中性粒细胞与骨骼肌损伤修复

中性粒细胞与骨骼肌损伤修复刘宇;陈佩杰;肖卫华【摘要】骨骼肌急性损伤是运动医学领域最为常见的损伤之一.有关修复机制的研究其重点已经不再局限于肌卫星细胞本身，免疫系统在骨骼肌急性损伤和随后肌肉修复阶段起着至关重要的作用.对骨骼肌急性损伤修复过程中中性粒细胞的潜在功能以及与免疫机制相关的骨骼肌损伤模型进行归纳总结，加深理解骨骼肌损伤后的免疫机制，为寻找适合骨骼肌损伤治疗方法提供一定理论依据.【期刊名称】《沈阳体育学院学报》【年(卷)，期】2014(033)003【总页数】5页(P92-95,135)【关键词】中性粒细胞滑骼肌;急性损伤;实验模型【作者】刘宇;陈佩杰;肖卫华【作者单位】上海体育学院运动科学学院，上海200438;沈阳体育学院运动人体科学学院，辽宁沈阳110102;上海体育学院运动科学学院，上海200438;上海体育学院运动科学学院，上海200438【正文语种】中文【中图分类】G804.5骨骼肌急性损伤尤其是机械性损伤，是运动医学领域最常见的损伤之一，发生频率从10%~50%不等［1］。目前，建立动物骨骼肌损伤模型模拟人类损伤，用于骨骼肌伤后修复再生机制的研究，主要集中在损伤程度、受损肌群、急性骨骼肌损伤的组织学形态评估和炎性肌病的诊断，采用各种治疗方法加速恢复过程和促炎过程。而有关修复机制的研究已经不仅仅局限于肌卫星细胞本身，免疫系统在骨骼肌损伤修复中的重要作用正被逐步认识，但对于具体免疫细胞，尤其是中性粒细胞在骨骼肌急性损伤中所介导的炎症反应机制仍处于探索阶段。因此，理解骨骼肌急性损伤后的固有潜在机制和肌肉修复过程中性粒细胞的作用就显得尤为重要。本综述对骨骼肌急性损伤修复阶段中性粒细胞的作用以及骨骼肌损伤模型进行总结，探究适用于骨骼肌损伤免疫机制研究的可重复动物模型，加深骨骼肌损伤后的免疫机制研究，为寻找适合骨骼肌损伤治疗方法提供一定理论依据。1骨骼肌损伤修复过程与免疫反应不论肌肉损伤机制如何，骨骼肌损伤后修复反应过程基本可分为3个阶段:破坏、修复和重建［2］。“破坏阶段”的典型特点是肌肉超微结构和周围血管的广泛破坏，导致肌肉内血肿形成。由于血管的特征性破坏，随着受损肌纤维细胞的变性、坏死，促炎症免疫反应频繁出现。在骨骼肌损伤的免疫组化和超微结构的研究中发现，原发损伤从受损肌纤维保留的基底膜处开始出现未受抑制的坏死组织的蔓延，距离1~2mm,伤后1~2h薄膜结构的〃封闭带”形成隔离坏死组织和非坏死组织。破坏阶段后，“修复阶段”由许多过程组成，包括炎症细胞浸润、吞噬受损组织，肌卫星细胞增殖与分化，横纹肌再生，结缔组织瘢痕形成和毛细血管再建。最后〃重建阶段”，肌卫星细胞增殖形成新的肌管细胞发育成肌纤维，肌肉新生完成，功能重建和降低受损面积。骨骼肌受损的这3个过程紧密相连并有重叠的时相，要将三者明确划分开来难度很大。免疫系统与骨骼肌之间的相互作用在骨骼肌损伤和随后的肌肉修复中起着至关重要的作用。骨骼肌损伤修复的关键在于炎症细胞（中性粒细胞、巨噬细胞、淋巴细胞等）和修复细胞（成纤维细胞、表皮细胞、内皮细胞等）的激活、释放和发挥生物学功能。骨骼肌损伤初期，毛细血管破裂，损伤部位释放的炎症因子向夕卜周血的炎症细胞提供趋化信息，趋化物质多为肽、蛋白质、蛋白质碎片。这些物质以浓度梯度诱导血液中的炎性细胞和修复细胞因子直接进入受损部位。炎症反应程度依赖于两个因素，即机体实际损伤程度和受损时肌肉血管的损伤程度。这些因素或许是相互联系的，损伤程度越重，受损部位便会出现越严重的血管损伤，导致一个较严重的炎症反应。然而，这却不影响固有免疫细胞或者非免疫细胞在炎症反应中的作用。另夕卜众所周知的细胞因子（TNF-a,IL-邛，IL-6）参与了整个炎症反应，但是每一个因子的具体作用还未明了。