十二页，共六十页，2022年，8月28日5.1.2假阳性及其处理

所用的抗体与其它无关的抗原有交叉反应，特异性差，特别是使用多克隆抗血清时较易出现；组织细胞内含有DAB沉淀相类似的色素。假过氧化物酶活性：组织中存在红细胞时，即不加过氧化物酶，也可出现阳性结果。第五十三页，共六十页，2022年，8月28日内源性过氧化物酶活性：过氧化物酶体等存在过氧化物酶，能够与H2O2

～DAB反应，导致假阳性。游离醛基：用小分子赖氨酸、白蛋白等预先孵育切片，可封闭之。疏水键和离子键：用