第7章蛋白质分离纯化

第三章氨基酸掌握：氨基酸的分类、酸碱化学及化学反应熟悉:氨基酸的分子组成了解：氨基酸的光学活性、光谱性质及分离纯化第四章蛋白质的共价结构（一）掌握：肽的结构及其与功能的关系（二）熟悉：蛋白质的分子组成、分类（三）了解：蛋白质的氨基酸序列与生物功能第五章蛋白质的三维结构（一）掌握：蛋白质的二、三、四级结构及其与功能的关系（二）熟悉：稳定蛋白质三维结构的作用力第六章蛋白质结构与功能的关系（一）掌握：肌红蛋白与血红蛋白结构与功能的关系（二）熟悉：血红蛋白分子病的生化原理第七章蛋白质的分离纯化和表征（一）掌握：蛋白质的分离和纯化方法（二）熟悉：蛋白质的分子组成、理化性质（三）了解：蛋白质的分离和纯化的评价第七章蛋白质分离、纯化和表征蛋白质的理化性质与分离纯化ThePhysicalandChemicalCharactersandSeparationandPurificationofProtein蛋白质结构和功能整体的生物化学描述来自于对于许多个别蛋白质的研究。为了详细地研究一个蛋白质,必须将其从细胞中存在的所有其它蛋白质中分离出来,还必须有一些可用的技术来测定其特征。蛋白质性质

pI(Isoelectricpoint)等电点Colloid(胶体)Precipitation(沉淀)Denaturation(变性)Ultravioletlightabsorption(紫外吸收)Colourreaction(颜色反应)（一）蛋白质的两性电离蛋白质分子除两端的氨基和羧基可解离外，氨基酸残基侧链中某些基团，在一定的溶液pH条件下都可解离成带负电荷或正电荷的基团。*蛋白质的等电点(isoelectricpoint,pI)当蛋白质溶液处于某一pH时，蛋白质解离成正、负离子的趋势相等，即成为兼性离子，净电荷为零，此时溶液的pH称为蛋白质的等电点。一、理化性质

凡碱性氨基酸含量较多的蛋白质，等电点就偏碱性，如组蛋白、精蛋白等。反之，凡酸性氨基酸含量较多的蛋白质，等电点就偏酸性，人体体液中许多蛋白质的等电点在pH5.0左右，所以在体液中以负离子形式存在。

ProteinProperties:pI

(Isoelectricpoint)氨基酸的等电点为其特征值。而对蛋白质来说,只有在无其它盐类存在的条件下测得的所谓“等离子点”对每种蛋白质才是特征值。

中性盐（Ca2+、Mg2+、Cl-、HPO42-）影响滴定曲线形状和等电点。等电点测定:溶解度法和聚焦电泳法等电聚焦分离蛋白质的过程蛋白质分子具有两性解离及等电点的特征，在碱性区域蛋白质分子带负电荷向阳极移动，当移动至某一pH位点时失去电荷而停止移动，此处介质的pH恰好等于该蛋白质分子pI。同理，位于酸性区域的蛋白质分子带正电荷向阴极移动，直到它们的等电点上聚焦为止，就不再泳动，而被浓缩成狭窄的区带。等电聚焦过程+–pH3pH7.5pH10+–pH3pH7.5pH10+–pH3pH7.5pH10+–pH3pH7.5pH10＋－1098765432pHpI＝8.0蛋白质pI＝4.0蛋白质等电聚焦电泳分离蛋白质等电聚焦电泳法测定蛋白质pI二、

蛋白质的大小与形状测分子量的方法：★化学组成法测定最低分子量★SDS法★凝胶过滤法★渗透压法★扩散系数法★沉降系数法和沉降平衡法第二节蛋白质分子的大小与形状一、根据化学组成测定最低相对分子质量：假定某种微量成分只有一个，测出其百分含量后，可用比例式算出最低相对分子质量。若测出两种微量成分的百分含量，分别用比例式算出的最低相对分子质量不相同时，可计算两个最低相对分子质量近似的最小公倍数。例题：一种纯酶含亮氨酸（Mr131）1.65%，含异亮氨酸（Mr131）2.48%，求最低相对分子质量。解：按照Leu的百分含量计算，最低MrX1：X1=(100×131)/1.65=7939.4。按照Ile的百分含量计算最低MrX2：X2=(100×131)/2.48=5282.3。由于X1和X2数字差异较大，提示这种酶含Leu和Ile不止1个，为了估算Leu和Ile的个数，首先计算：X1/X2=7939.4/5282.3≈1.5。这种酶含任何氨基酸的个数均应是整数，说明该酶至少含有2个Leu，3个Ile，其最低相对分子质量为：7939.4×2=15878.8或5282.3×3=15846.9。四、凝胶过滤法测定相对分子质量