轻微挫伤后，骨骼肌脉管系统不会破裂。因此，损伤部位内部的小动脉膨胀，受损部位血流增加。这种局部血管扩张可能通过以下两种机制被诱导。一种机制是受损部位出现肥大细胞释放组织胺引起。另一种是本地组织胺释放通过扩大毛细血管内皮孔径，增大受损部位毛细血管的通透性，结果增加受损部位内部和周围的中性粒细胞数量和血浆蛋白水平，二者都是重要的炎性反应。血管舒张的另一个机制是〃血管内皮生长因子一NO”旁路。血管内皮生长因子可能是当机体受到缺氧、氧化应激、生长因子和细胞因子作用时由成纤维细胞、内皮细胞或者单核细胞/巨噬细胞分泌的，能够激活一氧化氮和一氧化氮合成酶途径，促进血管舒张。严重损伤即刻，比如血管严重破裂，"损伤控制”过程开始启动。粘附于胶原蛋白上的血小板被暴露激活，开始释放促炎症反应调节物质，比如5-羟色胺（5-HT）、组织胺和血栓素A2（TxA2）等刺激骨骼肌迅速生产大量成熟中性粒细胞释放入血[8]，随后移动到受损部位，促进局部炎症反应的启动。目前研究显示，中性粒细胞在骨骼肌损伤修复阶段中具有双重作用，以不同的方式和机制参与骨骼肌损伤修复过程。2骨骼肌损伤修复过程与中性粒细胞2.1骨骼肌急性损伤后中性粒细胞的迁移机制骨骼肌损伤后，外周循环和血液中的中性粒细胞通过滚动、粘附和迁移经由血管内皮入侵到受损组织中。中性粒细胞穿越血管内皮实际上是中性粒细胞和内皮细胞表面一系列黏附分子及其配体之间相互作用的过程。1）循环免疫细胞沿着内皮组织滚动，当免疫细胞表面的硫酸肝素蛋白多糖（HSPGs）与内皮细胞相互作用时，免疫细胞运动减慢。2）各种细胞因子与粘附分子的相互作用快速触发整合素介导中性粒细胞依赖性粘附到血管内皮［3］。3）中性粒细胞经内皮游出血管壁，到达骨骼肌，在受损骨骼肌肌内膜和肌浆中高度表达。绝大多数的循环免疫细胞（淋巴细胞、单核细胞、嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞和自然杀伤细胞）都能够表达细胞粘附因子一整合素a4pi，整合素a4pi可促进循环免疫细胞与血管细胞粘附分子-1（VCAM-1）结合从而快速粘附到活化的内皮细胞。但是中性粒细胞不表达整合素a4^1而特异性表达整合素&2,整合素P2可促进细胞间黏附分子（ICAMs）与中性粒细胞表面CD18结合，随后牢固粘附于血管内皮。研究显示，受损后的骨骼肌细胞也可表达ICAM-1［4］，因此，可能存在这样的机制，中性粒细胞也可采用跨内皮迁移的方式完成在骨骼肌组织的外渗过程。而这—途径需要事先通过刺激物如补体成分、细胞因子和可溶性蛋白（比如纤维蛋白原和凝血因子X）激活ICAMs后方可进行。目前，对于外渗过程进行了大量深入的研究，发现固有巨噬细胞、内皮细胞、肌细胞本身以及循环免疫细胞参与外渗过程，但是在早期阶段这些细胞因子从何而来还不得而知。2.2骨骼肌损伤修复阶段中性粒细胞的促进作用骨骼肌钝挫伤后中性粒细胞第一时间迅速出现于受损部位，伤后1h便可在损伤部位检测到中性粒细胞，并且几小时内浓度急剧攀升，24~48h之内达到高峰，然后水平开始下降，但功能和数量依然高于基本水平，持续到大约伤后5d，随后逐渐恢复到伤前水平［5］。中性粒细胞对骨骼肌伤后修复的促进作用主要表现在两个方面:一是入侵到受损部位发挥吞噬作用清除病变坏死组织碎片，二是释放促炎症因子(IL-6、TNF-a等)扩大炎症反应［6］。许多学者提出假设:由中性粒细胞调控的吞噬作用有助于肌肉组织再生。中性粒细胞吞噬率较低品系的小鼠在肌肉损伤后显示出较低的再生能力。关于肌肉损伤和皮肤伤口愈合的研究显示，吞噬力差的老年动物在炎症反应早期，中性粒细胞呈现低水平表达且与伤口延迟愈合显著相关，同样肌肉再生能力也较差［7］。另外，胫骨前肌冻伤后，静脉滴注脂质体包被的氯磷酸盐使吞噬细胞凋亡的小鼠呈现低浓度肌肉炎症反应，坏死组织碎片面积扩大、清除时间延长和肌肉再生能力受损［8］。—些间接的证据也表明中性粒细胞能够促进肌肉再生，降低先天免疫系统中中性粒细胞的数量，可抑制早期阶段促炎细胞因子的分泌并延长肌肉受损后的修复过程。中性粒细胞的另一个积极作用表现在通过释放其他骨髓细胞促进肌肉组织的再生，比如巨噬细胞，其直接参与调控肌肉修复和再生［9］。实验诱导小鼠中性粒细胞凋亡，可减少35%巨噬细胞入侵到受损骨骼肌组织，从而影响肌卫星细胞的增殖和分化，延缓组织修复［10］。中性粒细胞对损伤的激活反应是高度结构化的，由呼吸爆发产生，释放高浓度自由基通过吞噬作用有针对性的吞噬细胞碎片。中性粒细胞同时可通过释放蛋白酶以降低组织碎片和细胞外基质(ECM)［11］。尽管中性粒细胞在骨骼肌损伤早期炎症反应阶段发挥重要的作用，但在清除坏死组织碎片的同时释放一些蛋白酶衍生物比如自由基、炎性介质以及促炎症细胞因子等，可能会含有潜在的细胞毒性，使中性粒细胞与内皮细胞相互作用逐级放大，激活体内发生广泛的炎症波及健康组织，引发二次损伤。但这种损伤的发生过程还具有一定的争议。2.3骨骼肌损伤修复阶段中性粒细胞介导的〃二次损伤”二次损伤的病理生理学变化是由原发性损伤所导致的。虽然二次损伤程度取决于原发性损伤的严重程度，但二者并非完全依赖关系。在骨骼肌损伤修复过程，一方面，中性粒细胞发挥吞噬作用。正常情况下，中性粒细胞分泌的酸性水解酶、蛋白酶等在溶酶体膜内进行消化吞噬物质，但是在组织受损等特殊情况下，溶酶体膜发生破裂，膜内消化酶渗出到细胞质中，使整个细胞被酶水解、消化甚至坏死。另一方面，骨骼肌损伤后中性粒细胞在吞噬组织碎片的同时释放大量自由基，具有一定的潜在毒性，诱发二次损伤。在家兔胫骨前肌牵拉伤模型的研究中发现，采用抗CD11b抗体抑制中性粒细胞呼吸爆发可以减少炎症因子的释放，降低肌纤维损伤［12］。早有报道在机体发生二次损伤时中性粒细胞处于高浓度表达［13］，表明它可能参与二次损伤过程。然而，到目前为止，中性粒细胞在损伤过程中的直接作用还未得到明确一致证实。一项关于离心运动诱发骨骼肌损伤的实验研究显示，中性粒细胞并未参与骨骼肌损伤的形成［14］。这可能与诱发骨骼肌机械性损伤的方式、诱导损伤的工具、受损肌群的选择和肌肉收缩类型有关，因此选择标准一致的损伤模型来进行免疫系统和骨骼肌急性损伤修复的研究就显得尤为重要。3骨骼肌急性损伤模型骨骼肌急性损伤是运动医学领域最常见的损伤之一，而骨骼肌机械性损伤是骨骼肌急性损伤的最常见类型，主要分为拉伤、撕裂伤和挫伤［15］。为进一步研究骨骼肌损伤机制和肌肉再生以及相应的治疗方法，建立动物骨骼肌损伤模型以复制人类损伤。目前已能较完善地模拟和建立各种骨骼肌损伤方式的动物模型。3.1牵拉伤动物模型肌肉主动收缩或被动牵拉超过肌肉本身所能承受的弹性范围，即可引起肌肉拉伤。在体育运动中，牵拉伤多见于周期性耐力运动项目，因反复牵拉使主动肌群和被动肌群协调出现障碍导致肌纤维损伤，多见于骨骼肌离心时相。故运动性骨骼肌牵拉损伤动物模型多采用跑台下坡跑方式［16-17］。Armstrong等［18］采用-16°跑台、16m/min的速度、持续90min下坡跑、复制骨骼肌牵拉模型。除了肌肉主动强烈收缩外，RamosL等［19］采用在体形式被动牵拉骨骼肌诱导于长隆、曲绵域等［20］采用专门设计的兔足牵拉器，使兔踝关节被动牵拉屈伸6480/d,共2~4周。在兔的胫骨前肌及腓肠肌复制出典型的慢性骨骼肌损伤模型拉伤模型。