当含有各种组分的样品流经凝胶层析柱时，大分子物质由于分子直径大，不易进入凝胶颗粒的微孔，沿凝胶颗粒的间隙以较快的速度流过凝胶柱。而小分子物质能够进入凝胶颗粒的微孔中，向下移动的速度较慢，从而使样品中各组分按相对分子质量从大到小的顺序先后流出层析柱，而达到分离的目的。

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SDS是阴离子表面活性剂，与蛋白质结合形成SDS-蛋白复合物，蛋白质分子即带大量的负电荷，并远远超过原来所带的电荷，使天然蛋白质分子之间的电荷差别降低，甚至可以忽略。同时蛋白质在SDS作用下结构变得松散，形状趋向一致基本原理（电荷效应）SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS)三、蛋白质的胶体性质与蛋白质的沉淀（一）蛋白质的胶体性质大小在1-100nm范围内；同种电荷互相排斥；质点外围有水化层。（二）蛋白质的沉淀

1.盐析法

2.有机溶剂沉淀法

3.重金属盐沉淀法

4.生物碱试剂和某些酸类沉淀法

5.加热变性沉淀法蛋白质属于生物大分子之一，分子量可自1万至100万之巨，其分子的直径可达1～100nm，为胶粒范围之内。*蛋白质胶体稳定的因素颗粒表面电荷水化膜蛋白质的高分子性质+++++++带正电荷的蛋白质－－－－－－－－带负电荷的蛋白质在等电点的蛋白质水化膜++++++++带正电荷的蛋白质－－－－－－－－带负电荷的蛋白质不稳定的蛋白质颗粒酸碱酸碱酸碱脱水作用脱水作用脱水作用溶液中蛋白质的聚沉*蛋白质沉淀在一定条件下，蛋白疏水侧链暴露在外，肽链融会相互缠绕继而聚集，因而从溶液中析出。变性的蛋白质易于沉淀，有时蛋白质发生沉淀，但并不变性。*蛋白质的凝固作用(proteincoagulation)蛋白质变性后的絮状物加热可变成比较坚固的凝块，此凝块不易再溶于强酸和强碱中。

1.盐析(saltprecipitation)

在蛋白质溶液中加入大量中性盐使蛋白质从溶液中析出的现象。盐析法不引起蛋白质的变性。常用如硫酸铵、硫酸钠或氯化钠等。原理：蛋白质表面电荷被中和水化膜被破坏（三）蛋白质的沉淀蛋白质的盐溶和盐析

定义：一般在低盐浓度的情况下，蛋白质的溶解度随盐浓度的升高而增加，这种现象称为盐溶。原理：盐浓度增高到一定数值后，水活性降低，水化膜相继被破坏，最终引起蛋白质分子间相互聚集并从溶液中析出。

有机溶剂具有脱水剂功能，使蛋白质的水化膜脱去。如乙醇、丙酮；（等电点、低温、短时间条件）常用于实验室蛋白质的提取。丙酮沉淀时，必须在0～4℃低温下进行，丙酮用量一般10倍于蛋白质溶液体积。蛋白质被丙酮沉淀后，应立即分离。除了丙酮以外，也可用乙醇沉淀。2.有机溶剂法3.重金属盐法重金属离子带正电荷与蛋白质结合生成不溶性的沉淀。(醋酸铅)蛋白质与重金属结合成盐共沉淀，蛋白质变性，用于除蛋白。蛋白质带负离子临床：蛋白质制剂＋催吐剂4.生物碱试剂法某些酸：鞣酸、苦味酸、乌酸、三氯醋酸等能与带正电荷的蛋白质结合产生不溶性的沉淀。蛋白质变性，无蛋白滤液的制备。由于蛋白质分子中含有共轭双键的酪氨酸和色氨酸，因此在280nm波长处有特征性吸收峰。蛋白质的OD280与其浓度呈正比关系，因此可作蛋白质定量测定。（四）蛋白质的紫外吸收⒈茚三酮反应(ninhydrinreaction)