有学者采用离心运动（例如下坡跑）和向心运动（例如上坡跑）导致肌肉收缩而损伤，建立骨骼肌拉伤模型，主要用于运动性骨骼肌微损伤（exercise-inducedskeletalmusclemicro-damage,EIMD）的研究。3.2撕裂伤动物模型骨骼肌撕裂伤是运动中各种因素作用导致肌纤维部分或者完全断裂的损伤，伤情较重，治愈周期较长，多形成瘢痕愈合。研究中多采用外科手术锐性切割伤模拟骨骼肌撕裂伤模型［21］，主要用于伤后瘢痕形成和治疗的研究。3.3钝挫伤动物模型骨骼肌挫伤模型是机械诱导最常使用的动物模型，是组织受到快速而强有力的直接或间接压缩力所致的，一般为钝性非穿透性的物体直接打击肌腹导致毛细血管破裂、浸润性出血、水肿和炎症等，最终形成典型的肌肉内血肿［22］。通常发生在有身体接触的对抗性项目，如足球、篮球、摔跤等。这种类型损伤的症状多样，一般常见疼痛、肿胀、压痛或痉挛，触之发硬，关节活动受限，严重者不能进行正常运动。有学者采用挤压伤模型，这是一种开放性损伤，用外科手术暴露肌腹直接碾碎。加拿大学者AhmedGhaly等［23］将F344/BN雄性杂交大鼠用异氟烷气体麻醉，切开胫骨前肌覆盖皮肤，将胫骨前肌从趾长伸肌上钝性剥离，暴露肌腹，用特制钳夹装置作用于肌腹。该装置能够释放200g力，持续作用20s，建立胫骨前肌碾压伤模型。然而这种模型的损伤过程不能完全兼容人类骨骼肌挫伤的发生状况。因为人骨骼肌挫伤是在急性、强大压缩力的作用下发生，是一种闭合性的损伤而非侵入开放性创伤。在这种挫伤损伤模型中，外科手术会导致皮肤和与骨骼肌相邻的组织器官损伤，而使细胞因子水平增加。这种增加并不是完全由骨骼肌挫伤而来的，从而影响实验结果。另外，尽管有很多研究采用该模型模拟人骨骼肌挫伤，但主要是用来复制人类非常严重的损伤，比如挤压综合征和横纹肌溶解症的相关研究。在骨骼肌急性损伤修复相关机制研究中，大多数学者采用骨骼肌急性钝挫伤模型。方法是动物用2.5%戊巴比妥钠腹腔注射麻醉后，用一钢珠自装置顶端沿导管从不同高度下落垂直打击所需受损肌肉（腓肠肌、胫前肌）制作骨骼肌急性钝挫伤模型。这一高能量撞击可引起受损骨骼肌红细胞渗出、水肿、肌纤维断裂，引起急性炎症反应，随后骨骼肌再生。3.4与免疫机制有关的骨骼肌损伤模型的使用根据上述所列模型，目前有关骨骼肌伤后免疫机制研究的确切模型还未有一致认识。归纳文献，骨骼肌急性钝挫伤模型使用较多，相对而言较适合。尽管大多数的研究显示骨骼肌挫伤后的炎症反应过程与其他类型骨骼肌损伤相似，但是，以牵拉伤动物模型为例，一方面牵拉力主要集中在肌肉远端，肌肉与肌腱的结合处，随后才转移到骨骼肌，同时肌肉本身产生的反向牵拉力很容易导致肌肉断裂，因此损伤的标准化程度难以掌握;另一方面，牵拉伤并不仅仅累及单一关节肌肉，而是涉及到多关节肌肉，从腓肠肌到股四头肌甚至跨越髋关节，这就涉及肌肉长度和收缩方式的改变［24］，这对骨骼肌损伤后免疫细胞的激活机制研究存在偏差。另外，骨骼肌急性挫伤模型可以同时研究受损肌肉和周围血管组织，而其他模型并不多见，说明它是一个合适的用于骨骼肌急性损伤后相关免疫机制研究的模型，该模型的另一个好处是容易标准化。目前，虽已建立兔子牵拉伤在体实验的标准化模型，但并不能排除肌腱的损伤。一方面肌腱类型的不同能够增大受累肌肉损伤程度的变异性，另一方面肌腱本身损伤也增加了结果的复杂性。体撕裂伤模型存在皮肤的损伤，而众所周知角质层细胞也能够分泌促炎因子，这一模型也增加了骨骼肌急性损伤后免疫机制研究的复杂性。因此，建立一种简单可重复的并能复制不同损伤程度的在体骨骼肌损伤模型进行免疫系统与肌肉相关研究显得尤为重要。4小结骨骼肌具有强大的再生能力。