蛋白质经水解后产生的氨基酸也可发生茚三酮反应。⒉双缩脲反应(biuretreaction)蛋白质和多肽分子中肽键在稀碱溶液中与硫酸铜共热，呈现紫色或红色，此反应称为双缩脲反应，双缩脲反应可用来检测蛋白质水解程度。（五）蛋白质的呈色反应考马斯亮蓝反应

G－250染料在酸性条件下和蛋白质结合形成蓝色物质，波长由465nm变成595nm。可进行定量检测。蛋白质分离纯化的一般原则

一、前处理要选择合适的材料;合适的破碎方法;合适的提取液。二、粗分级分离要方法简便，处理量大。常用盐析、等电点沉淀和有机溶剂分级分离等方法，有时可用超过滤或凝胶过滤等方法。三、细分级分离主要使用各种层析、电泳，方法要精心选择，巧妙配合。后期可用结晶法。①在水和各种有机溶剂中的溶解性。②在不同温度、pH值和各种缓冲液中生物大分子的稳定性。③各种物理性质：如分子的大小、穿膜的能力、带电的情况、在电场中的行为、离心沉降的表现、在各种凝胶、树脂等填料中的分配系数。首要了解生物大分子的理化性质：④固态时对温度、含水量和冻干时的稳定性。⑤其他化学性质：如对各种蛋白酶、水解酶的稳定性和对各种化学试剂的稳定性。⑥对其他生物分子的特殊亲和力。目前纯化蛋白质等生物大分子的关键技术是电泳、层析和离心三大技术。（一）透析及超滤法*透析(dialysis)利用透析袋把大分子蛋白质与小分子化合物分开的方法。*超滤法

应用正压或离心力使蛋白质溶液透过有一定截留分子量的超滤膜，达到浓缩蛋白质溶液的目的。半透膜阻留pr分子，而让小的溶质分子和水通过，以达到除去蛋白质溶液中小分子（盐、低分子酸等）。施以一定的压力使小分子溶质通过一半透膜，而按半透膜的筛孔大小截留相应的蛋白质分子（二）根据蛋白质溶解度的差异进行分离等电点沉淀盐析、有机溶剂沉淀*超速离心法(ultracentrifugation)既可以用来分离纯化蛋白质也可以用作测定蛋白质的分子量。

*蛋白质在离心场中的行为用沉降系数(sedimentationcoefficient,S)表示,沉降系数与蛋白质的密度和形状相关。超速离心因为沉降系数S大体上和分子量成正比关系，故可应用超速离心法测定蛋白质分子量，但对分子形状的高度不对称的大多数纤维状蛋白质不适用。沉降的速度与颗粒的重量、密度和形状有关。离心后按其沉降的速度不同，彼此分开形成区带。再进行光学定位，针刺或冰冻切片采样分析。层析(chromatography)分离蛋白质的原理待分离蛋白质溶液（流动相）经过一个固态物质（固定相）时，根据溶液中待分离的蛋白质颗粒大小、电荷多少及亲和力等，使待分离的蛋白质组分在两相中反复分配，并以不同速度流经固定相而达到分离蛋白质的目的。（四）层析蛋白质分离常用的层析方法*离子交换层析：利用各蛋白质的电荷量及性质不同进行分离。*凝胶过滤(gelfiltration)又称分子筛层析，利用各蛋白质分子大小不同分离。目录目录蛋白质在高于或低于其pI的溶液中为带电的颗粒，在电场中能向正极或负极移动。这种通过蛋白质在电场中泳动而达到分离各种蛋白质的技术,称为电泳(elctrophoresis)

。根据支撑物的不同，可分为薄膜电泳、凝胶电泳等。

（二）电泳几种重要的蛋白质电泳*SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳，常用于蛋白质分子量的测定。*等电聚焦电泳，通过蛋白质等电点的差异而分离蛋白质的电泳方法。*双向凝胶电泳是蛋白质组学研究的重要技术。1.凝胶过滤分离蛋白质是基于各种蛋白质的（）A.不同的电荷状态B.不同的分子量C.不同的溶解度D.不同的亲和性E．分配系数.SDS分离蛋白质是基于各种蛋白质的（）A．不同的分子量B.不同的亲和性C.不同的溶解度D.不同的荷电状态E.以上都不是5.蛋白质变性不涉及（）A.分子形状的改变B.溶解度的改变C.生物学功能的改变D.肽键的断裂E.磷酸二酯键的断裂1.蛋白质是由哪些元素组成的？其基本结构单元是什么？写出其结构通式。

2.蛋白质中有哪些常见的氨基