当遭受牵拉、撕裂、钝挫伤等急性损伤后，肌肉都能成功再生，恢复其正常结构和功能。尽管已知免疫系统在骨骼肌损伤修复中起关键性作用，但是对骨骼肌机械性损伤的免疫元素，尤其是中性粒细胞很少进行深入细致研究。中性粒细胞在骨骼肌伤后修复作用可能是通过吞噬作用和分泌炎性因子介导，但或许会诱发骨骼肌二次损伤的形成。由于骨骼肌复杂的损伤程度和愈合过程，目前有关骨骼肌损伤的治疗方法虽有一定效果，但存在很大局限性。因此本综述对骨骼肌急性损伤修复过程中中性粒细胞的潜在功能以及与免疫机制相关的骨骼肌损伤模型进行归纳总结，探究适用于骨骼肌损伤免疫机制研究的可重复动物模型（例如骨骼肌急性钝挫伤模型），为骨骼肌损伤机制的深入研究提供保证，尤其是骨骼肌急性损伤后的免疫机制研究。参考文献：【相关文献】[1]EkstrandJ,HagglundM,WaldenM.Epidemiologyofmuscleinjuriesinprofessionalfootball(soccer)[J].AmJSportsMed,2011,39(6):1226-1232.[2]JarvinenTA,JarvinenM,KalimoH.Regenerationofinjuredskeletalmuscleaftertheinjury[J].MusclesLigamentsTendons,2014,24,3(4):337-345.[3]LuoBH,CarmanCV,SpringerTA.Slatcturalbasisofintegrinregulationandsignaling[J].AnnuRevImmunol,2007,25:619-647.[4]DearthCL,GohQ,MarinoJS,etal.SkeletalmusclecellsexpressICAM-1aftermuscleoverloadandICAM-1contributestotheensuinghypertrophicresponse[J].PLoSOne,2013,8(3):58486.[5]TidballJG,VillaltaSA.Regulatoryinteractionsbetweenmuscleandtheimmunesystemduringmuscleregeneration[J].AmJPhysiolRegulIntegrCompPhysiol,2010,298(5):1173-1187.[6]TidballJG.Inflammatoryprocessesinmuscleinjuryandrepair[J].AmJPhysiolRegulIntegrCompPhysiol,2005,288(2):R345-53.[7]EbaidH.Neutrophildepletionintheearlyinflammatoryphasedelayedcutaneouswoundhealinginolderrats:improvementsduetotheuseofun-denaturedcamelwheyprotein[J].DiagnPathol.2014,9(1):46.[8]SummanM,WarrenGL,MercerRR,etal.Macrophagesandskeletalmuscleregeneration:aclodronate-containingliposomedepletionstudy[J].AmericanJournalofPhysiology-Regulatory,IntegrativeandComparativePhysiology,2006,290(6):1488-1495.[9]CarosioS,BerardinelliMG,AucelloM,etal.Impactofageingonmusclecellregeneration[J].AgeingResearchReviews,2011,10(1):35-42.[10]DumontN,BouchardP,FrenetteJ.Neutrophil-inducedskeletalmuscledamage:acalculatedandcontrolledresponsefollowinghindlimbunloadingandreloading[J].AmericanJournalofPhysiology-Regulatory,IntegrativeandComparativePhysiology,2008,295(6):1831-1838.[11]MannCJ,PerdigueroE,KharrazY,etal.Aberrantrepairandfibrosisdevelopmentinskeletalmuscle[J].SkeletMuscle,2011,1(1):21-31.[12]ToumiH,F’guyerS,BestTM.Theroleofneutrophilsininjuryandrepairfollowingmusclestretch[J].JournalofAnatomy,2006,208(4):459-470.[13]HurmeT,KalimoH,LehtoM,etal.Healingofskeletalmuscleinjury:anultrastructuralandimmunohistochemicalstudy[J].MedicineandScienceinSportsandExercise,1991,23(7):801-810.[14]PaulsenG1,EgnerI,RaastadT.InflammatorymarkersCD11b,CD16,CD66b,CD68,myeloperoxidaseandneutrophilelastaseineccentricexercisedhumanskeletalmuscles[J].HistochemCellBiol,2013,139(5):691-715.[15]SouzaJ,GottfriedC.Muscleinjury:Reviewofexperimentalmodels[J].JournalofElectromyographyandKinesiology,2013,23(6):1253-1260.[16]WangR,UrsoML,ZambraskiEJ,etal.AdenosineA3receptorstimulationinducesprotectionofskeletalmusclefromeccentricexercise-mediatedinjury[J].AmericanJournalofPhysiology-Regulatory,IntegrativeandComparativePhysiology,2010,299(1):259.[17]ParkJK,KiMR,LeeEM,etal.LosartanImprovesAdiposeTissue-DerivedStemCellNichebyInhibitingTransformingGrowthFactor-0andFibrosisinSkeletalMuscleInjury[J].CellTransplantation,2012,21(11):2407-2424.[18]ArmstrongRB,OgilvieRW,SchwaneJA.Eccentricexerciseinducedinju